Summary
Convectie-verbeterde levering (CED) is een methode die een effectieve levering van Therapeutics in de hersenen mogelijk maakt door directe perfusie van grote weefsel volumes. De procedure vereist het gebruik van katheters en een geoptimaliseerde injectieprocedure. Dit protocol beschrijft een methodologie voor CED van een antilichaam in een muis hersenen.
Abstract
Convectie-verbeterde levering (CED) is een neurochirurgische techniek die een effectieve perfusie van grote hersen volumes mogelijk maakt met behulp van een katheter systeem. Een dergelijke aanpak biedt een veilige leveringsmethode door het passeren van de bloed-hersen barrière (BBB), waardoor behandeling met therapieën met slechte BBB-permeabiliteit of die waarvoor systemische blootstelling niet gewenst is, bijvoorbeeld, als gevolg van toxiciteit. CED vereist optimalisatie van het ontwerp van de katheter, injectie protocol en eigenschappen van het infusaat. Met dit protocol beschrijven we hoe u CED uitvoeren van een oplossing die maximaal 20 μg van een antilichaam bevat in het caudaat Putamen van muizen. Het beschrijft de voorbereiding van stap katheters, het testen in vitro en het uitvoeren van het CED in muizen met behulp van een hellend frezen injectie programma. Het protocol kan gemakkelijk worden aangepast voor andere infusievolumes en kan worden gebruikt voor het injecteren van verschillende tracers of farmacologisch actieve of inactieve stoffen, waaronder chemotherapeutica, cytokines, virale deeltjes en liposomen.
Introduction
De bloed-hersen barrière (BBB) vormt een semipermeabele grens die het centrale zenuwstelsel (CZS) scheidt van de bloedsomloop. Het CZS bereiken met Therapeutics is echter noodzakelijk in de context van verschillende ziekten, zoals hersentumoren, de ziekte van Alzheimer (AD) of de ziekte van Parkinson (PD) onder andere1. Dit wordt belangrijk bij de ontwikkeling van nieuwe therapieën, vooral als de geteste drug slechte BBB permeabiliteit vertoont of de systemische blootstelling kan leiden tot gevaarlijke toxiciteit1,2. Sommige van de klinisch gebruikte antilichamen geven beide functies weer. Een oplossing voor dit probleem zou zijn om de Therapeutics direct achter de BBB te leveren.
Convectie-verbeterde levering (CED) is een neurochirurgische techniek die een effectieve perfusie van grote hersen volumes mogelijk maakt. Dit wordt bereikt door operatief een of meer katheters in het doelgebied te installeren. Tijdens de toepassing van de drug, een drukgradiënt wordt gevormd bij de opening van de katheter, die wordt de drijvende kracht van de infusaat dispersie in het weefsel3,4. Het is dus de duur van de infusie en niet de diffusie coëfficiënten die het perfusie bereik2,4,5bepalen. Dit biedt uniforme afgifte van het infusaat over een veel groter hersenvolume in vergelijking met conventionele, diffusie gebaseerde intracerebrale injectie methoden2,6. Op hetzelfde moment, deze levering modaliteit heeft een lager risico op weefselschade2. Dienovereenkomstig kan CED een veilige en doeltreffende toediening van conventionele chemotherapeutica mogelijk maken voor de behandeling van CZS-tumoren, evenals de levering van immunomodulerende middelen of Agonistische en antagonistische antilichamen in een veelheid aan andere CZS-aandoeningen2 ,7,8,9. CED is momenteel getest in therapieën voor de ziekte van Parkinson, de ziekte van Alzheimer, evenals hoogwaardig glioom2,7,8,10,11.
Het ontwerp van de katheter en het injectie regime behoren tot de belangrijkste factoren die van invloed zijn op de uitkomst van CED 10,12,13,14,15,16. Bovendien vereist het specifieke fysisch-chemische eigenschappen van het infusaat, waaronder matige grootte van de deeltjes, een anionische lading en een laag weefsel affiniteit 10,17. Elk van deze parameters moet mogelijk worden aangepast op basis van de histologische kenmerken van de hersenregio om te worden gericht2,10,17.
Hier beschrijven we de methodologie voor het uitvoeren van een antilichaam oplossing in het caudaat Putamen (striatum) van muizen. Bovendien omvat het protocol voorbereiding van stap katheters in een laboratoriumopstelling, het testen ervan in vitro en het uitvoeren van het gdb.
Er zijn meerdere catheter ontwerpen beschikbaar in de literatuur, verschillend door de vorm van de canule, de gebruikte materialen en het aantal katheter openingen12,15,18,19,20 ,21,22. We gebruiken een stap katheter gemaakt van een gesmolten silica capillaire uitsteekt 1 mm van een Blunt end metalen naald. Dit ontwerp van de katheter kan gemakkelijk worden vervaardigd in een onderzoek laboratorium en reproduceerbare geeft goede resultaten bij het testen in vitro met agarose blokken met fysieke parameters die lijkt op hersenen parenchym in vivo23.
Bovendien implementeren we een hellend frezen-regime voor het leveren van 5 μL infusaat in vivo. In een dergelijk protocol wordt de injectiesnelheid verhoogd van 0,2 μL/min tot een maximum van 0,8 μL/min, waardoor de kans op terugvloeiing van infusaten langs de katheter en het risico op weefselbeschadiging wordt geminimaliseerd16. Met dit protocol hebben we met succes muizen met maximaal 20 μg antilichaam toegediend in 5 μL PBS in de loop van 11 min 30 s.
Het protocol kan gemakkelijk worden aangepast voor andere infusievolumes of voor het injecteren van verschillende andere stoffen, bijvoorbeeld chemotherapeutica, cytokines, virale deeltjes of liposomen2,10,14,18 ,22. In het geval van het gebruik van infusaat met drastisch verschillende fysisch-chemische eigenschappen in vergelijking met een fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) of kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF) antilichamen, extra validatiestappen worden aanbevolen. Voor de katheter assemblage, validatie en CED, beschrijven we alle stappen met behulp van een stereotactische robot met een boor en injectie eenheid gemonteerd op een normale stereotactische frame. Deze procedure kan ook worden uitgevoerd met een handmatig Stereotactisch frame dat is aangesloten op een programmeerbare microinfusion-pomp die de beschreven glazen micro spuiten kan rijden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het Zwitserse kantonnale Veterinair Bureau onder licentienummer ZH246/15.
1. voorbereiding van de stap catheters
- Bereiding van een gesmolten silica slang voor de stap van de katheter
- Snijd de gesmolten silica capillaire met inwendige diameter van 0,1 mm en wanddikte van 0,0325 mm buis tot een lengte van 30 mm.
- Bekijk de slang voor scheuren en hitte polijsten de uiteinden met behulp van een microforge om ervoor te zorgen dat de slang openingen een glad oppervlak hebben.
- Fixatie van de binnenbuis in een metalen naald
- Monteer een 27 G naald op een injectiespuit van 10 μL en plaats de spuit in een stereotactische robot.
- Beweeg de spuit met behulp van de robot over een hard oppervlak en raak deze aan met de naaldpunt. Deze positie moet worden genoteerd of opgeslagen in de software, omdat het zal dienen als een referentie oppervlak voor het instellen van de lengte van de katheter stap.
- Verhoog de naald om het plaatsen van de gesmolten silica capillaire binnenkant van de naald in te schakelen
- Plaats het gesmolten silica capillair in de naald zodanig dat 20 mm van het capillair uitsteekt van de naald.
- Verdeel met een pipet gelijkmatig 2 μL hoge viscositeit Cyanoacrylaat lijm over het capillair, beginnend bij de metalen naald en afwerking 10 mm boven het onderste uiteinde van het capillair, zoals afgebeeld in Figuur 2.
- Gebruik de stereotactische robot om de naald te verlagen tot de punt van de metalen naald 1 mm over het referentie oppervlak is. Op deze manier de gesmolten silica capillair zal worden vastgesteld in de metalen naald en zal een 1 mm stap van de punt van de metalen naald te vormen. Verwijder overtollige lijm vormen aan het uiteinde van de metalen naald om te voorkomen dat de stap wordt afstomend.
- Wacht 15 min voor de lijm te harden en verwijder de spuit met de katheter van de stereotactische robot. Bevestig dat bij de stap alle overtollige lijm is verwijderd door het controleren van de punt van de katheter onder een microscoop.
- Het testen van de stap katheter met behulp van een blok van agarose
- Bereid 0,6% agarose oplossing in PBS in een conventionele gelbak en wacht tot het polymeriseert. Snijd de agarose in ongeveer 20 mm x 20 mm blokken. Houd tot het gebruik de blokken ondergedompeld in PBS.
- Vul handmatig de stap katheter spuit met 10 μL van 0,4% oplossing van gefilterd trypaan blauw.
- Verdeel met behulp van de stereotactische robot 1 μL bij 0,2 μL/min om de verzegeling van de stap van de katheter tijdens de fixatie procedure te beoordelen. Trypaanse blauwe oplossing moet alleen zichtbaar zijn op de punt van de katheter. Veeg het af met een papieren tissue.
- Plaats het agarose-blok in de stereotactische robot en Kalibreer de robot zodat de punt van de katheter wordt verwezen naar het oppervlak van het agarose-blok.
- Program meer de injectie parameters voor CED.
- Gebruik voor het injectievolume van 5 μL de volgende stappen: 1 μL bij 0,2 μL/min, vervolgens 2 μL bij 0,5 μL/min en 2 μL bij 0,8 μL/min. pas het uiteindelijke injectievolume aan volgens het specifieke experimentele plan door de duur van elk van de stappen proportioneel te wijzigen.
- Om de oplossing te injecteren in Murine caudaat Putamen (striatum), voert u een dergelijke injectie uit in een positie van 1 mm frontale en 1,5 – 2 mm laterale van bregma op de diepte van 3,5 mm.
- Na de injectie, laat de katheter op zijn plaats voor 2 min en vervolgens intrekken op 1 mm/min om te zorgen voor een goede dispersie van de vloeistof in de hersenen en afdichting van het injectiekanaal tijdens het verwijderen van de katheter.
Opmerking: Afhankelijk van de specifieke stereotactische robot gebruikt, kunnen alle parameters worden geprogrammeerd in een enkel script. Een voorbeeldscript is beschikbaar als aanvullend materiaal..
- Start de CED-procedure en Injecteer 5 μL trypan Blue-oplossing in het agarose-blok.
- Beoordeel de vorm van de wolk van trypan blauw in de agarose en potentiële lekkage langs de katheter tractus. Trypaan blauw moet een ellipsoïde of een ronde wolk vormen met het middelpunt rond de tip van de katheter en een diameter van ten minste 1 mm. Geen grote terugstroming over de punt van de metalen naald moet zichtbaar zijn.
- Plaats een nieuw agarose-blok en start een tweede injectie van 1 μL bij 0,2 μL/min om de verstopping van de katheter met de agarose te beoordelen. Trypan Blue moet opnieuw beginnen met het vormen van een wolk vanaf de punt van de katheter onmiddellijk na het begin van de injectie.
- Bepaal of het overgebleven volume in de spuit overeenkomt met 3 μL. Eventuele variaties kunnen wijzen op een lekkage van vloeistof door de katheter montage of de zuiger van de spuit.
- Als alle test injecties succesvol zijn, de katheter goed verzegeld, recht en geen trypan blauwe oplossing wordt waargenomen vanaf andere plekken dan de katheter tip, was de katheter met gedeïoniseerd H2o (DH2o) totdat er geen sporen van trypan blauw zichtbaar zijn en spoel dan tien keer als volgt: 70% ethanol en 100% ethanol, gevolgd door spoeling met 70% ethanol en schoon gedeïoniseerd water.
- Bewaar de katheter onder droge omstandigheden.
2. convectie-verbeterde levering van antilichaam oplossing in de Muriene hersenen
Opmerking: Afhankelijk van de lokale dierenwelzijns regelgeving kunnen voor deze procedure verschillende soorten anesthetica, analgetica en antibiotica worden toegepast. Dit protocol beschrijft het gebruik van injectie anesthesie. Inhalatie anesthetica zoals Isofluraan kunnen ook worden gebruikt door een neusmasker op het stereotactische frame te monteren. Daarnaast raden we aan om antibiotica toe te voegen aan het drinkwater voor infectie profylaxe.
- Chirurgische installatie
- Anesthetica en tegengif oplossingen voorbereiden. Muizen kunnen veilig worden verdooerd met behulp van een drie-component anesthesie met fentanyl (0,05 mg/kg), midazolam (5 mg/kg) en Medetomidine (0,5 mg/kg) verdund in steriele dH2O. We voeren een twee stappen Wake up procedure met behulp van twee tegengif oplossingen, één bevattende flumazenil (0,5 mg/kg) en buprenorfine (0,1 mg/kg) in steriele dH2O (eerste tegengif oplossing). De tweede bevat atipamezol (2,5 mg/kg) in steriele dH2O (tweede tegengif oplossing).
- Bereiding van de analgesie oplossing met carprofen (5,667 mg/kg) verdund met steriele dH2O.
- Reinig het stereotactische frame, verwarmingskussen en elementen van de stereotactische robot. Houd er rekening mee dat niet alle onderdelen van de robot kunnen worden gereinigd zonder gevaar voor beschadiging. Raadpleeg de handleiding van de robot voor meer informatie over reiniging en voorbereiding voor gebruik.
- Monteer de spuit met de stap katheter en spoel deze meerdere malen af met dH2o, 70% ethanol en 100% ethanol, gevolgd door spoeling met 70% ethanol en DH2o. Spoel ten slotte de spuit met PBS of andere buffers die moeten worden gebruikt voor de bereiding van de oplossing voor intracraniële injectie, bijvoorbeeld kunstmatige cerebrospinale vloeistof. De zuiger van de spuit moet soepel en vrij bewegen tijdens de hele procedure.
- Kalibreer de stereotactische robot software met het stereotactische frame.
- Test de stereotactische robot software door ervoor te zorgen dat de robotarmen vrij bewegen en dat de injectiepomp goed is aangesloten en de CED-procedure zonder enige verstoring kan uitvoeren. Dit omvat het testen van de robot beweging, het inbouwen van de injectie, het controleren van de 2 min wachtende stap en de snelheid van de katheter terugtrekking. Alle parameters moeten voldoen aan de voorgeprogrammeerde CED-procedure zoals beschreven in punt 1.3.5.
- Steek de boor in de boor. Het wordt aanbevolen om de boorijzers te steriliseren voor gebruik.
- Bereid antilichaam oplossing met behulp van PBS of andere bufferoplossingen zoals aCSF. 1 tot 20 μg antilichaam in 5 μL kan in één enkele procedure worden geïnjecteerd. Andere volumes en eiwit bedragen moeten worden getest voordat het experiment wordt uitgevoerd. Houd er rekening mee dat het gebruik van oplossingen met hoge viscositeit kan leiden tot verstopping van de katheter.
- Laad de spuit handmatig met het verdunde antilichaam.
- Antilichaam injectie door CED in striatum
- Weeg de muis en Injecteer de drie-componenten anesthesie oplossing in het peritoneum volgens het lichaamsgewicht. Noteer de injectie tijd. Breng de muis over naar een aparte kooi die wordt verwarmd met een verwarmingskussen.
- Let op de muis om te bepalen wanneer de sedatie begint. Zodra de muis stopt met bewegen, breng oftalmische zalf op de ogen om het hoornvlies te beschermen tegen uitdroging tijdens de operatie. Volledige sedatie begint meestal 10 – 15 min van de injectie van de drie-componenten anesthesie oplossing.
- Controleer pijn reacties met behulp van de pinch-reflex test om volledige anesthesie van het dier te garanderen.
- Scheer het hoofd met een haar trimmer.
- Desinfecteer de huid met wattenstaafjes gedrenkt in jodiumoplossing. Scrub de huid drie keer in cirkelvormige beweging.
- Maak met behulp van een scalpel een 10 mm huid incisie langs de craniale middellijn afwerking op het oogniveau.
- Bevestig de muis in het Stereotactisch frame met behulp van de neusklem en oorstangen. Zorg ervoor dat het schedel oppervlak horizontaal en stevig is vastgezet. Afgezien van de juiste anatomische navigatie is dit ook cruciaal om het kantelen van de schedel tijdens het boren en de CED-procedure te voorkomen.
- Plaats de spuit in de stereotactische robot.
- Synchroniseer de boor met de punt van de katheter op een referentiepunt. Het is van cruciaal belang dat de relatie tussen de positie van de boor en de spuit precies in de software wordt bepaald, zodat de injectie kan worden uitgevoerd in de gewenste anatomische regio van de hersenen.
- Trek de huid aan met behulp van een tang en lokaliseer bregma op het schedel oppervlak.
- Referentie bregma in de software met behulp van de punt van de boor.
- Beweeg de boor naar een positie 1 mm frontale en 2 mm laterale van bregma en boor een Braam gat. Zorg ervoor dat u de dura mater niet beschadigt.
- Beweeg de spuit over het Braam gat.
- Doseer 0,5 – 1 μL van de spuit om er zeker van te zijn dat er geen luchtbellen in de katheter achterblijven.
- Start het CED-programma zoals beschreven in punt 1.3.5. Observeer het schedel oppervlak voor alle sporen van vloeibare terugstroming vanaf de injectieplaats. Controleer de ademhalingssnelheid van het dier.
- Zodra het CED-programma voorbij is en de katheter uit de hersenen wordt gehaald, start u de injectiepomp op 0,2 μL/min om te controleren of de katheter verstopt is tijdens het CED. Als er geen verstopping is opgetreden, moet u onmiddellijk een druppeltje injectie mengsel zien dat afkomstig is van de tip van de katheter.
- Voordat u de katheter opnieuw gebruikt of opslaat, onderzoekt u de katheter stap visueel op tekenen van beschadiging of slijtage onder een microscoop en reinig deze zoals in stap 1.3.10.
- Wakker procedure
- Verwijder voorzichtig de muis uit het stereotactische frame.
- Was de operatieplaats met steriele zoutoplossing.
- Met behulp van een tang, vul het Braam gat met bot wax.
- Sluit de huid met een dun getipt Tang en breng een chirurgische lijm aan met een pipet van 10 μL over de snede. Wacht 15 – 30 s voor de lijm te polymeriseren.
- Breng analgesie oplossing aan via subcutane injectie. Noteer het tijdstip van de injectie.
- Breng de eerste tegengif-oplossing aan. Noteer het tijdstip van de injectie.
- Breng de muis over naar een aparte kooi met een verwarmingskussen en bewaak het dier voor schrikreactie reflexen.
- Als de muis niet volledig bewusteloosheid heeft gekregen 15 min na toediening van de eerste antidotum oplossing, breng de tweede antidotum oplossing door subcutane injectie.
- Bewaak dieren tijdens de herstelfase.
- Check 1 – 2 h later en de volgende dag voor postoperatieve complicaties. Indien nodig, opnieuw aanbrengen van de analgesie.
- Voor infectie profylaxe, voeg sulfadoxine (eindconcentratie 0,08% w/v) en trimethoprim (eindconcentratie 0,016% w/v) toe aan drinkwater waarop de dieren gedurende 1 week na de operatie toegang hebben tot ad libitum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol maakt het voorbereiden van stap katheters (Figuur 1) mogelijk voor gebruik in de CED-procedure in een laboratoriumomgeving. Om de katheters te controleren op lekkage, reflux langs het naald kanaal en verstopping, raden we aan om injecties van een kleurstof, bijvoorbeeld trypaanse blauwe oplossing, uit te voeren in een agarose-blok. Figuur 3 toont een wolk van trypaanse blauwe vorming na injectie van 1 μl bij 0,5 μL/minuut met behulp van een CED-katheter (Figuur 3a). Geen reflux langs het naald kanaal was zichtbaar over het begin van de katheter stap. Bovendien vormde de verspreide wolk een gewenste bolvorm. Dit is in tegenstelling tot de resultaten verkregen met behulp van een conventionele 27 G botte eind naald (Figuur 3b), waar significante reflux kan worden waargenomen.
Bovendien vereist CED een geoptimaliseerde injectieprocedure. Figuur 4 toont de resultaten van het injecteren van 2 μl trypaan blauw in een agarose blok met behulp van de in het protocol beschreven procedure (a) in vergelijking met een injectie met een constante snelheid van 2 μL/minuut (B). Hoge injectiesnelheid dwong de reflux langs de katheter, zelfs wanneer een CED katheter werd gebruikt.
Tot slot, zoals weergegeven in Figuur 5, CED maakt perfusie van grote hoeveelheden van de Murine hersenen. Muizen werden geïnjecteerd met een rat anti-muis TNFα-antilichaam gecombineerd met FITC-dextran in 5 μL PBS in CED (bovenste paneel) of door een conventionele bolusinjectie (onderste paneel). Het perfusie Profiel van CED was gelijkmatiger dan bij conventionele injectie en er kon minder weefselbeschadiging worden waargenomen. In beide gevallen was er een typisch distributie Profiel van antilichamen en dextran deeltjes over het corpus callosum. Het dispersie Profiel van het geïnjecteerde antilichaam was echter diffuus dan de dextran met een hoog molecuulgewicht, en illustreert de verschillen in verdeling tussen verschillende infusaten.
Afbeelding 1: een schematische tekening die de CED-stap katheter tip weergeeft. Frontale (A) en zijkant (B) views. Schema is niet op schaal. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: een schematische tekening die het toepassingsgebied van de lijm weergeeft. De bovenste 10 mm van de gesmolten silica slang worden in de metalen naald gestoken. Breng de lijm aan op de 10 mm slang vanaf de punt van de metalen naald. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: vergelijking van infusie resultaten met behulp van CED katheter of een bot-end naald. Een injectie van 1 μL van 0,4% trypan blauw in een 0,6% agarose-blok bij 0,5 μL/minuut met behulp van een CED katheter (a) en een 27g stompe-eind naald (B). Foto's genomen onmiddellijk na de katheter of naald terugtrekking. Kruis markeert de punt van de katheter of naald. Schaalbalk = 5 mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: vergelijking van de infusie resultaten van het hellend frezen-protocol met een steady-rate protocol. Injectie van 2 μL 0,4% trypan blauw in 0,6% agarose-blok met behulp van een hellend frezen-Protocol (0,4 μl bij 0,2 μL/min, dan 0,8 μl bij 0,5 μl/min en 0,8 μl bij 0,8 μl/min (a) of een 2 μL/min steady-rate injectie Protocol (B). In beide gevallen werd een CED katheter gebruikt. Foto's genomen onmiddellijk na de katheter terugtrekking. Kruis markeert de punt van de katheter. Schaalbalk = 5 mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: representatieve resultaten van murinestriatum perfusie door CED of door conventionele bolusinjectie. Muizen werden geïnjecteerd in het striatum (positie 1 mm frontale en 2 mm laterale van bregma, diepte van 3,5 mm) met 1 μg rat anti-muis TNFα gecombineerd met 1 μg FITC-dextran met het molecuulgewicht 2.000 kDa in 5 μL PBS. (Bovenste paneel) of een conventionele bolusinjectie (27 G naald, injectiesnelheid 1 μL/minuut) werd uitgevoerd (onder). Muizen werden onmiddellijk na de CED-procedure geofferd door co2 -asphyxiatie en geperfundeerd met 4% formaldehyde in PBS. Hersenen werden ontleed en bovendien opgelost met 4% formaldehyde in PBS bij 4 °C gedurende 24 uur. Vervolgens werden de hersenen gewassen met 15% sucrose voor 60 min en overgebracht naar 30% sucrose bij 4 °C. Na 24 uur werden de hersenen bevroren op droogijs. Vrij zwevende delen (25 μm) werden bevlekt met behulp van polyklonale geit anti-rat IgG (H + L) antilichaam in combinatie met Alexa Fluor 647 en contra gekleurd met DAPI. Afbeeldingen werden verwerkt met behulp van de Fiji-distributie van ImageJ. 10x vergroting, schaalbalk = 5 mm. 4 muizen per groep; Er wordt een representatieve afbeelding weergegeven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Convectie-verbeterde levering, of druk-gemedieerde drug infusie in de hersenen, werd voor het eerst voorgesteld in de vroege 19903. Deze aanpak belooft perfusie van grote hersen volumes achter de bloed-hersen barrière op een gecontroleerde manier2. Echter, tot nu toe, slechts een paar klinische proeven zijn uitgevoerd met behulp van deze aanpak, deels omdat CED in een klinische Setup is gebleken technisch veeleisend zijn24,25. Recente ontwikkelingen in het ontwerp en de infusie Programma's van de katheter lijken deze technische moeilijkheden8,19te hebben overwonnen. Vooruitgang in de klinische uitvoering van therapeutische antilichamen, met inbegrip van de komst van immunomodulerende controlepunt blokkerende agentia, wacht op toepassing bij de behandeling van CZS-aandoeningen10. Deze ontwikkeling kan sterk worden aangevuld door het gebruik van CED in de experimentele Setup, zoals het gebruiken van kleine knaagdieren modellen.
Verschillende CZS-ziekte modellen zijn verkrijgbaar in muizen. Deze omvatten experimentele auto-immune encefalomyelitis (EAE) voor multiple sclerose (MS) en genetisch gemanipuleerde modellen voor de ziekte van Alzheimer (AD), de ziekte van Parkinson (PD), of voor hersenkanker. Veel hersenen tumor modellen ook vertrouwen op orthotopic tumor inoculatie van Murine glioom cellijnen of implantatie van patiënt-afgeleide xenografts. Dit protocol maakt het mogelijk om antilichamen oplossingen rechtstreeks in specifieke anatomische locaties te leveren, waardoor het lijkt op therapeutische procedures. Het kan worden geïmplementeerd in verschillende experimentele lay-outs waar de levering van antilichamen in een nauwkeurig hersengebied een cruciale rol speelt.
De kritische factor bij het uitvoeren van CED bij muizen is de beschikbaarheid van catheters. Dit protocol bevat een precieze beschrijving hoe een stap katheter monteren en testen in een reeks in vitro experimenten. Men moet in gedachten houden dat de gesmolten silica waarvan de stap slang is gemaakt een broos materiaal is en de kwaliteit van CED met een bepaalde katheter kan afnemen na verloop van tijd. Het wordt aanbevolen om de parameters van de stap katheters tussen de in vivo experimenten te controleren door herhaling van de in vitro tests beschreven in het protocol sectie 1,3.
Het protocol kan worden aangepast voor verschillende injectievolumes, soorten infusaat en hersengebieden. Het injectievolume kan worden gemanipuleerd door de duur van de injectie stappen proportioneel te wijzigen. Hier beschrijven we infusie van 5 μL, maar CED met 10 μL antilichaam oplossing is gemeld in de literatuur met behulp van een soortgelijke aanpak in Murine hersenen tumor modellen, het bereiken van uitstekende weefseldistributie en perfusie volumes enorm meer bolusinjectie7 . Bovendien zijn tot 28 μL infusaat-volumes gerapporteerd met behulp van CED voor de toepassing van vloeistoffen in de rat hersenen22,26. Niet-proteinaceeuze stoffen kunnen ook worden geïnjecteerd door CED, in gedachten houden dat het infusaat niet van hoge viscositeit mag zijn om verstopping van de smalle katheter tip te voorkomen. Met behulp van liposomen is aangetoond dat de lading van de geïnfundeerde moleculen de weefsel penetratie enorm kan beïnvloeden, waarbij neutrale of negatief geladen deeltjes kunnen worden verdeeld over de grootste volumes22. Zoals afgebeeld in Figuur 5, FITC-dextran en antilichaam verspreiden verschillend: Hoewel zowel antilichaam en FITC-dextran verdelen op dezelfde wijze langs het corpus callosum, het antilichaam penetratie van hersen parenchym is diffuus dan voor FITC-dextran, die een kleinere straal en een meer vlekkerig distributie patroon vertoont. Dit onderstreept de verschillen in CED-profiel tussen infusaten met variërende fysisch-chemische eigenschappen.
Bovendien werd het in Figuur 5 beschreven gdb-experiment uitgevoerd, waarbij een anti-muis TNFα-antilichaam werd injecterend in gezonde muizen, dus uitgaande van een minimale streefwaarde in het striatum. Aanwezigheid van verwant antigeen zal het weefseldistributie patroon veranderen. Het kan verder worden beïnvloed door inhomogene weefsels op een anatomische plaats, zoals afgebeeld in Figuur 5 door verdeling van het infusaat langs het corpus callosum.
Ten slotte wordt CED beïnvloed door de stroom van interstitiële vloeistof, die in het geval van striatum-injectie het infusaat naar de laterale ventrikels27kan spoelen. Inderdaad, zelfs wanneer het weefsel onmiddellijk na het afronden van het afwerken wordt bevestigd, kunnen we een duidelijke hechting van het geïnjecteerde antilichaam aan de ventrikel wand waarnemen (Figuur 5). Dit kan verder worden beïnvloed door pathologische omstandigheden van het CZS, bijvoorbeeld in de context van hersentumoren. Focale necrose, vaak waargenomen in hoge graad hersentumoren28, kan de stroom van interstitiële vloeistof beïnvloeden en aldus het verdelings patroon van het infusaat29veranderen. Andere pathologische aandoeningen die kunnen leiden tot veranderde weefseldistributie van infusaat in vergelijking met gezonde parenchym omvatten beroerte of traumatisch hersenletsel30. Samenvattend, elke reeks van CED experimenten moet zorgvuldig worden gevalideerd om te zorgen voor een succesvolle perfusie van de doelregio van de hersenen.
Momenteel gebruiken onderzoekers vaak implanteerbare osmotische pompen om stoffen in het CSF of de hersenen (tumor) parenchym31,32,33te leveren. In bepaalde gevallen kan CED, zoals hier beschreven, als alternatief worden gebruikt. Het kan meerdere malen worden uitgevoerd met frequenties afhankelijk van de hersenregio, type infusate, volume en anesthesie protocol gebruikt. Intermitterende geneesmiddelafgifte kan met name relevant zijn wanneer een verlengde blootstelling aan het infusaat leidt tot tolerantie of systemische bijwerkingen. Het is denkbaar dat in gevallen waarin hoge retentie-en halfwaardetijd-infusaten worden afgeleverd, deze aanpak een verfijning volgens het 3R-principe zou betekenen, aangezien geen implantatie van de pomp nodig zou zijn. Concluderend, dit protocol beschrijft een efficiënte manier om grote hoeveelheden antilichaam oplossing in het murinestriatum te gebruiken en kan worden aangepast voor andere hersengebieden en soorten infusaat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Johannes vom berg wordt genoemd als uitvinder van de octrooiaanvraag (PCT/EP2012/070088) van de Universiteit van Zürich. Michal Beffinger, Linda Schellhammer en Johannes vom berg worden genoemd als uitvinders van een octrooiaanvraag (EP19166231) van de Universiteit van Zürich. De auteurs hebben geen extra financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door subsidies van de Universiteit van Zürich (FK-15-057), de Novartis Foundation voor medisch-biologisch onderzoek (16C231) en Zwitsers kankeronderzoek (KFS-3852-02-2016, KFS-4146-02-2017) aan Johannes vom berg en brug proof of concept (20B1-1 _177300) naar Linda Schellhammer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 μL syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 27 G blunt end needle | Hamilton | 7762-01 | |
| Agarose | Promega | V3121 | |
| Atipamezol | Janssen | ||
| Bone wax | Braun | 1029754 | |
| Buprenorphine | Indivior Schweiz AG | ||
| Carprofen | Pfizer AG | ||
| Dental drill bits, steel, size ISO 009 | Hager & Meisinger | 1RF009 | |
| Ethanol 100% | Reuss-Chemie AG | 179-VL03K-/1 | |
| Fentanyl | Helvepharm AG | ||
| FITC-Dextran, 2000 kDa | Sigma Aldrich | FD2000S | |
| Flumazenil | Labatec Pharma AG | ||
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775-500ML | |
| High viscosity cyanoacrylate glue | Migros | ||
| Iodine solution | Mundipharma | ||
| Medetomidin | Orion Pharma AG | ||
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| Midazolam | Roche Pharma AG | ||
| Ophthalmic ointment | Bausch + Lomb | Vitamin A Blache | |
| PBS | ThermoFischer Scientific | 10010023 | |
| Polyclonal goat anti-rat IgG (H+L) antibody coupled with Alexa Fluor 647 | Jackson Immuno | ||
| Scalpels | Braun | BB518 | |
| Silica tubing internal diameter 0.1 mm, wall thickness of 0.0325 mm | Postnova | Z-FSS-100165 | |
| Stereotactic frame for mice | Stoelting | 51615 | |
| Stereotactic robot | Neurostar | Drill and Injection Robot | |
| Succrose | Sigma Aldrich | S0389-500G | |
| Topical tissue adhesive | Zoetis | GLUture | |
| Trypan blue | ThermoFischer Scientific | 15250061 | |
| Water | Bichsel | 1000004 |
References
- Scherrmann, J. M.
- Barua, N. U., Gill, S. S. Convection-enhanced drug delivery: prospects for glioblastoma treatment. CNS Oncology. 3 (5), 313-316 (2014).
- Bobo, R. H., et al.
- Morrison, P. F., Laske, D. W., Bobo, H., Oldfield, E. H., Dedrick, R. L. High-flow microinfusion: tissue penetration and pharmacodynamics. American Journal of Physiology. 266 (1 Pt 2), R292-R305 (1994).
- Zhou, Z., Singh, R., Souweidane, M. M. Convection-Enhanced Delivery for diffuse intrinsic pontine glioma treatment. Current Neuropharmacology. 15 (1), 116-128 (2017).
- Barua, N. U., et al. Intrastriatal convection-enhanced delivery results in widespread perivascular distribution in a pre-clinical model. Fluids and Barriers of the CNS. 9 (1), 2 (2012).
- Shoji, T., et al. Local convection-enhanced delivery of an anti-CD40 agonistic monoclonal antibody induces antitumor effects in mouse glioma models. Neuro-Oncology. 18 (8), 1120-1128 (2016).
- Souweidane, M. M., et al. Convection-enhanced delivery for diffuse intrinsic pontine glioma: a single-centre, dose-escalation, phase 1 trial. The Lancet Oncology. , (2018).
- Zhang, X., et al. Targeting immune checkpoints in malignant glioma. Oncotarget. 8 (4), 7157-7174 (2017).
- Barua, N. U., Gill, S. S., Love, S. Convection-enhanced drug delivery to the brain: therapeutic potential and neuropathological considerations. Brain Pathology. 24 (2), 117-127 (2014).
- Mehta, A. M., Sonabend, A. M., Bruce, J. N.
- Krauze, M. T., et al. Reflux-free cannula for convection-enhanced high-speed delivery of therapeutic agents. Journal of Neurosurgery. 103 (5), 923-929 (2005).
- Nash, K. R., Gordon, M. N. Convection Enhanced Delivery of Recombinant Adeno-associated Virus into the Mouse Brain. Methods in Molecular Biology. 1382, 285-295 (2016).
- Ohlfest, J. R., et al. Combinatorial antiangiogenic gene therapy by nonviral gene transfer using the sleeping beauty transposon causes tumor regression and improves survival in mice bearing intracranial human glioblastoma. Molecular Therapy. 12 (5), 778-788 (2005).
- Yin, D., Forsayeth, J., Bankiewicz, K. S. Optimized cannula design and placement for convection-enhanced delivery in rat striatum. Journal of Neuroscience Methods. 187 (1), 46-51 (2010).
- Mamot, C., et al. Extensive distribution of liposomes in rodent brains and brain tumors following convection-enhanced delivery. Journal of Neuro-Oncology. 68 (1), 1-9 (2004).
- Saito, R., et al. Tissue affinity of the infusate affects the distribution volume during convection-enhanced delivery into rodent brains: implications for local drug delivery. Journal of Neuroscience Methods. 154 (1-2), 225-232 (2006).
- Oh, S., et al. Improved distribution of small molecules and viral vectors in the murine brain using a hollow fiber catheter. Journal of Neurosurgery. 107 (3), 568-577 (2007).
- Barua, N. U., et al. A novel implantable catheter system with transcutaneous port for intermittent convection-enhanced delivery of carboplatin for recurrent glioblastoma. Drug Delivery. 23 (1), 167-173 (2016).
- Rosenbluth, K. H., et al. Design of an in-dwelling cannula for convection-enhanced delivery. Journal of Neuroscience Methods. 196 (1), 118-123 (2011).
- Debinski, W., Tatter, S. B. Convection-enhanced delivery for the treatment of brain tumors. Expert Review of Neurotherapeutics. 9 (10), 1519-1527 (2009).
- MacKay, J. A., Deen, D. F., Szoka, F. C. Jr Distribution in brain of liposomes after convection enhanced delivery; modulation by particle charge, particle diameter, and presence of steric coating. Brain Research. 1035 (2), 139-153 (2005).
- Chen, Z. J., et al. A realistic brain tissue phantom for intraparenchymal infusion studies. Journal of Neurosurgery. 101 (2), 314-322 (2004).
- Sampson, J. H., et al. Poor drug distribution as a possible explanation for the results of the PRECISE trial. Journal of Neurosurgery. 113 (2), 301-309 (2010).
- Wick, W., Weller, M., et al. Trabedersen to target transforming growth factor-beta: when the journey is not the reward, in reference to Bogdahn et al. (Neuro-Oncology 2011;13:132-142). Neuro-Oncology. 13 (5), author reply 561-552 559-560 (2011).
- Saito, R., Tominaga, T. Convection-enhanced delivery of therapeutics for malignant gliomas. Neurologia Medico-Chirurgica. 57 (1), 8-16 (2017).
- Bedussi, B., et al. Clearance from the mouse brain by convection of interstitial fluid towards the ventricular system. Fluids Barriers CNS. 12, 23 (2015).
- Noroxe, D. S., Poulsen, H. S., Lassen, U. Hallmarks of glioblastoma: a systematic review. ESMO Open. 1 (6), e000144 (2016).
- Boucher, Y., Salehi, H., Witwer, B., Harsh, G. R. t, Jain, R. K. Interstitial fluid pressure in intracranial tumours in patients and in rodents. British Journal of Cancer. 75 (6), 829-836 (1997).
- Glushakova, O. Y., et al. Prospective clinical biomarkers of caspase-mediated apoptosis associated with neuronal and neurovascular damage following stroke and other severe brain injuries: Implications for chronic neurodegeneration. Brain Circulation. 3 (2), 87-108 (2017).
- Vom Berg, J., et al. Inhibition of IL-12/IL-23 signaling reduces Alzheimer's disease-like pathology and cognitive decline. Nature Medicine. 18 (12), 1812-1819 (2012).
- Vom Berg, J., et al. Intratumoral IL-12 combined with CTLA-4 blockade elicits T cell-mediated glioma rejection. Journal of Experimental Medicine. 210 (13), 2803-2811 (2013).
- Kurdi, A., et al. Continuous administration of the mTORC1 inhibitor everolimus induces tolerance and decreases autophagy in mice. British Journal of Pharmacology. 173 (23), 3359-3371 (2016).
