Aqui, apresentamos um protocolo para editar geneticamente as células CAR-T através de um sistema CRISPR/Cas9.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Usando CRISPR/Cas9 para knock out GM-CSF em células CAR-T
Neste artigo
Resumo
Resumo
A terapia de célula T (CAR-T) do receptor de antígeno quimérico é uma aresta de corte e uma nova opção de tratamento potencialmente revolucionária para câncer. No entanto, existem limitações significativas para o seu uso generalizado no tratamento do cancro. Estas limitações incluem o desenvolvimento de toxicidades originais tais como a síndrome da liberação do citocinas (CRS) e a neurotoxicidade (NT) e a expansão limitada, as funções efetoras, e a atividade antitumoral em tumores contínuos. Uma estratégia para melhorar a eficácia do CAR-T e/ou as toxicidades de controle das células CAR-t é editar o genoma das próprias células CAR-t durante a fabricação de células CAR-T. Aqui, nós descrevemos o uso da edição do gene de crispr/Cas9 em pilhas de Car-T através da transdução com uma construção lentivirais que contem um RNA do guia ao fator deestimulação da colônia do macrófago do granulocyte (GM-CSF) e Cas9. Como um exemplo, nós descrevemos o nocaute negociado CRISPR/Cas9 de GM-CSF. Nós mostramos que estas pilhas do carro-T do GM-CSFk/o produzem eficazmente menos GM-CSF ao manter a função crítica da pilha de t e resultam na atividade antitumoral aumentada in vivo comparada às pilhas selvagens do tipo Car-t.
Introdução
O receptor quimérico T do antígeno (carro-T) a terapia da pilha exibe a grande promessa no tratamento do cancro. 1. º , 2 duas terapias da pilha do carro-T que alvejaram CD19 (CART19) foram aprovadas recentemente nos Estados Unidos indicados e em Europa para o uso em malignidades da pilha de B após ter provado resultados impressionantes em ensaios clínicos multicêntrico. 3. º , 4. º , 5 as barreiras ao uso mais difundido de pilhas de Car-T são atividade limitada em tumores contínuos e em toxicidades associadas que inc....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Este protocolo segue as diretrizes do Conselho de revisão institucional da clínica Mayo (IRB) e do Comitê de biossegurança institucional (IBC).
produção da pilha 1. CART19
- Isolamento de células T, estimulação e cultura ex vivo
- Realize todo o trabalho da cultura de pilha em uma capa da cultura de pilha que utiliza o equipamento protetor pessoal apropriado. Colher células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de cones sanguíneos de doadores normais coletados durante a aférese, pois estes são conhecidos por serem uma fonte viável de PBMCs.13
- Para isolar PBMCs, adicione 15 mL de um meio....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
A Figura 1 mostra a redução do GM-CSF nas células GM-CSFk/o CART19. Para verificar se o genoma das células T foi alterado para nocaute GM-CSF, o sequenciamento de TIDE foi utilizado nas células GM-CSFk/o CART19 (Figura 1a). A mancha da superfície da pilha de CAR-T verifica que as pilhas de T expressam com sucesso o receptor de superfície do carro in vitro gating em pilhas CD3 + vivos (Fi.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Neste relatório, nós descrevemos uma metodologia para utilizar a tecnologia de CRISPR/Cas9 para induzir modificações secundárias em pilhas de CAR-T. Especificamente, isso é demonstrado usando transdução lentivirais com um vetor viral que contém grna visando o gene de interesse e Cas9 para gerar células GM-CSFk/o CART19. Nós tínhamos mostrado previamente que a neutralização de GM-CSF melhora CRS e NT em um modelo do xenograft. 12 como descrito previamente, as pilhas do carro-t do GM-CSF<.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
SSK é um inventor em patentes no campo da terapia de célula T do carro que são licenciadas a Novartis (sob um acordo entre a clínica de Mayo, a Universidade de Pensilvânia, e o Novartis). Estes estudos foram financiados em parte por uma subvenção do Humanigen (SSK). RMS, MJC, RS e SSK são inventores de patentes relacionadas a este trabalho. O laboratório (SSK) recebe financiamento de tolero, Humanigen, kite, Lentigen, Morphosys e actínio.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado através de subvenções da K12CA090628 (SSK), da rede nacional de câncer abrangente (SSK), do centro de clínica Mayo para medicina individualizada (SSK), da Fundação Predolin (SSK), do escritório da clínica Mayo de tradução para a prática (SSK), e o programa de treinamento de cientista médico da clínica Mayo Robert L. Howell bolsa de estudos médico-cientista (RMS).
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Anticorpo Monoclonal CD3 (OKT3), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0037-42 | |
| Anticorpo Monoclonal CD3 (UCHT1), APC, eBioscience | Invitrogen | 17-0038-42 | |
| Escolha Taq Blue Mastermix | Denville Scientific | C775Y51 | |
| CTS (Sistemas de Terapia Celular) Dynabeads CD3/CD28 | Gibco | 40203D | |
| CytoFLEX System B4-R2-V2 | Citômetro de fluxo | Beckman Coulter | C10343 |
| dimetilsulfóxido | Millipore Sigma | D2650-100ML | |
| Solução salina tamponada com fosfato Dulbecco | Gibco 14190-144 | ||
| Dynabeads MPC-S (Concentrador de Partículas Magnéticas) | Applied Biosystems | A13346 | |
| Easy 50 EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18002 | |
| EasySep Kit de Isolamento de Células T Humanas | STEMCELL Technologies | 17951 | esferas magnéticas de seleção negativa; 17951RF inclui pontas e tampão |
| Soro fetal bovino | Millipore Sigma | F8067 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD107a | BD Pharmingen | 555800 | |
| Meio de Fixação (Meio A) | Invitrogen | GAS001S100 | |
| GenCRISPR gRNA Construct: Nome: CSF2 RNA guia CRISPR 1; Espécies: Humano, Vetor: pLentiCRISPR v2; Resistência: Ampicilina; Número da cópia: Alto; Preparação de plasmídeo: Entrega padrão: 4 μ g (Gratuito de custo) | GenScript | N/A | pedido personalizado |
| Anticorpo secundário de adsorção cruzada IgG (H+L) de cabra anti-rato, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21235 | |
| https://tide.nki.nl. | Soro AB Humano da Desktop Genetics | ||
| ; Doadores do sexo masculino; tipo AB; US | Corning | 35-060-CI | |
| IFN gama Monoclonal Anticorpo (4S. B3), APC-eFluor 780, eBioscience | Invitrogen | 47-7319-42 | |
| Reagente de Transfecção Lipofectamine 3000 | Invitrogen | L3000075 | |
| LIVE/DEAD Kit de coloração de células mortas Aqua fixáveis, para excitação de 405 nm | Invitrogen | L34966 | |
| Lymphoprep | STEMCELL Technologies | 07851 | |
| Monensin Solution, 1000X | BioLegend | 420701 | |
| Clone anti-humano CD28 do rato CD28.2 | BD Pharmingen | 559770 | |
| Clone anti-humano do rato CD49d 9F10 | BD Pharmingen | 561892 | |
| MIP-1&beta do rato anti-humano; PE-Cy7 | BD Pharmingen | 560687 | |
| Mr. Frosty Recipiente de Congelamento | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| NALM6, clone G5 | celular de leucemia linfoblástica aguda | ATCC | CRL-3273 |
| Água livre de nuclease | Promega | P119C | |
| Sistemas de filtro a vácuo Olympus, 500 mL, membrana PES, 0,22 uM, estéril | Genesee Scientific | 25-227 | |
| Unidades de filtro descartáveis estéreis de fluxo rápido Nalgene com membrana CN 0,45 uM | Thermo Scientific Nalgene | 450-0045 | |
| Opti-MEM I Reduced-Serum Médio (1X), Líquido | Gibco | 31985-070 | |
| PE-CF594 Mouse Anti-Human IL-2 | BD Horizon | 562384 | |
| Penicilina-Estreptomicina-Glutamina (100X), Líquido | Gibco | 10378-016 | |
| Meio de Permeabilização (Meio B) | Invitrogen | GAS002S100 | |
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Invitrogen | K182001 | |
| Cloridrato de puromicina | MP Biomedicals, Inc. | Kit de extração de | |
| gel 0210055210 QIAquick | QIAGEN | 28704 | |
| Rato Anti-Humano GM-CSF BV421 | BD Horizon | 562930 | |
| RoboSep-S | STEMCELL Technologies | 21000 | Separador de Células Totalmente Automatizado |
| SepMate-50 (IVD) | STEMCELL Technologies | 85450 | |
| Azida de Sódio, 5% (p/v) | Ricca Chemical | 7144.8-16 | |
| X-VIVO 15 Meio de Células Hematopoiéticas Sem Soro | Lonza | 04-418Q |
Referências
- Kenderian, S. S., Ruella, M., Gill, S., Kalos, M. Chimeric antigen receptor T-cell therapy to target hematologic malignancies. Cancer Research. 74 (22), 6383-6389 (2014).
- Lim, W. A., June, C. H. The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer. Cell. 168
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
