Summary
Qui, vengono descritti i protocolli per l'isolamento dei polimeri di carboidrati rilasciati cianobatterici e l'isolamento dei loro esoproteomi. Entrambe le procedure incorporano i passaggi chiave per ottenere polimeri o proteine con gradi di elevata purezza che possono essere utilizzati per ulteriori analisi o applicazioni. Possono anche essere facilmente adattati in base alle esigenze specifiche dell'utente.
Abstract
I cianobatteri possono secernere attivamente una vasta gamma di biomolecole nell'ambiente extracellulare, come eteropolisaccaridi e proteine. L'identificazione e la caratterizzazione di queste biomolecole può migliorare la conoscenza delle loro vie di secrezione e contribuire a manipolarle. Inoltre, alcune di queste biomolecole sono interessanti anche in termini di applicazioni biotecnologiche. Qui sono descritti due protocolli per un facile e rapido isolamento di polimeri e proteine di carboidrati rilasciati acinobatteri. Il metodo per l'isolamento dei polimeri di carboidrati rilasciati si basa su tecniche convenzionali di precipitazione di polisaccarides in soluzioni acquose che utilizzano solventi organici. Questo metodo conserva le caratteristiche del polimero ed evita contemporaneamente la presenza di contaminanti da detriti cellulari e mezzi di coltura. Alla fine del processo, il polimero lofilofilizzato è pronto per essere utilizzato o caratterizzato o può essere sottoposto a ulteriori cicli di purificazione, a seconda dell'uso previsto finale. Per quanto riguarda l'isolamento dell'esoprotema cianobatterico, la tecnica si basa sulla concentrazione del mezzo privo di cellule dopo la rimozione dei principali contaminanti mediante centrifugazione e filtrazione. Questa strategia consente un isolamento affidabile delle proteine che raggiungono l'ambiente extracellulare tramite trasportatori di membrana o vesciche di membrana esterne. Queste proteine possono essere successivamente identificate utilizzando tecniche standard di spettrometria di massa. I protocolli qui presentati possono essere applicati non solo a una vasta gamma di cianobatteri, ma anche ad altri ceppi batterici. Inoltre, queste procedure possono essere facilmente adattate in base all'uso finale dei prodotti, al grado di purezza richiesto e alla deformazione batterica.
Introduction
I cianobatteri sono ampiamente riconosciuti come fonti prolifiche di prodotti naturali con promettenti applicazioni biotecnologiche/biomediche. Pertanto, la comprensione dei meccanismi di secrezione cianobatterici e l'ottimizzazione dei metodi di estrazione/recupero sono essenziali per implementare i cianobatteri come fabbriche di cellule microbiche efficienti.
Molti ceppi cianobatterici sono in grado di produrre sostanze polimeriche extracellulari (EPS), formate principalmente da eteropolisidi, che rimangono associate alla superficie cellulare o vengono rilasciate nel mezzo1. Questi polimeri di carboidrati rilasciati hanno caratteristiche distinte rispetto a quelle di altri batteri, che li rendono adatti per una vasta gamma di applicazioni (ad esempio, antivirali2, immunostimolatori3 , antiossidanti4, chelazione metallica5, emulsionando6e agenti di somministrazione di farmaci7,8). La metodologia per l'isolamento di questi polimeri contribuisce in gran parte non solo al miglioramento della resa, ma anche ad una maggiore purezza e alle proprietà fisiche specifiche del polimero ottenute9. La stragrande maggioranza di questi metodi per l'isolamento dei polimeri si basa su strategie di precipitazione del mezzo di coltura che sono facilmente realizzabili a causa della forte natura anionica del polimero9,10. Inoltre, la rimozione dei solventi utilizzati nella fase di precipitazione può essere rapidamente ottenuta mediante evaporazione e/o liofilizzazione. A seconda dell'applicazione prevista, è possibile associare diversi passaggi dopo o prima della precipitazione polimerica per personalizzare il prodotto finale, che includono il trattamento dell'acido tricloroacetico (TCA), la filtrazione o la cromatografia di esclusione delle dimensioni (SEC) purificazione colonna10.
I cianobatteri sono anche in grado di secernere una vasta gamma di proteine attraverso percorsi dipendenti da trasportatori di membrana (classica)11 o mediati da vescicoli (non classici)12. Pertanto, l'analisi dell'esoproteoma cianobatterico costituisce uno strumento essenziale, sia per comprendere/manipolare i meccanismi di secrezione delle proteine cianobatteriche e comprendere la specifica funzione extracellulare di queste proteine. L'isolamento affidabile e l'analisi degli esoproteomi richiedono la concentrazione dell'ambiente extracellulare, poiché l'abbondanza di proteine secrete è relativamente bassa. Inoltre, altri passaggi fisici o chimici (ad esempio, centrifugazione, filtrazione o precipitazioni proteiche) possono ottimizzare la qualità dell'esoproteoma ottenuto, arricchendo il contenuto proteico13,ed evitando la presenza di contaminanti (ad esempio, pigmenti, carboidrati, ecc. 14 Del sistema , 15 o la predominanza delle proteine intracellulari nei campioni. Tuttavia, alcuni di questi passaggi possono anche limitare l'insieme di proteine che possono essere rilevate, portando ad un'analisi di parte.
Questo lavoro descrive protocolli efficienti per l'isolamento dei polimeri di carboidrati rilasciati e degli esoproteomi dai media di coltura dei cianobatteri. Questi protocolli possono essere facilmente adattati agli obiettivi specifici dello studio e alle esigenze degli utenti, pur mantenendo i passaggi di base presentati qui.
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Protocol
1. Cianobacterial rilasciato isolamento polimero di carboidrati
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Isolamento e rimozione di polimeri e rimozione dei contaminanti
- Coltivare la varietà cianobatterica in condizioni standard [ad esempio, 30 gradi sotto una luce di 12 h (50 e2 s2s )/12 h regime scuro, con scosse orbitali a 150 rpm]. Misurare la crescita utilizzando protocolli standard [ad esempio, densità ottica a 730 nm (OD730nm), clorofilla un, peso secco, ecc.], quindi misurare la produzione di polisaccharides rilasciati secondo il metodo dell'acido fenolo-solforico16.
- Trasferire la coltura nelle membrane di dialisi (12-14 kDa di peso molecolare cut-off) e dialisire contro un minimo di 10 volumi di acqua deionizzata per 24 h con agitazione continua.
NOTA: A seconda del volume della cultura per dialisizzare e composizione media, potrebbe essere necessario modificare l'acqua di dialisi. - Centrifugare la coltura a 15.000 x g per 15 min a 4 gradi centigradi. Trasferire il super-ataltuo in una nuova fiala e scartare il pellet (cellule).
- Centrifuga di nuovo a 20.000 x g per 15 min a 4 gradi centigradi per rimuovere i contaminanti come i detriti della parete cellulare o i lipopoliosaccori (LPS).
- Trasferire il supernatante in un bicchiere di vetro e scartare il pellet.
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Precipitazioni del polimero
- Aggiungere 2 volumi di 96% di etanolo al supernatante.
- Incubare la sospensione a 4 gradi centigradi, almeno durante la notte.
- Recupero polimerico
- Per piccole o non visibili quantità di polimero precipitato: centrifugare la sospensione a 13.000 x g per 25 min a 4 gradi centigradi. Scartare il supernatante e risospendere il pellet in 1 mL o 2 mL di acqua autoclaved deionizzata. Trasferire la sospensione aqueous in una fiala.
AVVISO: Il supernatante deve essere scartato delicatamente, in quanto può diventare facilmente risospeso. - Per quantità visibili/grandi di polimero precipitato: raccogliere il polimero precipitato con pinze metalliche sterili su una fiala. Spremere il polimero e scartare l'etanolo in eccesso.
- Per piccole o non visibili quantità di polimero precipitato: centrifugare la sospensione a 13.000 x g per 25 min a 4 gradi centigradi. Scartare il supernatante e risospendere il pellet in 1 mL o 2 mL di acqua autoclaved deionizzata. Trasferire la sospensione aqueous in una fiala.
- Facoltativo: a seconda del grado di purificazione del polimero richiesto, ripetere la fase di precipitazione con il 96% di etanolo dopo la sospensione dei polimeri in acqua deionizzata.
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Lofilazione del polimero
- Tenere le fiale con il polimero precipitato a -80 gradi centigradi, almeno durante la notte.
- Congelare (liofilizzare) il polimero per almeno 48 h (non lasciare che la sospensione si scongeli prima dell'essiccazione).
- Conservare il polimero essiccato a temperatura ambiente (RT) fino a un ulteriore utilizzo.
NOTA: Si consiglia di conservare il polimero in un desiccatore, in quanto può assorbire acqua nel tempo.
2. Isolamento degli esoproteomi cianobatterici
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Concentrazione media
- Coltivare i cianobatteri in condizioni standard [ad es., 30 gradi sotto una luce di 12 h (50 ,e 2s )/12 h regime scuro, con scosse orbitali a 150 giri/m]. Monitorare la crescita del cianobatterio utilizzando procedure standard (ad esempio, OD730nm, clorofilla, dry-weight, ecc. ).
- Centrifugare le colture a 4.000 x g, per 10 min a RT.
- Trasferire il supernatante in una fiaschetta e scartare il pellet cellulare.
- Filtrare il mezzo decanato attraverso un filtro dimensione poro 0,2 m.
NOTA: Il protocollo può essere sospeso qui per un breve periodo di tempo, se il supporto è mantenuto a 4 gradi centigradi. - Concentrare il mezzo circa 500x (considerando il volume iniziale del mezzo filtrato), utilizzando concentratori centrifughi con un peso molecolare nominale cut-off di 3 kDa. La centrifugazione deve essere azionata a 4.000 x g (massimo 1 h per ciclo di centrifugazione) a 15 gradi centigradi.
AVVISO: Per la maggior parte delle marche di concentratori, il dispositivo di filtro deve essere sciacquato dalla centrifugazione con acqua ultrapura prima dell'uso. Una volta che il filtro è bagnato, non lasciarlo asciugare. Lasciare abbastanza liquido sul serbatoio quando il dispositivo non è in uso.
NOTA: Ridurre la temperatura di centrifugazione a 4 gradi centigradi può essere utile se l'obiettivo è studiare l'attività proteica, anche se aumenterà il tempo necessario per la concentrazione del campione. Il protocollo può essere sospeso tra le fasi di centrifugazione per brevi periodi di tempo se il mezzo è mantenuto a 4 gradi centigradi. - Sciacquare le pareti del serbatoio del campione del dispositivo di filtro con il campione concentrato e trasferire il contenuto in un tubo di microcentrifuga.
- Eseguire un ulteriore passaggio di lavaggio del serbatoio del campione del dispositivo di filtro con mezzi di coltura autoclaved per garantire il massimo recupero dell'esoprotema.
NOTA: per quantificare la percentuale di recupero, seguire le istruzioni del produttore specifico. - Conservare i campioni di esoprotema a -20 gradi centigradi fino a un ulteriore utilizzo.
NOTA: l'aggiunta di inibitori della proteasi è raccomandata per lo stoccaggio a lungo termine.
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Analisi dell'esoprotema
- Quantificare il contenuto proteico dal saggio proteico BCA in piastra di 96 pozze secondo le istruzioni del produttore.
- Separare le proteine con l'elettroforesi gel (SDS-PAGE) di sodio dodecyl solfato(polyacrilio), utilizzando protocolli di colorazione standard (ad esempio, Coomassie blue, colorazione argento).
- Tagliare le regioni di bande/gel di interesse e raccoglierle in diversi tubi di microcentrifuga contenenti volumi appropriati di acqua ultrapura.
- Procedere con l'identificazione e l'analisi delle proteine mediante spettrometria di massa.
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Representative Results
Una rappresentazione schematica del metodo descritto per estrarre i polimeri di carboidrati rilasciati dalle colture cianobatteriche è illustrata nella Figura 1. Polimeri precipitati dal moderato produttore EPS cianobatterio Synechocystis sp. PCC 6803 e l'efficiente produttore di EPS Cyanothece sp. CCY 0110 sono mostrati figura 2. Nella Figura 3sono mostrati polimeri lofilizzati con diversi gradi di contaminazione, evidenziando l'importanza delle fasi di centrifugazione per la purezza del prodotto finale. Figura 4 raffigura il metodo di isolamento per l'esoproteoma cianobatterico. Campioni mediatici concentrati distinti dalle cellule (cioè ottenuti da colture in diverse fasi di crescita e da un ceppo cianobatterico con minore produzione di carotenoidi) sono mostrati nella Figura 5. Campioni di esoproproteomi provenienti da due ceppi cianobattericimorali morfologicamente distinti, i cianobatteri unicellulari Synechocystis sp. PCC 6803 e i cianobatteri filamentosi Anabaena sp. PCC 7120, separati da SDS-PAGE, sono mostrati in Figura 6.
Figura 1 : Flusso di lavoro per l'isolamento cianobatterici ha rilasciato polimeri di carboidrati. A partire dalla coltura cianobatterica e la rimozione dei contaminanti e terminando con l'isolamento dei polimeri e la liofilizzazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : polimeri cianobatterici dopo la precipitazione. (A) Polimero del produttore moderato EPS Synechocystis sp. PCC 6803 sulla parete del pallone centrifuga dopo precipitazioni e centrifugazione (frecce). (B) I grumi di polimeri provenienti dall'efficiente produttore di EPS Cyanothece sp. CCY 0110 galleggiante nel bicchiere di vetro dopo le precipitazioni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : polimeri cianobatterici liofilizzati. (A) Tre lotti indipendenti di polimeri isolati da Synechocystis sp. PCC 6803: senza contaminazione visibile (AI)e con pigmentazione indicativa di contaminazione con carotenoidi (AII) o detriti cellulari (AIII) . (B) Polimero liofilizzato di Cyanothece sp. CCY 0110. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Flusso di lavoro per l'isolamento degli esoprotema cianobatterici. Dalla coltura cianobatterica alla media separazione e concentrazione, terminando con l'analisi degli esoproteomi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : tubi di microcentrifuga con campioni medi concentrati privi di cellule. (A) Campioni medi concentrati da Synechocystis sp. PCC 6803 wild-type, raccolti a diversi OD730nm (0.5, 1, e 2). (B) Campione medio concentrato da Synechocystis -sigF, un mutante con produzione di carotenoidi alterati15. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 : Gel Coomassie blu-colorato SDS-PAGE che mostrano le proteine accumulate nel mezzo concentrato cianobatterico privo di cellule. (A) Exoproteome dai cianobatteri unicellulari Synechocystis sp. PCC 6803 wild-type esigF mutante. (B) Exoproteome di Synechocystis -sigF contaminato da alti livelli di polisaccauri. (C) Esoprotema dal filamentoso cianobatterio Anabaena sp. PCC 7120. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Per comprendere meglio i meccanismi di secrezione batterica e studiare i prodotti rilasciati, è di estrema importanza dimostrare l'isolamento efficiente e l'analisi delle biomolecole presenti nell'ambiente batterico extracellulare (come polimeri di carboidrati e proteine).
I polimeri di carboidrati extracellulari cianobatterici sono estremamente complessi, principalmente a causa del numero e della proporzione di monosaccori diversi che costituiscono la loro composizione1. I metodi convenzionali utilizzati per l'isolamento di queste sostanze polimeriche si basano sul semplice concetto che queste sostanze ricche di zucchero sono solubili in soluzioni acquose e possono essere precipitate con l'aggiunta di solventi organici (come acetone o etanolo)9 ,17,18. Ciò si verifica a causa dell'estrazione di molecole d'acqua dai gusci di idratazione dei polimeri, e l'efficienza del processo dipende intrinsecamente dal peso molecolare del polimero (più efficiente a frazioni di peso molecolare più elevate), struttura chimica, e concentrazione9,18. Oltre alla fase di precipitazione, il metodo qui descritto include i passaggi critici della dialisi e della centrifugazione. La dialisi rimuoverà in modo efficiente sali e altri composti dal mezzo, che possono apparire dopo la liofilizzazione come strutture simili a polvere, mentre i passaggi di centrifugazione rimuoveranno i principali contaminanti e detriti cellulari.
I guasti durante questi passaggi possono portare a polimeri con alti livelli di contaminazione e caratteristiche diverse, a seconda del lotto di isolamento. Alcune contaminazioni possono essere facilmente rilevate macroscopicamente dopo la liofilizzazione polimerica, poiché alterano la pigmentazione polimerica (di solito bianco o marrone chiaro). Ad esempio, i polimeri lofilfizzati che sono verdi o arancioni sono generalmente altamente contaminati da detriti cellulari/clorofilla o carotenoidi. Ciò è legato al tempo insufficiente o alla forza g nei passi di centrifugazione. Tuttavia, alcuni ceppi cianobatterici possono rilasciare pigmenti e secernere proteine che rimangono naturalmente associate ai polimeri, e questo deve essere considerato quando si analizza il prodotto finale19. Ulteriori passaggi possono essere aggiunti per purificare ulteriormente i polimeri (ad esempio, trattamenti TCA)10. Tuttavia, queste fasi di purificazione potrebbero anche avere un impatto negativo nel prodotto finale, poiché la rimozione di proteine e altri componenti può alterare le proprietà dei polimeri (ad esempio, viscosità, idrofobicità, ecc.) 1 : il nome del , 20.Anche ripetere i passaggi di precipitazione/liofilizzazione può influenzare negativamente i polimeri, principalmente a causa dei cicli di congelamento-scongelamento che modificano facilmente le loro proprietà fisicochimiche21. Per migliorare le rese polimeriche, i trattamenti di riscaldamento possono essere applicati a intere colture prima della precipitazione. Questo passo in più rilascia il polimero associato alla superficie cellulare, ma può anche portare alla depolimerizzazione18,20. In sintesi, è importante notare che la scelta del protocollo influenzerà sia la quantità che la qualità dei polimeri isolati9,20.
Per quanto riguarda le proteine cianobatteriche identificate nell'ambiente extracellulare, esse mostrano una vasta gamma di pesi molecolari e punti isoelettrici e possono essere solubili o associati alla membrana. Questa diversità di proprietà fisico che rappresenta un problema per la selezione del metodo più adatto per l'isolamento degli esoproteomi. Il metodo qui presentato dipende fortemente dalla concentrazione delle biomolecole nel milieu extracellulare. Questo metodo isola non solo le proteine che sono secrete nel mezzo, ma anche le proteine presenti nelle vesciche della membrana esterna (OMV) e derivate dalla lisi cellulare. Pertanto, le fasi di centrifugazione devono essere eseguite delicatamente per evitare interruzioni cellulare, ma allo stesso tempo raccogliere OMV. Nei ceppi cianobatterici che sono produttori efficienti di OMV, i preparati exoproteome sono solitamente arancioni a causa della presenza di carotenoidi associati a queste strutture lipidiche14,15. Tuttavia, questa caratteristica può variare notevolmente a seconda della deformazione cianobatterica e della fase di crescita. Al fine di valutare il contributo delle proteine da parte degli OMV, le fasi di ultracentrifuga zione dovrebbero essere aggiunte alla procedura22. Inoltre, le proteine che raggiungono lo spazio extracellulare a causa della lisi cellulare possono essere rilevate raccogliendo campioni in diverse fasi di crescita e aumentando il numero di repliche.
Come già detto, poiché molti ceppi cianobatterici producono polimeri di carboidrati extracellulari (EPS), i preparati exoproteome potrebbero anche avere EPS nella loro composizione. La fase di filtrazione dovrebbe mantenere un EPS più complesso e grande, ma le frazioni EPS più semplici possono eventualmente passare attraverso. Di conseguenza, la contaminazione da grandi quantità di carboidrati può interferire con l'analisi degli esoproteomi. Ad esempio, questa contaminazione può causare un ritardo nella separazione delle proteine nei gel di poliacrilammide, così come mascherare le proteine meno abbondanti. Sono stati proposti protocolli alternativi per l'isolamento degli esoprotema con l'obiettivo di rimuovere le biomolecole contaminanti presenti nel mezzo extracellulare, ma hanno dimostrato di essere molto selettive, il che può portare a profili di esoprotema di parte13. D'altra parte, una certa quantità di proteine può essere intrappolata in frazioni EPS più complesse se sono bloccate nel filtro. In questo caso, l'analisi dei preparati per esoproteomi da diverse fasi di crescita/condizioni sperimentali, nonché l'analisi delle proteine nelle frazioni EPS può aiutare a identificare le proteine intrappolate.
Nel complesso, i protocolli qui descritti incarnano i passi cruciali per un isolamento efficiente dei polimeri di carboidrati rilasciati cianobatterici e degli esoproteomi. Ancora più importante, possono essere facilmente su misura in base alle esigenze specifiche dell'utente e includere altri ceppi batterici.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dai fondi di Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) attraverso il COMPETE 2020 - Programma Operacional per la competitività e l'internazionalizzazione (POCI), Portogallo 2020, e da fondi portoghesi attraverso FCT - a Tecnologia/Ministério da Cioncia, Tecnologia e Ensino Superior nell'ambito del progetto POCI-01-0145-FEDER-028779 e della sovvenzione SFRH/BD/99715/2014 (CF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dialysis membranes | Medicell Membranes Ltd | DTV.12000.07 | Visking Tubing Size 7, Dia 23.8 mm, Width 39-41 mm 30m Roll |
| Ethanol 96% | AGA - Álcool e Géneros Alimentares, S.A. | 4.000.02.02.00 | Fermentation ethyl alcohol 96% AGA |
| PES Filter 0.2 μm | Fisher Scientific, Lda | 15206869 | Syringe filter polystyrene 33MM 0.2µM STR |
| Amicon Ultra-15, Ultracel-3K | Merck Millipore Ltd. | UFC900324 | Centrifugal filters with a nominal molecular weight cut-off of 3 kDa |
| Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay | Fisher Scientific, Lda | 10741395 | Green-to-blue, precise, detergent-compatible assay reagent to measure total protein concentration |
| Brillant Blue G Colloidal Concentrate | Sigma Aldrich Química SL | B2025-1EA | Coomassie blue |
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