Artigo de método

Desenvolvimento do direcionamento de lesões locais induzidas em populações de genomas (lavoura) em pequenas culturas de grãos por metilo Methanesulfonate mutagenesis

DOI:

10.3791/59743

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16 de julho de 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Science and Landscape Architecture, University of Maryland, College Park

Neste artigo

Resumo

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Descrito é um protocolo para o desenvolvimento de uma população de lesões locais induzidas em genomas (TILLING) em culturas de grãos pequenos com uso de metilo metanesulfonato (EMS) como um mutagênico. Também é fornecido um protocolo para detecção de mutação usando o ensaio cel-1.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O direcionamento de lesões locais induzidas em genomas (TILLING) é uma poderosa ferramenta de genética reversa que inclui mutagenese química e detecção de variação de seqüência em genes alvo. O TILLING é uma ferramenta de genômica funcional altamente valiosa para validação genética, especialmente em pequenos grãos em que abordagens baseadas em transformação possuem sérias limitações. O desenvolvimento de uma população mutagenizada robusta é fundamental para determinar a eficiência de um estudo de validação de genes baseado em TILLING. Uma população de tilling com uma baixa freqüência geral da mutação indica que uma população impraticamente grande deve ser selecionada para encontrar mutações desejadas, visto que uma concentração alta do mutagênico conduz à mortalidade elevada na população, conduzindo a um insuficiente número de indivíduos mutagenizados. Uma vez que uma população efetiva é desenvolvida, existem várias maneiras de detectar mutações em um gene de interesse, e a escolha da plataforma depende da escala experimental e da disponibilidade de recursos. O ensaio de cel-1 e a aproximação gel-baseada do agarose para a identificação do mutante são convenientes, reprodutíveis, e uma plataforma menos recurso-intensiva. É vantajoso que seja simples, não exigindo nenhum conhecimento computacional, e é especialmente adequado para a validação de um pequeno número de genes com equipamento de laboratório básico. No presente artigo, descrevem-se os métodos para o desenvolvimento de uma boa população de TILLING, incluindo a preparação da curva de dosagem, mutagenese e manutenção da população mutante, e triagem da população mutante usando o ensaio cel-1 baseado em PCR .

Introdução

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As mutações pontuais nos genomas podem servir a muitos propósitos úteis para os pesquisadores. Dependendo de sua natureza e localização, essas mutações podem ser usadas para atribuir funções a genes ou até mesmo domínios distintos de proteínas de interesse. Por outro lado, como fonte de nova variação genética, mutações úteis podem ser selecionadas para as características desejadas usando telas de fenotipagem e mais utilizadas na melhora da cultura. O TILLING é uma poderosa ferramenta de genética reversa que inclui mutagenese química e detecção de variação de seqüência no gene alvo. Desenvolvido pela primeira vez em Arabidopsis1 e Drosophilia melanogaster2, as populações de lavoura foram desenvolvidas e utilizadas em muitas culturas de grãos pequenos, como o trigo de pão hexapóide (Triticum aestivum)3, cevada (Hordeum vulgare)4, trigo duro tetrapóide (t. usambarense duro)5, trigo diploide (t. monococcum)6 e o progenitor do genoma "D" do trigo Aegilops tauschii7 . Esses recursos têm sido utilizados para validar os papéis dos genes na regulação da tolerância ao estresse abiótico e biótico8, regulando o tempo de floração9e desenvolvendo variedades de culturas nutricionalmente superiores5.

O cultivo, juntamente com o uso de agentes mutagênicos alquilantes, como o metilo metanesulfonato (EMS), azida sódica, N-metil-N-nitrosourea (MNU) e metanesulfonato de metilo (MMS), tem vantagens sobre outras ferramentas de genética reversa por várias razões. Em primeiro lugar, a mutagenese pode ser conduzida em praticamente qualquer espécie ou variedade de plantas10 e é independente do gargalo de transformação, o que é particularmente desafiador no caso de pequenos grãos11. Em segundo lugar, além de gerar mutações Knockout que podem ser obtidas por outras abordagens de validação genética, uma gama de mutações missense e splicing pode ser induzida, o que pode discernir funções de domínios individuais das proteínas de interesse12. Além disso, o TILLING gera uma coleção imortal de mutações em todo o genoma; assim, uma única população pode ser usada para a validação funcional de genes múltiplos. Em contrapartida, outras ferramentas de genética reversa geram recursos específicos apenas para o gene em estudo13. Mutações úteis identificadas através do TILLING podem ser implantadas para fins de reprodução e não estão sujeitas à regulação, diferentemente da edição gênica, cuja classificação não transgênica ainda é incerta em muitos países. Isso se torna especialmente relevante para pequenos grãos que são negociados internacionalmente14.

O TILLING é uma estratégia de validação genética simples e eficiente e requer que populações mutagenizadas sejam desenvolvidas para investigar genes de interesse. O desenvolvimento de uma população mutagenizada efetiva é fundamental para determinar a eficiência de um estudo de validação de genes baseado em TILLING. Uma população de tilling com uma baixa freqüência total da mutação indica que uma população impraticamente grande deve ser selecionada para mutações desejadas, visto que uma concentração alta do mutagênico conduz à mortalidade elevada na população e a um número insuficiente de indivíduos mutagenizados. Uma vez que uma boa população é desenvolvida, existem várias maneiras de detectar mutações nos genes de interesse, e a escolha da plataforma depende da escala experimental e da disponibilidade de recursos. O sequenciamento do genoma completo e o sequenciamento do exoma têm sido utilizados para caracterizar todas as mutações em populações de lavantes em plantas com pequenos genomas15,16. O sequenciamento de exome de duas populações de TILLING tem sido realizado em pão e trigo duro e está disponível ao público para identificar mutações desejáveis e ordenar linhas mutantes de interesse17. É um grande recurso público em termos de disponibilidade de mutações desejáveis; Entretanto, em estudos da validação do gene, a linha do selvagem-tipo deve possuir o gene do candidato do interesse. Infelizmente, ainda é custo-proibitivo para sequenciar o exoma de toda a população de TILLING para validação reversa baseada em genética de alguns genes candidatos em outro fundo. O sequenciamento de amplicon e os ensaios baseados em cel-1 têm sido usados na detecção de mutações em populações direcionadas em trigo, e os ensaios cel-1 são mais simples, não exigindo nenhum conhecimento computacional e são especialmente adequados para a validação de um pequeno número de genes com equipamento de laboratório6,18.

No presente artigo, descrevem-se métodos para o desenvolvimento de uma boa população de TILLING, incluindo a preparação da curva de dosagem, mutagenese e manutenção da população mutante, e triagem da população mutante usando o ensaio cel-1 baseado em PCR . Este protocolo já foi implementado com sucesso no desenvolvimento e utilização de populações mutagenizadas de Triticum aestivum, Triticum monoccocum6, cevada, Aegilops tauchii7e várias Outros. Incluídos são detalhes explícitos destes métodos, juntamente com dicas úteis que ajudarão os pesquisadores a desenvolver populações de TILLING, usando EMS como um mutagênico em qualquer planta de grãos de pequeno porte de escolha.

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Protocolo

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1. preparação da curva de dosagem para mutagenese efetiva

  1. Mergulhe 100 sementes com o genótipo de interesse em frascos de vidro de 6 250 mL (100 em cada frasco) contendo 50 mL de água destilada. Agitar a 100 RPM por 8 h à temperatura ambiente (RT) para embebição pelas sementes.
  2. Em uma capa de fumaça, prepare 50 mL de 0,4%, 0,6%, 0,8%, 1,0%, e 1,2% (p/v) solução de metanesulfonato de etilo (EMS) dissolvendo 0,167, 0,249, 0,331, 0,415 e 0,498 mL de EMS em água destilada, respectivamente.
    Nota: o EMS é líquido em RT com uma densidade de 1,206 g/mL.
    PRECAUÇÃO: utilize o equipamento de protecção individual (EPI) adequado durante o manuseamento do EMS.
  3. Decantar a água de cinco frascos e adicionar 50 mL de solução de EMS em cada frasco contendo sementes embebiadas para que existam seis tratamentos diferentes com 0,0%, 0,4%, 0,6%, 0,8%, 1,0%, e 1,2% solução de EMS. Agitar garrafas para 16 h em 75 rpm e RT.
  4. Decantar a solução EMS e recolher as sementes tratadas separadamente para cada tratamento usando pano de queijo. Inactivate a solução usada do EMS adicionando um volume de EMS-inativando a solução (NaOH de 0,1 M, 20% w/v na2S2O3) para 24 h. Também tratar as garrafas contaminadas e pontas de pipeta com a solução de inactivação de EMS para 24 h.
  5. Lave as sementes tratadas com EMS água corrente da torneira durante 2 h. transplante cada semente individualmente em formadores de raiz contendo solo de potting.
  6. Cresça plantas em 20-25 ° c um período de luz de 16 h.
  7. Registre dados sobre a sobrevivência da planta após 15 dias do transplante. Use a seguinte equação para calcular a taxa de sobrevida para cada tratamento:
    figure-protocol-1
    Nota: se a taxa de germinação for inferior a 100% nos controles, as taxas de sobrevida exatas em todos os tratamentos devem ser calculadas após subtrair o número de sementes que não germinaram nos controles. Uma taxa de sobrevivência de 40% – 60% é desejável para A mutagenese eficaz. Pode ser necessário realizar uma segunda rodada de otimização da dosagem com uma concentração modificada de acordo com a sobrevida das sementes tratadas até atingir a taxa de letalidade desejável de 40% – 60%.

2. mutagenese e manutenção da população mutante

  1. Mergulhe o lote final de pelo menos 3.000 sementes dividindo igualmente (600 sementes cada) em frascos de 5 1.000 mL contendo 300 mL de água destilada. Agitar por 8 h a 100 RPM RT para embebição.
    Nota: o tamanho final da população desejável dependerá da frequência de mutação e do nível de ploidia do genótipo, mas é aconselhável usar pelo menos 3.000 sementes para hexaploides, 4.000 sementes para tetraploides, e mais de 7.000 sementes para diploides.
  2. Em uma capa de fumaça, prepare 1.500 mL da solução de concentração de EMS otimizada em água destilada.
  3. Decantar a água fora dos frascos e adicionar 300 ml da concentração óptima da solução do EMS em cada frasco que contem 600 sementes embebidas. Agitar os frascos para 16 h em 75 rpm e RT.
  4. Decantar o EMS e recolher as sementes tratadas em pano de queijo. Inative os recipientes da solução e do tratamento do EMS com a solução do EMS-inativando como feito na etapa 1,4.
  5. Lave as sementes tratadas com EMS água corrente de torneira para 2 h. transplante cada EMS-Tratado M1 semente individualmente em formadores de raiz.
  6. Cresça M1 plantas (derivadas de sementes de m0 ) em 20-25 ° c um período de luz de 16 h.
    Nota: pode ser necessário vernalizar as mudas no estágio de duas folhas por 6 semanas a 4 ° c, se o genótipo de interesse tiver um hábito de crescimento do tipo inverno.
  7. Permita que as plantas M1 se autopolinizam e colha as sementes de m2 separadamente para cada planta férteis m1 .
    Nota: para evitar chances de possível ultrapassamento, cubra os picos de M1 plantas com sacos de polinização antes da antese.
  8. Plante uma única semente de M2 de cada planta de m1 para evitar a redundância genética.
  9. Colete o tecido das plantas de M2 no estágio da dois-folha em 1,1 ml de microtubes acumulou do poço 96. Colete cerca de 80 mm de tecido foliar de cada planta e registre o ID de cada amostra em um plano de coleta de tecido.
  10. Congelar-secar o tecido foliar usando um liofilizado e armazenar em-80 ° c.
  11. Manter as plantas M2 a 20 – 25 ° c um período de luz de 16 h.
  12. Registre dados em fenótipos mutantes das plantas M2 em intervalos regulares. Os fenótipos esperados são Albino, Chlorina, gramíneo, variegated, parcialmente fértil, estéril, etc.
  13. Permita que as plantas de M2 autofertilize e amadureça. Colher e conservar separadamente as sementes m3 das plantas M2 (Figura 1).
    Nota: as sementes de M são usadas Validando o phenotype em estudos reversos da genética. Portanto, M deve ser cuidadosamente catalogado e armazenado em condições frias e secas. Alternativamente, se a semente deve ser aumentada no campo, as fileiras da cabeça podem ser plantadas para cada planta de M, e as sementes de M de cada fileira podem ser colhidas e conservadas separada como o recurso da população de TILLING.

3. ensaio cel-1 para caracterização genética de mutantes

  1. Extraia o DNA do tecido foliar de M2 usando um kit de extração de DNA vegetal com um sistema de purificação de DNA (ver tabela de materiais) seguindo as recomendações do fabricante.
  2. Quantifique o DNA usando um espectrofotômetro e normalizar as concentrações de DNA para 25 ng/μl com água livre de nuclease em 96 blocos de poços.
    Nota: é importante verificar a qualidade do DNA, executando-o em um gel, como DNA de baixa qualidade (DNA manchado) pode resultar em falsos negativos em amostras agrupadas.
  3. Crie pools de DNA 4x combinando DNA de 4 96 blocos de poços em uma placa, mantendo a identidade de linha e coluna de cada amostra. Adicionar 50 μL de ADN de cada amostra individual na placa de associação, de modo a que cada placa de piscina contenha um total de 200 μL de ADN de quatro blocos diferentes de 96 poços.
  4. Catalogar a identidade do DNA agrupada no formato de pool Plate-Row-Column (por exemplo, pool 1 a1 = Box1A1 + Box2A1 + Box3A1 + Box4A1).
  5. Projete primers específicos do genoma [a1] para o gene de interesse usando a página de primers específicos do genoma (GSP) < https://probes.pw.usda.gov/GSP > com as configurações padrão para espécies poliploides. Para diploids, use primer 3 < http://Primer3.UT.ee/> para projetar iniciadores usando as configurações padrão. Projete vários primers, se necessário, para cobrir toda a região codificadora do gene de interesse.
    Nota: o último conjunto de IWGSC pode ser usado para obter sequências para o gene de interesse em trigo usando a ferramenta URGI BLAST < https://wheat-urgi.versailles.inra.fr/Seq-Repository/BLAST >. O comprimento ideal do amplicon está na escala de 800 – 1500 BP. a tabela 1 mostra exemplos dos primers para genes waxy no trigo hexaplóide.
  6. Execute um PCR para primers gene-specific no ADN agrupada como segue:
    1. Adicionar 5 μL de tampão PCR, 2 μL (cada) de 4 μM de primers para a frente e reverso, 0,1 μL de DNA polimerase (ver tabela de materiais), 5 μL de modelo de DNA agrupado e, em seguida, aumentar o volume para 25 μL utilizando água sem nuclease.
    2. Utilize um perfil de toque para baixo para executar a reacção de PCR num termociclador da seguinte forma: 95 ° c durante 1 min, sete ciclos de 95 ° c durante 1 min, 67 ° c a 60 ° c durante 1 min com diminuições de temperatura de 1 ° c por ciclo e 72 ° c durante 2 min , seguido de 30 ciclos de 95 ° c por 1 min, 60 ° c por 1 min, 72 ° c por 2 min e extensão final a 72 ° c por 7 min.
      Nota: acima do perfil do PCR trabalha no molde do ADN do trigo para a maioria dos primers projetados usando a primeira demão 3 ajustes do defeito. Em caso de amplificação não específica, o perfil de PCR deve ser rigoroso antes de passar para as próximas etapas.
  7. Gere heteroduplexes entre o ADN incompatível incubando produtos do PCR no Thermal cycler usando o perfil como segue: 95 ° c para 2 minutos, cinco ciclos de 95 ° c para 1 s, 95 ° c a 85 ° c por 1 minuto com diminuições da temperatura de 2 ° c por o ciclo, e 60 ciclos de 85 ° c a 25 ° c com diminuições de 1 ° c por ciclo.
  8. Adicionar 2,5 μL de endonuclease cel-1 caseira aos produtos de PCR heteroduplexados e incubar por 45 min a 45 ° c. Termine a reacção cel-1 adicionando 2,5 μL de 0,5 M de EDTA (pH 8,0).
    Nota: a endonuclease cel-1 pode ser extraída de hastes de aipo frescas utilizando o protocolo realizado por Till et al.19 é muito importante testar a atividade e a quantidade óptima de endonuclease cel-1, que pode ser testada usando mutantes previamente caracterizados ou um kit de detecção de mutação disponível comercialmente.
  9. Executar o Cel-1 produtos tratados em um gel de agarose 3,0% em 100 V para 2,5 h. Os poços que contêm a faixa (s) clivada menor e original, além do que faixas uncleaved full-length, conterá a amostra do ADN do mutante.
  10. Piscinas mutantes denconvolute.
    1. Siga as etapas 3,6, 3,7, 3,8 e 3,9 para amostras de DNA individuais de M2 que constituem as piscinas mutantes identificadas na etapa 3,9.
    2. Para determinar o zigoticidade dos mutantes, funcione dois PCR (como descrito na etapa 3,6) para o ADN individual de m2 , em que a primeira reação contem 2,5 μl do ADN de m2 e do μl 2,5 do selvagem-tipo ADN e a segunda reação contem somente 5 μl do ADN de m2 . Se a mutação é heterozygous, uma faixa clivada adicional estará atual em ambas as reações. Por outro lado, bandas clivadas adicionais só serão encontradas na primeira reação se o mutante for homozygous.
  11. Para identificar a natureza da mutação, sequencia os produtos de PCR dos mutantes confirmados usando uma plataforma de sequenciamento de Sanger seguindo as instruções do fabricante.

4. cálculo da frequência de mutação

Nota: a frequência de mutação de uma população de TILLING refere-se à distância física média em que ocorre uma mutação nos indivíduos dessa população. Por exemplo, uma frequência de mutação de 1/35 KB em uma população de TILLING significa que um indivíduo médio dessa população possui 1 mutação por cada 35 KB no genoma.

  1. Para determinar a frequência de mutação de uma população de TILLING, calcule o número total de bases rastreadas.
  2. Para calcular o número total de bases rastreadas, multiplique o tamanho do produto PCR pelo número total de indivíduos rastreados.
  3. Divida o número total de bases rastreadas pelo número de mutações únicas observadas usando a seguinte equação, que produzirá a região física possuindo 1 mutação na população de TILLING dada:
    figure-protocol-2
    Nota: para dar conta da limitação na resolução de 50 BP em ambas as extremidades com base em uma plataforma baseada em gel de agarose, subtrair 100 BP do tamanho do produto no cálculo.

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Resultados

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A Figura 2 mostra a curva de dosagem do trigo hexapóide cultivar Jagger, trigo diploide Triticum Monococcum6, e um doador de genoma de Aegilops de trigo tauschii7. As doses de EMS para as taxas de sobrevida desejadas de 50% foram de cerca de 0,25%, 0,6% e 0,7% para t. monococcum, ae. tauschiie t. aestivum, respectivamente. A maior tolerância do EMS do trigo hexaplóide...

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Discussão

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O TILLING é uma ferramenta de genética reversa altamente valiosa para validação de genes, especialmente para pequenos grãos, onde abordagens baseadas em transformação têm gargalos sérios11. Desenvolver uma população mutagenized com uma freqüência elevada da mutação é uma das etapas críticas em conduzir estudos funcionais da genômica. A etapa a mais importante em desenvolver uma população robusta do TILLING é determinar a concentração óptima de EMS. A taxa de sobrevida de 40%-60% no M1 f...

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Divulgações

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Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pelo USDA Instituto Nacional de alimentos e agricultura, Hatch projeto 1016879 e Maryland agricultural Experiment Station via MAES Grant no. 2956952.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
96 microtubos de 1,1 ml de poços em microracksNational ScientificTN0946-08RPara a recolha de tecidos foliares
Agarose I grau biotecnológicoVWR0710-500G
Biosprint 96 Kit de plantas de ADNde 941558Qiagenpara extracção de ADN
Endonuclease Cel-1Extraído conforme descrito por Till et al 2006Endonuclease específica de fita simples
Centrífuga 5430R Eppendorf
Etil metanossulfonatoSigma AldrichM-0880-25GEMS, mutagênico químico
Sistema de congelamento Freeze Dry / ShellLabconcoPara liofilização de tecido foliar Sistema de
purificação Kingfisher FlexThermo fisher científico5400610Robô de extração de DNA de alto rendimento
My Taq DNA PolimeraseBiolineBIO-21107
Água livre de nucleaseSigma aldrichW4502-1L
Sistema de imagem em gel NuGeniusSyngene
Orbit Environ-shakerLab-line
SPECTROstarNano BMG LABTECHNano drop para quantificação de DNA
T100 TermocicladorBIO-RAD1861096
Kit

Referências

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