Nós apresentamos um protocolo usando uma aproximação genética para a frente à tela para os mutantes que exibem a neurodegeneração no melanogaster de Drosophila. Incorpora um ensaio de escalada, uma análise da histologia, um mapeamento do gene e um sequenciamento do ADN para identificar finalmente genes novos relativos ao processo de neuroprotection.
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Artigo de método
In vivo Forward genética Screen para identificar novos genes neuroprotetores em Drosophila melanogaster
Neste artigo
Resumo
Resumo
Há muito a entender sobre o aparecimento e progressão de doenças neurodegenerativas, incluindo os genes subjacentes responsáveis. A triagem genética direta usando mutagénicos químicos é uma estratégia útil para mapear fenótipos mutantes para genes entre a Drosophila e outros organismos modelo que compartilham vias celulares conservadas com seres humanos. Se o gene mutado de interesse não é letal em estágios iniciais de desenvolvimento de moscas, um ensaio de escalada pode ser conduzido para a tela para os indicadores fenotípicos de funcionamento do cérebro diminuído, tais como baixas taxas de escalada. Subseqüentemente, a análise histológica secundária do tecido de cérebro pode ser executada a fim verificar a função neuroprotetor do gene marcando phenotypes do neurodegeneração. As estratégias de mapeamento do gene incluem o mapeamento meiótico e de deficiência que dependem desses mesmos ensaios podem ser seguidos por sequenciamento de DNA para identificar possíveis alterações de nucleotídeo no gene de interesse.
Introdução
Os neurônios são para a maior parte pós-mitótico e incapaz de dividir1,2. Na maioria dos animais, existem mecanismos neuroprotetores para manter essas células ao longo da vida útil do organismo, especialmente na velhice, quando os neurônios são mais vulneráveis a danos. Genes subjacentes a esses mecanismos podem ser identificados em mutantes exibindo neurodegeneração, um indicador fenotípico para a perda de neuroproteção, usando um protocolo genético para a frente. As telas genéticas da frente usando mutagénicos químicos tais como o Methanesulfonate do Ethyl (EMS) ou N-Ethyl-N-nitrosourea (ENU) são particular ....
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Protocolo
1. preparação e envelhecimento das moscas
- Obter ou gerar6 uma coleção de mutantes de Drosophila que será usado para a tela genética. Aqui, as linhas ENU-mutagenized mapeadas ao segundo cromossoma e balançadas sobre o CYO são usadas.
- Amplificar as linhagens experimentais de genótipos em uma incubadora definida a 25 ° c, 12 h de ciclo claro/escuro no meio de farinha de milho-melaço.
- Colete cerca de 20 progên homozygous entre 0-2 dias da eclosão adulta de cada genótipo experimental. Elimine a polarização do sexo consistentemente coletando moscas masculinas ou fêmeas.
- Age as moscas no meio d....
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Resultados
Neste aerículo, apresentamos os passos utilizados para identificar o tumor cerebral do gene (Brat) como desempenhar um papel na manutenção da integridade neuronal (por exemplo, neuroproteção) em moscas adultas17; uma metodologia que pode ser usada para identificar genes envolvidos na neuroproteção. Utilizamos uma abordagem genética prospecta (a estratégia é delineada na Figura 1a) para a tela através de uma coleção de.......
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Discussão
As telas genéticas para diante em Drosophila têm sido uma abordagem eficaz para identificar genes envolvidos em diferentes processos biológicos, incluindo a neuroproteção dependente da idade5,23,24, 25. using esta estratégia, nós éramos bem sucedidos em identificar o Brat como um gene neuroprotetor novo17.
Um passo crítico ne.......
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Divulgações
Os autores não declaram conflitos de interesse.
Agradecimentos
Estamos particularmente gratos ao Dr. Barry Ganetzky, no laboratório de quem a tela genética foi realizada, permitindo a identificação e caracterização do pirralho como um gene neuroprotetor. Agradecemos ao Dr. Steven Robinow por gentilmente fornecer a coleção de ENU-mutagenized moscas usadas na tela genética apresentada neste artigo. Agradecemos aos membros do laboratório Ganetzky, Drs. Grace Boekhoff-Falk e David Wassarman para discussões úteis durante toda a duração deste projeto, Ling Ling Ho e Bob Kreber para assistência técnica, Dr. aki Ikeda para o uso de sua instalação de micrótomo no Universidade de Wisconsin e Dr. Kim Lackey e a instalação óptica da....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Equipamento principal | |||
| Hotte para histologia | |||
| Microscópio de luz | Nikon | Eclipe E100 | O objetivo preferido para a imagem é 20x |
| Software de imagem | Nikon | ||
| Microscópio Câmera | Nikon | ||
| Termociclador | Eppendorf | ||
| Ensaio de empurrar e escalar com mosca | |||
| VWR® Frasco de Drosophila, Estreito | VWR | 75813-160 | |
| VWR® Fita de Rotulagem de Laboratório de Uso Geral | VWR | 89097-912 | |
| Stereoscope | |||
| Motic | Modelo SMZ-168 | ||
| CO2 estação de anestesia (Blowgun, válvula de pé, Ultimate Flypad) | Genesee Scientific | 54-104, 59-121, 59-172 | Doesn' t iinclude CO2 tanque |
| Fine-Tip Brushes | SOLO HORTON BRUSHES, INC. | ||
| Drosophila Incubadora | VWR | 89510-750 | |
| Mapeamento de genes | |||
| CantonS | Bloomington Drosophila Stock Center | 9517 | |
| w1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 5905 | |
| yw | Bloomington Drosophila Stock Center | 6599 | |
| Drosophila linha usada para mapeamento de recombinação | Bloomington Drosophila Stock Center | 3227 | Genótipo: wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3 |
| CyO/sno[Sco] | Bloomington Drosophila Stock Center | 2555 | Linha de balanceador de Drosophila usada para mapeamento de recombinação |
| Kit de deficiência para cromossomo 2L | Bloomington Drosophila Stock Center | DK2L | Cook et al., 2012 |
| Análise histológica | |||
| Etanol, (100%) | Thermo Fischer Scientific | A4094 | |
| Clorofórmio | Thermo Fischer Scientific | C298-500 | |
| Ácido Acético Glacial | Thermo Fischer Scientific | A38-500 | |
| Fisherbrand™ Tubos de Microcentrífuga Premium: 1,5 mL | Thermo Fischer Scientific | 05-408-129 | |
| Agente de limpeza Histochoice 1x | VWR Life Sciences | 97060-934 | |
| Harris Hematoxylin | VWR | 95057-858 | |
| Eosin | VWR | 95057-848 | |
| Thermo Scientific™ Richard-Allan Scientific™ Meio de Montagem | Thermo Scientific™ 4112 | 22-110-610 | CyO/sna[Sco] |
| Unifrost Poly-L-Lysine lâminas de microscópio, 75 mm x 25 mm x 1 mm, EverMark Select Plus | Azer Scientific | ||
| Fisherbrand™ Óculos de Capa: Retângulos | Fisherbrand | 12-545M | Dimensões: 24 mm x 60 mm |
| Temporizador rastreável | Aquecedor de Slides VWR | ||
| Barnstead International | no. 26025 | ||
| Bandeja de slides e racks | DWK Life Sciences | Rack para segurar 20 slides | |
| Fisherbrand™ Pinça Extra-Longa de Uso Geral | Fisherbrand | 10-316A | |
| Kimwipes™ | Kimberly-Clark™ Profissional | ||
| Aplicadores puritanos de 6 polegadas | Hardwood Products Company, Guilford, Maine | 807-12 | |
| VWR® Lâminas de barbear | VWR | 55411-050 | |
| Tupperware ou recipientes de vidro para líquidos | 16 + 1 para água corrente | ||
| Lâminas de micrótomo revestidas de alto perfil | VWR | 95057-834 | |
| Corning™ Balde de Gelo Redondo com Tampa, 4 L | Corning™ | ||
| Copo | Ou outro recipiente para água gelada e | ||
| Banho de Tecido | Precision Scientific Company | 66630 | |
| Micrótomo | Leica Biosystems | ||
| Análise molecular | |||
| Wizard® SV Gel e PCR Sistema de Limpeza | Promega | A9282 | |
| Ex Taq DNA polimerase | TaKaRa | 5 U/μ l | |
| Invitrogen™ SYBR™ Seguro e negociado; Mancha de DNA Gel | Invitrogen™ | ||
| UltraPure™ Agarose | Invitrogen™ | ||
| 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen™ | ||
| Editor de plasmídeos ApE-A | Disponível para download gratuito | ||
| Statistical analysis | |||
| R pacote | |||
| Further analysis | |||
| y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO; Dr[1]/TM3, Sb[1] | Bloomington Drosophila Stock Center | 59967 |
Referências
- Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances. Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).
- Aranda-Anzaldo, A. The post-mitotic state in neurons correlates with a stable nuclear higher-order structure.....
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Reimpressões e permissões
