Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

מבט כלפי חוץ: בידוד של Cyanobacterial שוחרר פולימרים פחמימות וחלבונים

Published: May 27, 2019 doi: 10.3791/59590
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,4
1Bioengineering and Synthetic Microbiology Group, Instituto de Investigação e Inovação em Saude, Universidade do Porto, 2Instituto de Biologia Celular e Molecular, Universidade do Porto, 3Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, 4Departamento de Biologia, Faculdade de Ciências, Universidade do Porto

Summary

כאן, פרוטוקולים עבור בידוד של cyanobacterial שוחרר פולימרים פחמימות ובידוד של exoproteomes שלהם מתוארים. שני ההליכים לגלם שלבים מרכזיים כדי להשיג פולימרים או חלבונים עם דרגות טוהר גבוהה, כי ניתן להשתמש לניתוח נוסף או יישומים. הם יכולים גם להיות מותאמים בקלות בהתאם לצרכים ספציפיים של המשתמש.

Abstract

כחוליות יכול להפריש באופן פעיל מגוון רחב של biomolecules לתוך הסביבה החילוץ, כגון הפשפשים וחלבונים. ההזדהות והאפיון של biomolecules אלה יכולים לשפר את הידע על משעולים הפרשה שלהם ולעזור לתמרן אותם. יתרה מזאת, חלק מbiomolecules הללו מעניינים גם במונחים של יישומים ביו-טכנולוגיים. המתואר כאן הם שני פרוטוקולים עבור בידוד קל ומהיר של cyanobacterial שוחרר פולימרים פחמימות וחלבונים. השיטה לבידוד של פולימרים שפורסמו מבוססת על טכניקות משקעים קונבנציונליים של פוליסכרידים בפתרונות מימית באמצעות ממיסים אורגניים. שיטה זו משמרת את מאפייני הפולימר ובמקביל נמנעת מנוכחותם של מזהמים מפסולת התא וממדיום תרבותי. בסופו של התהליך, פולימר ליאופהיזה מוכן לשמש או מאופיין או יכול להיות נתון לסיבובים נוספים של טיהור, בהתאם לשימוש סופי מיועד. בנוגע לבידוד של cyanobacterial exoproteome, הטכניקה מבוססת על ריכוז של מדיום ללא תא לאחר הסרת המזהמים העיקריים על ידי צנטריפוגה וסינון. אסטרטגיה זו מאפשרת בידוד אמין של חלבונים המגיעים לתחומי החילוץ באמצעות מובילי הממברנה או שלפוחיות הקרום החיצוני. חלבונים אלה יכולים להיות מזוהים לאחר מכן באמצעות טכניקות המסה סטנדרטי ספקטרומטריה. הפרוטוקולים המוצגים כאן ניתן להחיל לא רק על מגוון רחב של כחוליות, אלא גם על זנים חיידקיים אחרים. יתר על כן, הליכים אלה יכולים להיות מותאמים בקלות על פי השימוש הסופי של המוצרים, תואר הטוהר הנדרש, והזן חיידקי.

Introduction

כחוליות מוכרות באופן נרחב כמקורות פורה של מוצרים טבעיים עם יישומים מבטיחים ביו-טכנולוגיים/ביו-רפואיים. לכן, הבנת מנגנוני הפרשה cyanobacterial ואופטימיזציה של שיטות החילוץ/שחזור חיוניים כדי ליישם cyanחיידקים יעילים מפעלים תאים מיקרוביאלית.

זנים cyanobacterial רבים מסוגלים לייצר חומרים פולימריים מסחטות (EPS), שנוצרו בעיקר על ידי הפשפשים, כי להישאר משויך משטח התא או משתחררים לתוך המדיום1. אלה פולימרים פחמימות שפורסמו יש תכונות נפרדות לעומת אלה של חיידקים אחרים, אשר להפוך אותם מתאימים עבור מגוון רחב של יישומים (למשל, נוגדנים2, מגירוי חיסוני3, נוגד חמצון4, מתכת-הכלפת5, אמולסיה6, וסוכני משלוח הסמים7,8). מתודולוגיה לבידוד של פולימרים אלה תורמת בעיקר לא רק כדי לשפר את התשואה אלא גם להגדיל את הטוהר ואת התכונות הפיזיות הספציפיות של הפולימר השיג9. רוב עצום של שיטות אלה לבידוד של פולימרים להסתמך על אסטרטגיות משקעים מתוך מדיום התרבות כי הם מושגת בקלות בשל הטבע האנייוני חזק של הפולימר9,10. בנוסף, הסרת ממיסים המשמשים בשלב המשקעים יכולה להיות מושגת במהירות על ידי אידוי ו/או ליזוליזציה. בהתאם ליישום מיוצג, שלבים שונים יכולים להיות ביחד או לאחר או לפני משקעים פולימריים על מנת להתאים את המוצר הסופי, הכוללים חומצת חומץ triכלור (TCA) טיפול, סינון, או כרומטוגרפיה הדרה (SEC) הטור טיהור10.

כחוליות מסוגלות גם להפריש מגוון רחב של חלבונים באמצעות מסלולים התלויים בטרנספורטי קרום (קלאסי)11 או בתיווך על ידי שלפוחיות (לא קלאסית)12. לכן, ניתוח של cyanexoproteome terial מהווה כלי חיוני, הן כדי להבין/לתמרן הפרשת חלבון cyanobacterial מנגנונים ולהבין את הפונקציה החילוץ ספציפיים של חלבונים אלה. הבידוד האמין והניתוח של הexoproteomes דורשים את הריכוז של הסביבה המועטה, שכן השפע של החלבונים מופרש נמוך יחסית. בנוסף, צעדים פיזיים או כימיים אחרים (למשל, צנטריפוגה, סינון או משקעים בחלבון) עשויים למטב את איכות הexoproteome המתקבלת, להעשיר את תוכן החלבון13, ולהימנע מנוכחות מזהמים (למשל, פיגמנטים, פחמימות, וכו') מיכל בן 14 , 15 או שליטה מראש של חלבונים תאיים בדגימות. עם זאת, חלק מהשלבים הללו עשויים גם להגביל את ערכת החלבונים שניתן לאתרם, המובילה לניתוח מוטה.

עבודה זו מתארת פרוטוקולים יעילים לבידוד של פולימרים משוחררים של פחמימות וexoproteomes מתוך מדיה של התרבות הקיאנקטריה. פרוטוקולים אלה ניתן להתאים בקלות את המטרות הספציפיות של המחקר ואת צורכי המשתמש, תוך שמירה על הצעדים הבסיסיים המוצגים כאן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. בידוד פולימר משוחרר פחמימות

  1. בידוד פולימרי והסרת מזהמים
    1. לטפח את המתח cyanobacterial תחת תנאים סטנדרטיים [למשל, 30 ° צ' תחת אור 12 h (50 μE m-2-1)/12 h משטר כהה, עם טלטול מסלולית ב 150 rpm]. למדוד צמיחה באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים [למשל, צפיפות אופטית ב 730 ננומטר (OD730nm), כלורופיל a, יבש משקל, וכו '], אז למדוד את הייצור של פוליסכדים שפורסמו על פי החומצה פנול-גופרתית שיטה16.
    2. להעביר את התרבות לקרומים דיאליזה (12-14 kDa של משקל מולקולרי לגזור) ו dialyze נגד מינימום של 10 כרכים של מים מוכי עבור 24 h עם ערבוב רציפה.
      הערה: בהתאם לנפח התרבות כדי dialyze והרכב בינוני, ייתכן שיהיה צורך לשנות את מי הדיאליזה.
    3. צנטריפוגה את התרבות ב 15,000 x g עבור 15 דקות ב 4 ° c. להעביר את סופרנטאנט למבחנה חדשה ולמחוק את הגלולה (תאים).
    4. צנטריפוגה שוב ב 20,000 x g עבור 15 דקות ב-4 ° צ' כדי להסיר מזהמים כגון הקירות הקיר או ליפופוליסכרידים (lps).
    5. להעביר את הסופרנטאנט לגביע זכוכית ולהשליך את הגלולה.
  2. משקעים של הפולימר
    1. הוסף 2 כרכים של 96% אתנול לסופרנטאנט.
    2. מודיית את ההשעיה ב 4 ° c, לפחות לילה.
    3. התאוששות מפולימר
      1. עבור כמויות קטנות או לא גלוי של שרז פולימר: צנטריפוגה את ההשעיה ב 13,000 x g עבור 25 דקות ב 4 ° c. השמט את הסופרנטאנט והשהה מחדש את הגלולה ב-1 מ ל או 2 מ ל של מים מפוקעים. להעביר את ההשעיה מימית לבקבוקון.
        התראה: יש לסלק את הסופרנטאנט בעדינות, מאחר שהוא יכול להיות מושהה בקלות.
      2. לעין/כמויות גדולות של שרז פולימר: לאסוף את פולימר הזירז עם מלקחיים מתכת סטרילית לבקבוקון. לסחוט את הפולימר ולהשליך את האתנול עודף.
    4. אופציונלי: בהתאם לדרגת הטיהור הפולימרי הנדרש, חזור על שלב המשקעים עם 96% אתנול לאחר השעיית הפולימרים במים מנולים.
  3. הליאופליזציה של הפולימר
    1. שמרו את הבקבוקונים עם פולימר הזירז ב-80 ° c, לפחות בן לילה.
    2. להקפיא יבש (ליזוליז) פולימר לפחות 48 h (לא נותנים ההשעיה להפשיר לפני להקפיא לייבוש).
    3. אחסן את הפולימר היבש בטמפרטורת החדר (RT) עד לשימוש נוסף.
      הערה: מומלץ לאחסן את הפולימר בdesiccator, שכן הוא יכול לספוג מים לאורך זמן.

2. בידוד exoproteome של cyanobacterial

  1. ריכוז בינוני
    1. לטפח כחוליות בתנאים סטנדרטיים [למשל, 30 ° צ' מתחת לאור 12 h (50 μE m-2-1)/12 h משטר כהה, עם טלטול מסלולית ב 150 rpm]. נטר את הצמיחה cyanobacterium באמצעות הליכים סטנדרטיים (למשל, OD730nm, כלורופיל a, יבש משקל, וכו ').
    2. צנטריפוגה את התרבויות ב 4,000 x g, עבור 10 דקות ב RT.
    3. להעביר את סופרנטאנט לבקבוקון ולמחוק את הגלולה התא.
    4. לסנן את המדיום יצקתי דרך מסנן 0.2 יקרומטר גודל הנקבוביות.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן למשך פרק זמן קצר, אם המדיום נשמר ב-4 ° c.
    5. רכזו את המדיום כ-500 x (בהתחשב בנפח הראשוני של המדיום המסונן), באמצעות ריכוז צנטריפוגלי עם משקל מולקולרי נומינלי שנחתך מ-3 kDa. יש להפעיל את צנטריפוגה ב-4,000 x g (מקסימום 1 h לכל צנטריפוגה עגול) ב-15 ° c.
      התראה: עבור רוב המותגים, התקן המסנן צריך להיות שוטפים על ידי צנטריפוגה עם מים באולטרטהורים לפני השימוש. ברגע שהמסנן רטוב, אל תתנו לו להתייבש. השאר מספיק נוזלים במאגר כאשר ההתקן אינו נמצא בשימוש.
      הערה: הפחתת הטמפרטורה הצנטריפוגה ל-4 ° צ' עשויה להיות שימושית אם המטרה היא לחקור את פעילות החלבונים, למרות שהיא תגדיל את הזמן הדרוש להתרכזות במדגם. ניתן להשהות את הפרוטוקול בין צנטריפוגה צעדים לפרקי זמן קצרים אם המדיום נשמר ב-4 ° c.
    6. שטפו את הקירות של מאגר לדוגמה של התקן המסנן בעזרת המדגם המרוכז והעבירו את התוכן לשפופרת מיקרוצנטריפוגה.
    7. בצע שטיפת כביסה נוספת של מאגר המכשיר לדוגמה מסנן עם בינוני התרבות אוטוקלע כדי להבטיח התאוששות exoproteome מקסימלית.
      הערה: כדי לכמת את אחוז ההחלמה, בצע את הוראות היצרן הספציפיות.
    8. אחסן את הדגימות הexoproteome ב-20 ° c עד לשימוש נוסף.
      הערה: הוספת מעכבי פרוטאז מומלצת לאחסון לטווח ארוך.
  2. ניתוח הexoproteome
    1. לכמת את תכולת החלבון על ידי שיטת החלבון BCA ב 96-הצלחת בהתאם להוראות היצרן.
    2. הפרד את החלבונים על ידי נתרן dodecyl סולפט-פוליאקרילמיד ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE), באמצעות פרוטוקולי כתמים סטנדרטיים (למשל, Coomassie כחול, כתמים כסף).
    3. חותכים את הלהקות/ג'ל אזורים של עניין ולאסוף אותם בצינורות מיקרוצנטריפוגה שונים המכילים כרכים המתאימים של מים אולטרה טהורים.
    4. המשך בזיהוי ובניתוח של החלבונים על-ידי ספקטרומטר מסה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ייצוג סכמטי של השיטה תיאר לחלץ פולימרים פחמימות שפורסמו מתוך התרבויות cyanobacterial מתוארת באיור 1. פולימרים של מפיקת ה-EPS המתונות cyanobacterium sy, מפיק מסוג היצרן. pcc 6803 ומפיק ה-eps היעיל המפיק השני של ccy 0110 מוצגים באיור 2. באיור 3, מוצגים פולימרים ליאופונים בעלי דרגות שונות של זיהום, המדגיש את חשיבות הצעדים הצנטריפוגה לטוהר המוצר הסופי. איור 4 מתאר את שיטת הבידוד עבור cyanקובאל exoproteome. בינונית חינם תא ללא מרוכז דגימות (כלומר, המתקבלים מתרבויות בשלבי צמיחה שונים ומתוך זן cyanobacterial עם ייצור קרוטנאיד תחתון) מוצגים באיור 5. דגימות של Exoproteome משני זנים מורפולוגית ברורים של cyanobacterial, החוליות של כחוליות הקיאנאוציטים SP. pcc 6803 והציטואובקטריה sp. pcc 7120, מופרדים על ידי sds-PAGE, מוצגים ב . איור 6

Figure 1
איור 1 : תהליך הבידוד של cyanobacterial פרסמה פולימרים של פחמימות. החל מהתרבות הציטוקובניאלית והסרת מזהמים ומסתיימים בבידוד פולימרי וליטוליזציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2 : פולימרים Cyanobacterial לאחר משקעים. (א) פולימר ממפיק ה-EPS המתון סינולוצילף sp. pcc 6803 על קיר הצנטריפוגה לאחר משקעים וצנטריפוגה (חיצים). (ב) בגושים פולימריים ממפיק ה- EPS היעיל של היצרן. ccy 0110 צף בגביע הזכוכית לאחר משקעים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3 : פולימרים. (א) שלוש קבוצות של פולימרים עצמאיים מבודדים מסיקרולוצילף sp. pcc 6803: ללא זיהום גלוי (AI), עם פיגמנטציה הרומז על זיהום עם קרוטנואידים (הכל) או לכלוך תא (aiii) . (ב) מפולימר ליאופל מתוך ציאנות2 . ccy 0110 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4 : זרימת עבודה עבור cyanobacterial exoproteome בידוד. מתרבות cyanobacterial ועד הפרדה בינונית וריכוז, המסתיימת בניתוח exoproteome. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5 : צינורות מיקרוצנטריפוגה עם דגימות תא מרוכז ללא מדיום. (א) מרוכזים דגימות בינוניות מסיקולוצילף sp. pcc 6803 פראי, שנאסף על OD שונים730nm (0.5, 1, ו 2). (ב) מרוכז מדגם מדיום מסיקרולוצילף ∆sigf, מוטציה עם ייצור קרוטנואידים מלקויי15. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6 : Coomassie כחול מוכתם SDS-דף ג ' לים מראה את החלבונים שהצטברו בתוך cyanobacterial תא בינוני מרוכז ללא תשלום. (א) הExoproteome מתוך החוליות של כחוליות הטבע ה∆. pcc 6803 מסוג פראי ומוטציה. (ב) Exoproteome מסיקוציטים ∆sigf מזוהמים ברמות גבוהות של פוליסכרידים. (ג) Exoproteome מתוך הטאנוקובטיום אנאנ7120 אוטרטמיום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כדי להבין טוב יותר מנגנוני הפרשה חיידקיים וללמוד את המוצרים שפורסמו, זה חשוב ביותר כדי להדגים את הבידוד יעיל וניתוח של הbiomolecules הנוכחי בסביבה חיידקי החילוץ (כגון שוחרר פולימרים של פחמימות וחלבונים).

מסחטות cyanobacterial פולימרים פחמימות מורכבים מאוד, בעיקר בשל מספר ופרופורציה של monosaccharides שונים המהווים הרכב שלהם1. השיטות הקונבנציונליות המשמשות לבידוד של חומרים פולימריים אלה מסתמכים על המושג הפשוט שחומרים אלה עשירים בסוכר מסיסים בפתרונות מימית ויכולים להיות זירז על-ידי תוספת של ממיסים אורגניים (כגון אצטון או אתנול)9 ,17,18. הדבר נובע בשל הפקת מולקולות מים מפגזי הליצות של הפולימרים, והיעילות של התהליך תלויה במשקל המולקולרי של הפולימר (יעיל יותר בשברי משקל מולקולריים גבוהים יותר), מבנה כימי, ו ריכוז9,18. בנוסף לשלב המשקעים, השיטה המתוארת כאן כוללת את הצעדים הקריטיים של דיאליזה וצנטריפוגה. דיאליזה להסיר ביעילות מלחים ותרכובות אחרות מן המדיום, אשר עשוי להופיע לאחר ליאופליזציה כמו אבקה כמו מבנים, בעוד השלבים צנטריפוגה יסיר מזהמים עיקריים פסולת תא.

כשלים במהלך שלבים אלה עלולים להוביל לפולימרים עם רמות זיהום גבוהות ומאפיינים שונים, בהתאם לאצוות הבידוד. כמה זהום ניתן לזהות בקלות מאקרוזה לאחר ליטוטיזציה פולימר, מאז הם לשנות את הפיגמנטציה הפולימר (בדרך כלל לבן או חום בהיר). לדוגמה, פולימרים שאינם ירוקים או כתומים הם בדרך כלל מזוהמים מאוד עם פסולת תא/כלורופיל או קרוטנואידים. הדבר קשור לזמן מספיק או לכוח g בשלבים צנטריפוגה. עם זאת, כמה זנים cyanobacterial יכול לשחרר פיגמנטים ולהפריש חלבונים שנשארים קשורים באופן טבעי עם פולימרים, וזה צריך להיחשב בעת ניתוח המוצר הסופי19. ניתן להוסיף צעדים נוספים לטיהור הפולימרים (למשל, טיפולי TCA)10. עם זאת, אלה שלבי טיהור יכול להיות גם השפעה שלילית במוצר הסופי, כמו הסרת חלבונים ורכיבים אחרים יכולים לשנות את המאפיינים פולימר (למשל, צמיגות, hydrophobicity, וכו ') מיכל בן , 20. אפילו חזרה על צעדי המשקעים והליליטיזציה יכולים להשפיע באופן שלילי על פולימרים, בעיקר בשל מחזורי ההקפאה שמשנים בקלות את המאפיינים הפיזיקליים שלהם21. כדי לשפר את התשואות פולימר, ניתן להחיל טיפולי חימום על תרבויות שלמות לפני משקעים. שלב נוסף זה משחרר את הפולימר המשויך למשטח התא, אך הוא עלול גם להוביל לדפלוניזציה18,20. לסיכום, חשוב להבחין שבחירת הפרוטוקול תשפיע הן על הכמות והן על איכותו של פולימרים מבודדים9,20.

בנוגע לחלבונים cyanobacterial המזוהים בתחום הפריתאי, הם מציגים מגוון רחב של משקולות מולקולריים ונקודות איזואלקטריות ויכולים להיות מסיסים או ממברנות משויכים. מגוון זה של תכונות פיזיקליות מייצג סוגיה לבחירת השיטה המתאימה ביותר לבידוד exoproteome. השיטה המוצגת כאן תלויה במידה רבה בריכוז הbiomolecules בתחומי החילוץ. שיטה זו מבודדת לא רק חלבונים המופרשים לתוך המדיום, אלא גם חלבונים המצויים הממברנה החיצונית שלפוחיות (OMVs) ונגזר מתוך הליזה תאים. לכן, שלבים צנטריפוגה צריך להתבצע בעדינות כדי למנוע הפרעה בתאים, אבל באותו זמן לאסוף OMVs. בזנים cyanobacterial כי הם יעילים omvs מפיקים, ההכנות exoproteome הם בדרך כלל כתום בשל נוכחותם של קרוטנואידים הקשורים עם אלה lipidic מבנים14,15. עם זאת, תכונה זו יכולה להשתנות במידה ניכרת בהתאם למתח cyanobacterial ושלב הצמיחה. על מנת להעריך את התרומה של חלבונים על ידי OMVs, שלבים להפוגות יש להוסיף להליך22. יתר על כן, חלבונים להגיע לחלל החילוץ עקב לפירוק תאים ניתן לזהות על ידי איסוף דגימות בשלבי צמיחה שונים והגדלת מספר השכפל.

כאמור, מאז זנים cyanobacterial רבים לייצר מסחטות פולימרים פחמימות (EPS), ההכנות exoproteome יכול להיות גם EPS בהרכב שלהם. שלב הסינון אמור לשמור על EPS מורכב וגדול יותר, אך בסופו של דבר שברים מסוג EPS עלולים לעבור. כתוצאה מכך, זיהום עם כמויות גדולות של פחמימות יכול להפריע לניתוח exoproteome. לדוגמה, זיהום זה עלול לגרום לעיכוב הפרדת חלבון ב-ג'לים פוליאקרילמיד, כמו גם מסכה פחות שופע חלבונים. פרוטוקולים חלופיים הוצעו עבור בידוד exoproteome במטרה להסיר biomolecules מזהם נוכח במדיום החילוץ, אבל הם הוכחו להיות סלקטיבית מאוד, אשר עשוי להוביל מוטה exoproteome פרופילים13. מצד שני, כמות מסוימת של חלבונים עשויה להיות לכודה בשברים EPS מורכבים יותר אם הם תקועים במסנן. במקרה זה, ניתוח הכנות exoproteome מפני שלבי גדילה שונים/מצבים ניסיוניים, כמו גם ניתוח של חלבונים בשברים EPS עשוי לעזור לזהות את החלבונים לכודים.

בסך הכל, הפרוטוקולים המתוארים כאן לגלם את הצעדים הקריטיים עבור בידוד יעיל של הפולימרים של cyanobacterial שוחרר פחמימות וexoproteomes. החשוב ביותר, הם יכולים להיות מותאמים בקלות על פי צורכי משתמש ספציפיים וכוללים זנים חיידקיים אחרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

עבודה זו היתה ממומנת על ידי Fundo אירופu de Desenvolvimento האזורית (פדר) קרנות באמצעות 2020 להתחרות-תוכנית Operacional לתחרותיות ובאינטראלליזציה (POCI), פורטוגל 2020, ועל ידי כספים פורטוגזית דרך FCT-Funda, הסדרה האלקטרונית e Tecnoלוג/Ministério da Ciência, Tecnoלוגיה e Ensino מעולה במסגרת הפרויקט POCI-01-0145-פדר-028779 והענק SFRH/BD/99715/2014 (CF).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dialysis membranes Medicell Membranes Ltd  DTV.12000.07 Visking Tubing Size 7, Dia 23.8 mm, Width 39-41 mm 30m Roll 
Ethanol 96% AGA - Álcool e Géneros Alimentares, S.A. 4.000.02.02.00 Fermentation ethyl alcohol 96% AGA
PES Filter 0.2 μm Fisher Scientific, Lda 15206869 Syringe filter polystyrene 33MM 0.2µM STR 
Amicon Ultra-15, Ultracel-3K Merck Millipore Ltd. UFC900324 Centrifugal filters with a nominal molecular weight cut-off of 3 kDa
Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Fisher Scientific, Lda 10741395 Green-to-blue, precise, detergent-compatible assay reagent to measure total protein concentration
Brillant Blue G Colloidal Concentrate  Sigma Aldrich Química SL B2025-1EA Coomassie blue 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pereira, S., et al. Complexity of cyanobacterial exopolysaccharides: composition, structures, inducing factors and putative genes involved in their biosynthesis and assembly. FEMS Microbiology Reviews. 33 (5), 917-941 (2009).
  2. Kanekiyo, K., et al. Isolation of an Antiviral Polysaccharide, Nostoflan, from a Terrestrial Cyanobacterium, Nostoc flagelliforme. Journal of Natural Products. 68 (7), 1037-1041 (2005).
  3. Løbner, M., Walsted, A., Larsen, R., Bendtzen, K., Nielsen, C. H. Enhancement of human adaptive immune responses by administration of a high-molecular-weight polysaccharide extract from the cyanobacterium Arthrospira platensis. Journal of Medicinal Food. 11 (2), 313-322 (2008).
  4. Wang, H. B., Wu, S. J., Liu, D. Preparation of polysaccharides from cyanobacteria Nostoc commune and their antioxidant activities. Carbohydrate Polymers. 99, 553-555 (2014).
  5. Ozturk, S., Aslim, B., Suludere, Z., Tan, S. Metal removal of cyanobacterial exopolysaccharides by uronic acid content and monosaccharide composition. Carbohydrate Polymers. 101, 265-271 (2014).
  6. Han, P. P., et al. Emulsifying, flocculating, and physicochemical properties of exopolysaccharide produced by cyanobacterium Nostoc flagelliforme. Applied Biochemistry and Biotechnology. 172 (1), 36-49 (2014).
  7. Leite, J. P., et al. Cyanobacterium‐Derived Extracellular Carbohydrate Polymer for the Controlled Delivery of Functional Proteins. Macromolecular Bioscience. 17 (2), 1600206 (2017).
  8. Estevinho, B. N., et al. Application of a cyanobacterial extracellular polymeric substance in the microencapsulation of vitamin B12. Powder Technology. 343, 644-651 (2019).
  9. Klock, J. H., Wieland, A., Seifert, R., Michaelis, W. Extracellular polymeric substances (EPS) from cyanobacterial mats: characterisation and isolation method optimisation. Marine Biology. 152 (5), 1077-1085 (2007).
  10. Delattre, C., Pierre, G., Laroche, C., Michaud, P. Production, extraction and characterization of microalgal and cyanobacterial exopolysaccharides. Biotechnology Advances. 34 (7), 1159-1179 (2016).
  11. Costa, T. R., et al. Secretion systems in gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights. Nature Reviews Microbiology. 13 (6), 343-359 (2015).
  12. Roier, S., Zingl, F. G., Cakar, F., Schild, S. Bacterial outer membrane vesicle biogenesis: a new mechanism and its implications. Microbial Cell. 3 (6), 257-259 (2016).
  13. Sergeyenko, T. V., Los, D. A. Identification of secreted proteins of the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803. FEMS Microbiology Letters. 193 (2), 213-216 (2000).
  14. Oliveira, P., et al. The versatile TolC-like Slr1270 in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Environmental Microbiology. 18 (2), 486-502 (2016).
  15. Flores, C., et al. The alternative sigma factor SigF is a key player in the control of secretion mechanisms in Synechocystis sp. PCC 6803. Environmental Microbiology. 21 (1), 343-359 (2018).
  16. Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Chemistry. 28 (3), 350-356 (1956).
  17. Parikh, A., Madamwar, D. Partial characterization of extracellular polysaccharides from cyanobacteria. Bioresource Technology. 97 (15), 1822-1827 (2006).
  18. Rühmann, B., Schmid, J., Sieber, V. Methods to identify the unexplored diversity of microbial exopolysaccharides. Frontiers in Microbiology. 6, 565 (2015).
  19. Pathak, J., Rajneesh, R., Sonker, A. S., Kannaujiya, V. K., Sinha, R. P. Cyanobacterial extracellular polysaccharide sheath pigment, scytonemin: A novel multipurpose pharmacophore. Marine Glycobiology. , CRC Press. 343-358 (2016).
  20. Nguyen, A. T. B., et al. Performances of different protocols for exocellular polysaccharides extraction from milk acid gels: Application to yogurt. Food Chemistry. 239, 742-750 (2018).
  21. Jamshidian, H., Shojaosadati, S. A., Mousavi, S. M., Soudi, M. R., Vilaplana, F. Implications of recovery procedures on structural and rheological properties of schizophyllan produced from date syrup. International Journal of Biological Macromolecules. 105, 36-44 (2017).
  22. Couto, N., Schooling, S. R., Dutcher, J. R., Barber, J. Proteome profiles of outer membrane vesicles and extracellular matrix of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Proteome Research. 14 (10), 4207-4222 (2015).

Tags

ביוכימיה סוגיה 147 פולימרים של פחמימות מexoproteome פוליסכרידים משוחררים הפרשה כחוליות סיקוציטים
מבט כלפי חוץ: בידוד של Cyanobacterial שוחרר פולימרים פחמימות וחלבונים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Flores, C., Tamagnini, P. Looking… More

Flores, C., Tamagnini, P. Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins. J. Vis. Exp. (147), e59590, doi:10.3791/59590 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter