Summary
Konvektion-förstärkt leverans (CED) är en metod som möjliggör effektiv tillförsel av Therapeutics in i hjärnan genom direkt perfusion av stora vävnads volymer. Förfarandet kräver användning av katetrar och en optimerad injektion förfarande. Detta protokoll beskriver en metod för CED av en antikropp i en mushjärna.
Abstract
Konvektion-förstärkt leverans (CED) är en Neurokirurgisk teknik som möjliggör effektiv perfusion av stora hjärn volymer med hjälp av en kateter system. Ett sådant tillvägagångssätt ger en säker leveransmetod genom att passera blod-hjärnbarriären (BBB), vilket möjliggör behandling med Therapeutics med dålig BBB-permeabilitet eller de för vilka systemisk exponering inte önskas, t. ex., på grund av toxicitet. CED kräver optimering av kateter design, injektion protokoll och egenskaper av Infusat. Med detta protokoll beskriver vi hur man utför en lösning som innehåller upp till 20 μg av en antikropp in i caudaten putamen av möss. Det beskriver beredning av steg katetrar, testa dem in vitro och utföra CED i möss med hjälp av en rampning injektion program. Protokollet kan lätt justeras för andra infusionsvolymer och kan användas för att injicera olika spårämnen eller farmakologiskt aktiva eller inaktiva substanser, inklusive kemoterapeutika, cytokiner, virala partiklar och liposomer.
Introduction
Blod-hjärnbarriären (BBB) bildar en semipermeable gränsa som avskiljer det centralanervsystemet (CNS) från blodcirkulationen. Att nå CNS med Therapeutics är dock nödvändigt i samband med olika sjukdomar, som hjärntumörer, Alzheimers sjukdom (AD) eller Parkinsons sjukdom (PD) bland andra1. Detta blir viktigt i utvecklingen av nya terapier, särskilt om den testade drogen uppvisar dålig BBB permeabilitet eller dess systemiska exponering kan leda till farlig toxicitet1,2. Några av de kliniskt använda antikropparna visar båda dessa funktioner. En lösning på detta problem skulle vara att leverera Therapeutics direkt bakom BBB.
Konvektion-förstärkt leverans (CED) är en Neurokirurgisk teknik som möjliggör effektiv perfusion av stora hjärn volymer. Detta uppnås genom kirurgiskt installera en eller flera katetrar i målområdet. Under drogen ansökan, en tryckgradient bildas vid öppnandet av katetern, som blir den drivande kraften i infusate dispersion i vävnaden3,4. Det är således varaktigheten av infusion och inte diffusions koefficienter som bestämmer perfusion Range2,4,5. Detta ger enhetlig leverans av Infusat över en mycket större hjärnvolym jämfört med konventionella, diffusion baserade intracerebral injektions metoder2,6. Samtidigt har denna leverans modalitet en lägre risk för vävnadsskada2. Följaktligen, CED kan möjliggöra säker och effektiv administrering av konventionella kemoterapeutika för behandling av CNS-tumörer, samt leverans av immunmodulerande medel eller agonistiska och antagonistiska antikroppar i en mängd andra CNS-sjukdomar2 ,7,8,9. CED testas för närvarande i terapier av Parkinsons sjukdom, Alzheimers sjukdom, samt höggradig gliom2,7,8,10,11.
Kateter design och injektion regim är bland de viktigaste faktorerna som påverkar resultatet av CED 10,12,13,14,15,16. Dessutom kräver det specifika fysikalisk-kemiska egenskaper hos Infusat, inklusive måttlig partikelstorlek, anjonladdning och låg vävnads tillhörighet 10,17. Var och en av dessa parametrar måste potentiellt justeras enligt de histologiska funktionerna i hjärnregionen för att vara riktad2,10,17.
Här beskriver vi metoder för att utföra en antikropps lösning i caudatum putamen (striatum) av möss. Dessutom innehåller protokollet beredning av steg katetrar i ett laboratorium setup, testa dem in vitro-och utföra CED.
Det finns flera kateter mönster finns i litteraturen, skiljer sig genom formen på kanyl, de material som används och antalet kateter öppningar12,15,18,19,20 ,21,22. Vi använder en steg kateter gjord av en smält kiseldioxid kapillär utskjutande 1 mm från en trubbig ände metall nål. Denna kateter design kan lätt tillverkas i ett forskningslaboratorium och reproducerbart ger bra CED resultat när testas in vitro med aguppstod block med fysiska parametrar som liknar hjärnparenkymet in vivo23.
Dessutom implementerar vi en rampningsregim för att leverera 5 μL Infusat in vivo. I ett sådant protokoll ökas insprutnings hastigheten från 0,2 μL/min till maximalt 0,8 μL/min, vilket minimerar risken för reflux längs katetern samt risk för vävnadsskada16. Med detta protokoll har vi framgångsrikt administrerat möss med upp till 20 μg antikroppar i 5 μL PBS under loppet av 11 min 30 s.
Protokollet kan lätt justeras för andra infusionsvolymer eller för injicering av olika andra substanser, t. ex. kemoterapeutika, cytokiner, virala partiklar eller liposomer2,10,14,18 ,22. I händelse av att använda Infusat med drastiskt olika fysikalisk-kemiska egenskaper jämfört med en fosfatbuffrad saltlösning (PBS) eller konstgjord cerebrospinalvätska (aCSF) lösningen av antikroppar, ytterligare validerings steg rekommenderas. För kateter montering, validering och CED, beskriver vi alla steg med hjälp av en stereotaktisk robot med en borr-och insprutningsenhet monterad på en vanlig stereotaktisk ram. Detta förfarande kan också utföras med en manuell stereotaktisk ram ansluten till programmerbara mikroinfusionspump som kan köra de beskrivna glas mikrosprutor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder som beskrivs här har godkänts av Swiss cantonal Veterinary Office under licensnummer ZH246/15.
1. beredning av steg katetrar
- Beredning av en smält kiseldioxid slangar för steg av katetern
- Skär den brända kiseldioxid kapillär med innerdiameter 0,1 mm och väggtjockleken på 0,0325 mm slangar till en längd av 30 mm.
- Undersök slangen för sprickor och värm polera ändarna med hjälp av en microforge att säkerställa slangen öppningar har en slät yta.
- Fixering av innerröret i en metallnål
- Montera en 27 G nål på en 10 μL spruta och placera sprutan i en stereotaktisk robot.
- Använd roboten och flytta sprutan över en hård yta och vidrör den med nålspetsen. Denna position bör noteras eller sparas i programvaran eftersom det kommer att fungera som en referensyta för att ställa in längden på kateter steg.
- Höj nålen för att möjliggöra placering av smält kiseldioxid kapillär insidan av nålen
- Placera smält kiseldioxid kapillär i nålen så att 20 mm av kapillär sticker ut från nålen.
- Använd en pipett för att jämnt fördela 2 μL högviskositetscyanoakrylatlim över kapillär, med början från metallnålen och efter 10 mm över den nedre änden av kapillär, som avbildas i figur 2.
- Använd den stereotaktiska roboten och sänk nålen tills spetsen på metallnålen är 1 mm över referensytan. Detta sätt smält kiseldioxid kapillär kommer att fastställas i metall nål och kommer att bilda en 1 mm steg från spetsen av metallen nålen. Ta bort eventuellt överskott av lim bildas i slutet av metallen nålen för att undvika avtrummar steget.
- Vänta 15 min för limmet att härda och ta bort sprutan med katetern från stereotaktisk roboten. Bekräfta att vid steg allt överflödigt lim har avlägsnats genom att kontrollera spetsen av katetern under ett mikroskop.
- Testa steg katetern med ett block av aguppstod
- Förbered 0,6% aguppstod lösning i PBS i en konventionell gel bricka och vänta tills den Polymeriserar. Skär aguppstod i ca 20 mm x 20 mm block. Håll blocken nedsänkta i PBS tills de används.
- Fyll manuellt i steg kateter sprutan med 10 μL 0,4% lösning av filtrerat trypan Blue.
- Använd den stereotaktiska roboten och fördela 1 μL vid 0,2 μL/min för att bedöma tätningen av kateterns steg under fixeringsproceduren. Trypan blå lösning ska vara synlig endast på spetsen av katetern. Torka av den med en pappers vävnad.
- Placera Agam blocket i den stereotaktisk roboten och kalibrera roboten så att spetsen på katetern refereras mot ytan av Agam blocket.
- Program mera injektions parametrarna för CED.
- För injektionsvolymen på 5 μL, Använd följande steg: 1 μL vid 0,2 μL/min, därefter 2 μL vid 0,5 μL/min och 2 μL vid 0,8 μL/min. Justera den slutliga injektionsvolymen enligt den specifika experiment planen genom att proportionellt ändra varaktigheten för varje steg.
- För att injicera lösningen i murina caudatum putamen (striatum), utföra en sådan injektion i en position 1 mm frontal och 1.5-2 mm laterala från bregma på djupet av 3,5 mm.
- Efter injektionen, lämna katetern på plats för 2 min och sedan dra upp på 1 mm/min för att säkerställa korrekt spridning av vätskan i hjärnan och tätning av injektionsstället under kateter avlägsnande.
Anmärkning: Beroende på den specifika stereo taktiska roboten som används kan alla parametrar programmeras in i ett enda skript. Ett exempelskript finns som tilläggs material..
- Starta CED-proceduren och injicera 5 μL trypan Blue-lösning i agandeblocket.
- Bedöm formen av moln av trypan blått i aganget och potentiellt läckage längs kateter tarmkanalen. Trypan Blue ska bilda en ellipsoid eller ett runt moln med centrum runt kateterspetsen och en diameter på minst 1 mm. Inga större återflöde över spetsen av metallen nålen bör vara synlig.
- Placera ett nytt agrasblock och påbörja en andra injektion av 1 μL vid 0,2 μL/min för att bedöma igensättning av katetern med Agros. Trypan blå ska återigen börja bilda ett moln från spetsen av katetern omedelbart efter början av injektionen.
- Bedöma om den kvarvarande volymen i sprutan motsvarar 3 μL. Eventuella variationer kan peka mot ett läckage av vätska genom katetern montering eller spruta kolven.
- Om alla test injektioner är framgångsrika, katetern är väl förseglad, rak och ingen trypan blå lösning observeras från andra ställen än kateterspetsen, tvätta katetern med avjoniserat H2o (DH2o) tills inga spår av trypan blå är synliga och sedan tvätta tio gånger enligt följande: 70% etanol och 100% etanol följt av spolning igen med 70% etanol och rent avjoniserat vatten.
- Förvara katetern under torra förhållanden.
2. konvektion-förbättrad leverans av antikropps lösning i murina hjärnan
Anmärkning: Beroende på lokala djurskyddsbestämmelser, olika typer av anestetika, analgetika och antibiotika kan genomföras för detta förfarande. Detta protokoll beskriver användningen av injektion anestesi. Inhalationsanestetika som isofluran kan också användas genom att montera en näs mask på den stereotaktiska ramen. Dessutom rekommenderar vi att tillsätta antibiotika till dricksvattnet för infektions profylax.
- Kirurgisk installation
- Förbered bedövningsmedel och motgift lösningar. Möss kan på ett säkert sätt sövda med hjälp av en tre-komponent anestesi innehållande fentanyl (0,05 mg/kg), midazolam (5 mg/kg) och Medetomidin (0,5 mg/kg) utspädd i steril DH2O. Vi utför en två-stegs Väcknings procedur med hjälp av två motgift lösningar, en som innehåller Flumazenil (0,5 mg/kg) och buprenorfin (0,1 mg/kg) i steril dH2O (första antidot lösning). Den andra innehåller atipamezol (2,5 mg/kg) i steril DH2O (andra motgift lösning).
- Bered analgesilösning som innehåller karprofen (5,667 mg/kg) utspädd med steril dH2O.
- Rengör stereotaktisk ram, värmedyna och delar av den stereotaktisk roboten. Tänk på att inte alla delar av roboten kan rengöras utan risk för skador. Se robotens bruksanvisning för mer information om rengöring och förberedelse för användning.
- Montera sprutan med steg katetern och spola den flera gånger med dH2o, 70% etanol och 100% etanol följt av spolning igen med 70% etanol och DH2o. Slutligen, spola sprutan med PBS eller andra buffertar som ska användas för beredning av lösningen för intrakraniell injektion, e.g. konstgjord cerebrospinalvätska. Sprutkolven ska röra sig smidigt och fritt under hela proceduren.
- Kalibrera robot programvaran med stereo taktisk ram.
- Testa den stereotaktiska robot programvaran genom att se till att robot armarna rör sig fritt och att insprutningspumpen är ordentligt ansluten och kan utföra CED-proceduren utan några störningar. Detta inkluderar testning robot rörelse, rampning injektion, kontroll av 2 min väntar steg och hastigheten på katetern retraktion. Alla parametrar bör passa den förprogrammerade CED-proceduren som beskrivs i punkt 1.3.5.
- Sätt i borrkronan i borrmaskinen. Det rekommenderas att sterilisera borr bitarna före användning.
- Bered antikropps lösning med PBS eller andra buffertlösningar som aCSF. 1 till 20 μg antikropp i 5 μL kan injiceras i en enda CED-procedur. Andra volymer och protein mängder bör testas innan experimentet utförs. Tänk på att använda lösningar med hög viskositet kan leda till kateter igensättning.
- Ladda sprutan manuellt med den utspädda antikroppen.
- Antikropps injektion genom CED i striatum
- Väg musen och injicera tre-komponent anestesi lösning i bukhinnan enligt kroppsvikt. Anteckna injektionstiden. Överför musen till en separat bur uppvärmd med en värmedyna.
- Observera musen för att avgöra när sedering börjar. Så snart som musen slutar röra sig, applicera oftalmisk salva på ögonen för att skydda hornhinnan från uttorkning under operationen. Full sedering börjar vanligtvis 10 – 15 minuter från injektionen av tre-komponents anestesi lösning.
- Kontrollera smärtreaktioner med hjälp av Pinch-reflex test för att säkerställa full anestesi av djuret.
- Raka huvudet med en Hårtrimmer.
- Desinficera huden med bomullsvabb indränkt i jod lösning. Skrubba huden tre gånger i cirkelrörelse.
- Med hjälp av en skalpell, gör en 10 mm hud snitt längs kraniala mittlinjen efter behandling på ögonhöjd.
- Fäst musen i stereotaktisk ram med hjälp av näsan klämma och öron stänger. Se till att skallytan är horisontell och tätt säkrad. Bortsett från korrekt anatomisk navigering är detta också avgörande för att undvika tippning av skallen under borrning och CED förfarande.
- Placera sprutan i den stereotaktiska roboten.
- Synkronisera borrkronan med spetsen på katetern på en referenspunkt. Det är viktigt att förhållandet mellan positionen av borr och sprutan är exakt bestäms i programvaran, så injektionen kan utföras i den önskade anatomiska regionen i hjärnan.
- Dra tillbaka huden med hjälp av pinps och lokalisera bregma på skallytan.
- Referens bregma i programvaran med spetsen av borrkronan.
- Flytta borren till en position 1 mm frontal och 2 mm i sidled från bregma och borra ett gradhål. Var noga med att inte skada dura mater.
- Flytta sprutan över Burr hålet.
- Dispensera 0,5 – 1 μL från sprutan för att säkerställa att inga luftbubblor finns kvar i katetern.
- Starta det CED-program som beskrivs i punkt 1.3.5. Observera skallytan för alla spår av vätskeflöde från injektionsstället. Övervaka djurens andningsfrekvens.
- När CED-programmet är över och katetern dras tillbaka från hjärnan, starta insprutningspumpen på 0,2 μL/min för att kontrollera kateter igensättning under CED. Om ingen igensättning inträffade, bör du omedelbart se en droppe injektions blandning som kommer från kateterspetsen.
- Före återanvändning eller lagring av katetern, visuellt undersöka kateter steg för eventuella tecken på skada eller slitage under ett mikroskop och rengör den som i steg 1.3.10.
- Förfarande för uppvaknandet
- Ta försiktigt bort musen från den stereoaktiska ramen.
- Tvätta operationsstället med steril saltlösning.
- Med hjälp av tång, Fyll gradhål med benvax.
- Stäng huden med tunna spetstång och applicera kirurgiskt lim med en 10 μL pipett över snittet. Vänta 15 – 30 s för limmet att polymerisera.
- Applicera analgesi lösning genom subkutan injektion. Notera tiden för injektionen.
- Applicera den första antidot-lösningen. Notera tiden för injektionen.
- Överför musen till en separat bur med en värmedyna och övervaka djuret för skrämsel reflexer.
- Om musen inte har fått fullt medvetande 15 min efter administrering av den första antidot lösning, tillämpa den andra antidot lösningen genom subkutan injektion.
- Övervaka djuren under återhämtningsfasen.
- Kontrollera 1 – 2 h senare samt nästa dag för postoperativa komplikationer. Om det behövs, återapplicera analgesi.
- För infektions profylax, tillsätt sulfadoxin (slutlig koncentration 0,08% w/v) och trimetoprim (slutlig koncentration 0,016% w/v) till dricksvatten till vilket djuren har tillgång till AD libitum i 1 vecka efter operationen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll möjliggör beredning av steg katetrar (figur 1) för användning i CED-förfarandet i laboratoriemiljö. För att kontrollera katetrar för läckage, reflux längs nålen tarmkanalen och igensättning, rekommenderar vi att utföra injektioner av ett färgämne, t. ex., trypan blå lösning, i ett aganblock. Figur 3 visar ett moln av trypan blå formning efter injektion av 1 μL vid 0,5 μl/minut med en CED-kateter (figur 3a). Inga reflux längs nålen tarmkanalen var synlig under början av katetern steg. Dessutom bildade det spridda molnet en önskad sfärisk form. Detta är i motsats till de resultat som erhålls med hjälp av en konventionell 27 G trubbig ändnål (figur 3b), där betydande reflux kan observeras.
Dessutom kräver CED en optimerad injektions procedur. Figur 4 visar resultaten av injicering av 2 μl trypan-blått i ett aganblock med hjälp av rampningsmetoden som beskrivs i protokollet (a) jämfört med en injektion med en konstant hastighet av 2 μl/minut (B). Hög insprutnings hastighet tvingade återloppshastigheten längs katetern även när en CED-kateter användes.
Slutligen, som visas i figur 5, CED möjliggör perfusion av stora volymer av murina hjärnan. Möss injicerades med en råtta anti-mus-TNFα-antikropp kombinerad med FITC-dextran i 5 μL PBS genom CED (övre panelen) eller genom en konventionell bolusinjektion (bottenplatta). Perfusion profilen av CED var mer enhetlig än konventionella injektion och mindre vävnadsskada kunde observeras. I båda fallen var det en typisk distributions profil av antikroppar och dextran partiklar över corpus callosum. Spridnings profilen för den injicerade antikroppen var dock mer diffus än av den höga molekylära dextran, vilket exemplifierar skillnader i fördelning mellan olika infusates.
Figur 1: en schematisk ritning som visar den CED-stegkateter spetsen. Frontala (a) och sido (B) vyer. Systemet är inte skalat. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: en schematisk ritning som skildrar limens appliceringsområde. Den övre 10 mm av smält kiseldioxid slangen infogas i metallen nål. Applicera limmet på 10 mm slang med början från spetsen av metallen nål. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: jämförelse av infusionsresultat med CED-kateter eller en trubbig nål. Injektion av 1 μL 0,4% trypan blå i en 0,6% agat block vid 0,5 μL/minut med en CED kateter (a) och en 27G trubbig-end nål (B). Bilder tagna omedelbart efter katetern eller nålen tillbakadragande. Kors markerar spetsen på katetern eller nålen. Scale bar = 5 mm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: jämförelse av infusionsresultat av RAMPADE protokoll med protokollet för jämn hastighet. Injektion av 2 μL 0,4% trypan Blue i 0,6% agansblock med ett rampnings protokoll (0,4 μL vid 0,2 μL/min, sedan 0,8 μL vid 0,5 μL/min och 0,8 μL vid 0,8 μL/min (a) eller 2 μl/min fast hastighet injektion protokoll (B). I båda fallen användes en CED-kateter. Bilder tagna omedelbart efter katetern tillbakadragande. Kors markerar spetsen på katetern. Scale bar = 5 mm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: representativa resultat av murin striatum perfusion genom CED eller genom konventionell bolusinjektion. Möss injicerades i striatum (position 1 mm frontal och 2 mm lateral från bregma, djup på 3,5 mm) med 1 μg råtta anti-mus TNFα kombinerat med 1 μg FITC-dextran med molekylvikten 2 000 kDa i 5 μL PBS. (Övre panelen) eller en konventionell bolusinjektion (27 G nål, injektion hastighet 1 μL/minut) utfördes (botten). Möss offrades omedelbart efter CED-proceduren genom kontrollerad CO2 -kvävning och parfymen med 4% formaldehyd i PBS. Hjärnor dissekeras och dessutom fast med 4% formaldehyd i PBS vid 4 ° c för 24 h. Därefter tvättades hjärnor med 15% sackaros för 60 min och överfördes till 30% sackaros vid 4 ° c. Efter 24 h, hjärnor var frysta på torris. Fritt flytande sektioner (25 μm) färgas med hjälp av polyklonala get anti-råtta IgG (H + L) antikropp tillsammans med Alexa fluor 647 och motfärgas med DAPI. Bilder behandlades med Fiji distributionen av ImageJ. 10X förstoring, Skalstapel = 5 mm. 4 möss per grupp; en representativ bild visas. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Konvektion-förbättrad leverans, eller tryck-medierad drog infusion i hjärnan, föreslogs först i början av 19903. Denna metod lovar perfusion av stora hjärn volymer bakom blod-hjärnbarriären på ett kontrollerat sätt2. Hittills har dock endast ett fåtal kliniska prövningar utförts med denna metod, delvis därför att CED i en klinisk installation har visat sig vara tekniskt krävande24,25. Den senaste tidens utveckling i kateter design och Infusions program verkar ha övervinna dessa tekniska svårigheter8,19. Framsteg som gjorts i kliniska genomförandet av terapeutiska antikroppar, inklusive tillkomsten av immunmodulerande Checkpoint blockerar agenter, väntar på ansökan vid behandling av CNS-störningar10. Denna utveckling kan ökas kraftigt genom att anställa CED i den experimentella installationen, såsom att använda små gnagare modeller.
Olika CNS-sjukdomsmodeller finns tillgängliga på möss. Dessa inkluderar experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) för multipel skleros (MS) och genetiskt modifierade modeller för Alzheimers sjukdom (AD), Parkinsons sjukdom (PD), eller för hjärncancer. Många hjärntumör modeller förlitar sig också på ortotopisk tumör inympning av murina gliom celllines eller implantation av patient-härledda xenografts. Detta protokoll möjliggör leverans av antikropps lösningar direkt till specifika anatomiska platser, vilket liknar terapeutiska procedurer. Det kan implementeras i olika experimentella layouter där leverans av antikropp till en exakt hjärnregion spelar en central roll.
Den avgörande faktorn för att utföra CED hos möss är tillgången på katetrar. Detta protokoll innehåller en exakt beskrivning av hur man monterar en steg kateter och testar den i en serie in vitro-experiment. Man bör komma ihåg att den smält kiseldioxid som steg slangen görs är ett sprött material och kvaliteten på CED med en viss kateter kan sjunka med tiden. Det rekommenderas att kontrollera parametrarna för steg katetrar mellan in vivo-experimenten genom att upprepa de in vitro-tester som beskrivs i protokoll avsnitt 1,3.
Protokollet kan justeras för olika injektionsvolymer, typer av Infusat och hjärnregioner. Injektionsvolymen kan manipuleras genom att varaktigheten för injektions stegen ändras proportionellt. Här beskriver vi infusion av 5 μl, men CED med 10 μl antikropps lösning har rapporterats i litteraturen med hjälp av en liknande metod i murina hjärntumör modeller, uppnå utmärkt vävnadsfördelning och perfusion volymer vida överstiger bolus injektion7 . Dessutom har upp till 28 μl infusatvolymer rapporterats med hjälp av CED för applicering av vätskor i rått hjärnan22,26. Icke-proteinhaltiga substanser kan också injiceras av CED, med tanke på att Infusat inte bör vara av hög viskositet för att undvika igensättning av den smala kateterspetsen. Med liposomer har det visats att laddningen av de infunderade molekylerna kraftigt kan påverka vävnadspenetrationen, med neutrala eller negativt laddade partiklar som kan fördelas över de största volymerna22. Som avbildas i figur 5, FITC-dextran och antikropp skingra annorlunda: även om både antikropp och FITC-dextran fördelas på liknande sätt längs corpus callosum, är antikropps inträngning av hjärnparenkymet mer diffus än för FITC-dextran, som visar en mindre radie och ett mer fläckat spridningsmönster. Detta understryker skillnaderna i CED-profil mellan infusates med varierande fysikalisk-kemiska egenskaper.
Dessutom utfördes det CED-experiment som beskrivs här och som visas i figur 5 injicera en anti-mus TNFα-antikropp till friska möss, så förutsatt minimal mål mängd i striatum. Förekomst av kognat antigen kommer att förändra vävnads fördelnings mönstret. Det kan påverkas ytterligare av inhomogen vävnad på en anatomisk plats, som avbildas i figur 5 genom distribution av Infusat längs corpus callosum.
Slutligen, CED påverkas av flödet av interstitiell vätska, som i fallet med striatum injektion, kan spola Infusat mot de laterala ventriklarna27. I själva verket, även när vävnaden är fast omedelbart efter avslutad CED, vi kan observera en markant vidhäftning av den injicerade antikroppen till ventrikeln väggen (figur 5). Detta kan påverkas ytterligare av patologiska tillstånd i CNS, t. ex. i samband med hjärntumörer. Focal nekros, ofta observerats i hög grad hjärntumörer28, kan påverka flödet av interstitiell vätska och därmed förändra Spridningsmönstret av infusate29. Andra sjukdomstillstånd som kan leda till förändrad vävnadsdistribution av Infusat jämfört med friska parenkymet inkluderar stroke eller traumatisk hjärnskada30. Sammanfattningsvis måste varje serie av CED experiment noggrant valideras för att säkerställa en lyckad perfusion av mål hjärnregionen.
För närvarande, forskare använder ofta implanerbara osmotiska pumpar för att leverera ämnen i CSF eller hjärnan (tumör) parenkymet31,32,33. I vissa fall CED som beskrivs här kan användas som ett alternativ. Det kan utföras flera gånger med frekvenser beroende på hjärnregionen, typ av Infusat, volym och anestesi protokoll som används. Intermittent läkemedelsleverans kan vara särskilt relevant när en utökad exponering för Infusat leder till tolerans eller systemiska biverkningar. Det är tänkbart att i fall där hög retention och halveringstid infusates levereras, detta tillvägagångssätt skulle innebära en förfining enligt 3R principen eftersom ingen pump implantation skulle behövas. Sammanfattningsvis beskriver detta protokoll ett effektivt sätt att inblanda stora mängder antikropps lösningar i murina striatum och kan justeras för andra hjärnregioner och typer av Infusat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Johannes vom berg omnämns som uppfinnare på patentansökan (PCT/EP2012/070088) vid universitetet i Zürich. Michal Beffinger, Linda Schellhammer och Johannes vom berg nämns som uppfinnarear på en patenterad applikation (EP19166231) av universitetar av Zurich. Författarna har inga ytterligare ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av stipendier från universitetet i Zürich (FK-15-057), Novartis stiftelse för medicinsk-biologisk forskning (16C231) och schweizisk cancer forskning (KFS-3852-02-2016, KFS-4146-02-2017) till Johannes vom berg och BRIDGE proof of Concept (20B1-1 _ 177300) till Linda Schellhammer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 μL syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 27 G blunt end needle | Hamilton | 7762-01 | |
| Agarose | Promega | V3121 | |
| Atipamezol | Janssen | ||
| Bone wax | Braun | 1029754 | |
| Buprenorphine | Indivior Schweiz AG | ||
| Carprofen | Pfizer AG | ||
| Dental drill bits, steel, size ISO 009 | Hager & Meisinger | 1RF009 | |
| Ethanol 100% | Reuss-Chemie AG | 179-VL03K-/1 | |
| Fentanyl | Helvepharm AG | ||
| FITC-Dextran, 2000 kDa | Sigma Aldrich | FD2000S | |
| Flumazenil | Labatec Pharma AG | ||
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775-500ML | |
| High viscosity cyanoacrylate glue | Migros | ||
| Iodine solution | Mundipharma | ||
| Medetomidin | Orion Pharma AG | ||
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| Midazolam | Roche Pharma AG | ||
| Ophthalmic ointment | Bausch + Lomb | Vitamin A Blache | |
| PBS | ThermoFischer Scientific | 10010023 | |
| Polyclonal goat anti-rat IgG (H+L) antibody coupled with Alexa Fluor 647 | Jackson Immuno | ||
| Scalpels | Braun | BB518 | |
| Silica tubing internal diameter 0.1 mm, wall thickness of 0.0325 mm | Postnova | Z-FSS-100165 | |
| Stereotactic frame for mice | Stoelting | 51615 | |
| Stereotactic robot | Neurostar | Drill and Injection Robot | |
| Succrose | Sigma Aldrich | S0389-500G | |
| Topical tissue adhesive | Zoetis | GLUture | |
| Trypan blue | ThermoFischer Scientific | 15250061 | |
| Water | Bichsel | 1000004 |
References
- Scherrmann, J. M.
- Barua, N. U., Gill, S. S. Convection-enhanced drug delivery: prospects for glioblastoma treatment. CNS Oncology. 3 (5), 313-316 (2014).
- Bobo, R. H., et al.
- Morrison, P. F., Laske, D. W., Bobo, H., Oldfield, E. H., Dedrick, R. L. High-flow microinfusion: tissue penetration and pharmacodynamics. American Journal of Physiology. 266 (1 Pt 2), R292-R305 (1994).
- Zhou, Z., Singh, R., Souweidane, M. M. Convection-Enhanced Delivery for diffuse intrinsic pontine glioma treatment. Current Neuropharmacology. 15 (1), 116-128 (2017).
- Barua, N. U., et al. Intrastriatal convection-enhanced delivery results in widespread perivascular distribution in a pre-clinical model. Fluids and Barriers of the CNS. 9 (1), 2 (2012).
- Shoji, T., et al. Local convection-enhanced delivery of an anti-CD40 agonistic monoclonal antibody induces antitumor effects in mouse glioma models. Neuro-Oncology. 18 (8), 1120-1128 (2016).
- Souweidane, M. M., et al. Convection-enhanced delivery for diffuse intrinsic pontine glioma: a single-centre, dose-escalation, phase 1 trial. The Lancet Oncology. , (2018).
- Zhang, X., et al. Targeting immune checkpoints in malignant glioma. Oncotarget. 8 (4), 7157-7174 (2017).
- Barua, N. U., Gill, S. S., Love, S. Convection-enhanced drug delivery to the brain: therapeutic potential and neuropathological considerations. Brain Pathology. 24 (2), 117-127 (2014).
- Mehta, A. M., Sonabend, A. M., Bruce, J. N.
- Krauze, M. T., et al. Reflux-free cannula for convection-enhanced high-speed delivery of therapeutic agents. Journal of Neurosurgery. 103 (5), 923-929 (2005).
- Nash, K. R., Gordon, M. N. Convection Enhanced Delivery of Recombinant Adeno-associated Virus into the Mouse Brain. Methods in Molecular Biology. 1382, 285-295 (2016).
- Ohlfest, J. R., et al. Combinatorial antiangiogenic gene therapy by nonviral gene transfer using the sleeping beauty transposon causes tumor regression and improves survival in mice bearing intracranial human glioblastoma. Molecular Therapy. 12 (5), 778-788 (2005).
- Yin, D., Forsayeth, J., Bankiewicz, K. S. Optimized cannula design and placement for convection-enhanced delivery in rat striatum. Journal of Neuroscience Methods. 187 (1), 46-51 (2010).
- Mamot, C., et al. Extensive distribution of liposomes in rodent brains and brain tumors following convection-enhanced delivery. Journal of Neuro-Oncology. 68 (1), 1-9 (2004).
- Saito, R., et al. Tissue affinity of the infusate affects the distribution volume during convection-enhanced delivery into rodent brains: implications for local drug delivery. Journal of Neuroscience Methods. 154 (1-2), 225-232 (2006).
- Oh, S., et al. Improved distribution of small molecules and viral vectors in the murine brain using a hollow fiber catheter. Journal of Neurosurgery. 107 (3), 568-577 (2007).
- Barua, N. U., et al. A novel implantable catheter system with transcutaneous port for intermittent convection-enhanced delivery of carboplatin for recurrent glioblastoma. Drug Delivery. 23 (1), 167-173 (2016).
- Rosenbluth, K. H., et al. Design of an in-dwelling cannula for convection-enhanced delivery. Journal of Neuroscience Methods. 196 (1), 118-123 (2011).
- Debinski, W., Tatter, S. B. Convection-enhanced delivery for the treatment of brain tumors. Expert Review of Neurotherapeutics. 9 (10), 1519-1527 (2009).
- MacKay, J. A., Deen, D. F., Szoka, F. C. Jr Distribution in brain of liposomes after convection enhanced delivery; modulation by particle charge, particle diameter, and presence of steric coating. Brain Research. 1035 (2), 139-153 (2005).
- Chen, Z. J., et al. A realistic brain tissue phantom for intraparenchymal infusion studies. Journal of Neurosurgery. 101 (2), 314-322 (2004).
- Sampson, J. H., et al. Poor drug distribution as a possible explanation for the results of the PRECISE trial. Journal of Neurosurgery. 113 (2), 301-309 (2010).
- Wick, W., Weller, M., et al. Trabedersen to target transforming growth factor-beta: when the journey is not the reward, in reference to Bogdahn et al. (Neuro-Oncology 2011;13:132-142). Neuro-Oncology. 13 (5), author reply 561-552 559-560 (2011).
- Saito, R., Tominaga, T. Convection-enhanced delivery of therapeutics for malignant gliomas. Neurologia Medico-Chirurgica. 57 (1), 8-16 (2017).
- Bedussi, B., et al. Clearance from the mouse brain by convection of interstitial fluid towards the ventricular system. Fluids Barriers CNS. 12, 23 (2015).
- Noroxe, D. S., Poulsen, H. S., Lassen, U. Hallmarks of glioblastoma: a systematic review. ESMO Open. 1 (6), e000144 (2016).
- Boucher, Y., Salehi, H., Witwer, B., Harsh, G. R. t, Jain, R. K. Interstitial fluid pressure in intracranial tumours in patients and in rodents. British Journal of Cancer. 75 (6), 829-836 (1997).
- Glushakova, O. Y., et al. Prospective clinical biomarkers of caspase-mediated apoptosis associated with neuronal and neurovascular damage following stroke and other severe brain injuries: Implications for chronic neurodegeneration. Brain Circulation. 3 (2), 87-108 (2017).
- Vom Berg, J., et al. Inhibition of IL-12/IL-23 signaling reduces Alzheimer's disease-like pathology and cognitive decline. Nature Medicine. 18 (12), 1812-1819 (2012).
- Vom Berg, J., et al. Intratumoral IL-12 combined with CTLA-4 blockade elicits T cell-mediated glioma rejection. Journal of Experimental Medicine. 210 (13), 2803-2811 (2013).
- Kurdi, A., et al. Continuous administration of the mTORC1 inhibitor everolimus induces tolerance and decreases autophagy in mice. British Journal of Pharmacology. 173 (23), 3359-3371 (2016).
