Geração de fibrilas pré-formadas Alpha-synuclein de monômeros e uso in vivo

Resumo

O objetivo deste artigo é delinear as etapas necessárias para a geração de fibrilas de alfa-synucleina monomérica, controle de qualidade subsequente e uso das fibrilas pré-formadas in vivo.

Resumo

O uso do alfa-synuclein in vivo pré-formado fibrila (α-SYN PFF) modelo de synucleinopathy está ganhando popularidade entre os pesquisadores com o objetivo de modelar a doença de Parkinson synucleinopathy e degeneração nigrostriatal. A padronização da geração de α-SYN PFF e da aplicação in vivo é fundamental para garantir uma patologia α-SYN consistente e robusta. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para a geração de fibrilas de α-SYN monomérica, etapas de controle de qualidade pós-fibrilização e parâmetros sugeridos para a injeção neurocirúrgica bem-sucedida de PFFs α-SYN em ratos ou camundongos. Começando com o α-SYN monomérico, a fibrilização ocorre durante um período de incubação de 7 dias, enquanto agitando em condições de buffer, concentração e temperatura ideais. O controle da qualidade da borne-fibrilização é avaliado pela presença de fibrilas pelletable através do ensaio da sedimentação, pela formação da conformação do amilóide nas fibrilas com um ensaio do thioflavin T, e pelo elétron-visualização microscópica das fibrilas. Considerando que a validação bem-sucedida usando esses ensaios é necessária para o sucesso, eles não são suficientes para garantir que os PFFs irão propagar inclusões α-SYN em neurônios, pois essa atividade de agregação de cada lote de PFF deve ser testada na cultura celular ou em coortes animais-piloto. Antes do uso, os PFFs devem ser sonicated circunstâncias precisamente estandardizadas, seguidos pelo exame usando a microscopia de elétron ou a dispersão clara dinâmica para confirmar comprimentos do fibrila estão dentro da escala óptima do tamanho, com um comprimento médio de 50 nanômetro. Os PFFs podem então ser adicionados à mídia de cultura de células ou usados em animais. A patologia detectável pela imunomarcação para α-SYN fosforilado (psyn; serina 129) é dias ou semanas aparentes mais tarde na cultura de pilha e em modelos do roedor, respectivamente.

Introdução

Parkinson ' a doença de s (paládio) é caracterizada primeiramente pós-morte por duas características patológicas principais: a patologia generalizada e progressiva do alfa-synuclein (α-SYN), e a degeneração nigrostriatal. Após a injeção em camundongos ou ratos tipo selvagem, as fibrilas pré-formadas α-SYN (PFFS) induzem acúmulo progressivo de α-SYN patológico, o que pode resultar em degeneração prolongada de neurônios de dopamina substância negra nigra pars compacta (SNPC) ao longo de muitos meses, bem como déficits sensório-motores^1,2,3,4,5,6. Os neurônios são expostos a fibrilas α-SYN, seja via injeção intracerebral direta ou adicionadas à mídia de neurônios cultivados. Quando os PFFS são levados para os neurônios, os PFFS atuam para "semear" a formação de inclusões através de templating, e acúmulo de α-SYN endógena em inclusões fosforiladas^1,7,8, a ⁹. As inclusões compartilham propriedades semelhantes aos corpos de Lewy: contendo α-SYN fosforilado na serina 129 (pSyn), ubiquitina e p62; possuem estruturas quaternárias amilóides como mostrado com coloração de tioflavina positiva; e são resistentes a proteinase K digestão^{1,3,5,7,8,9,10,11, doze anos}. A exposição ao pff leva à formação de inclusão α-SYN na primária e alguns neurônios imortalizados na cultura, bem como camundongos, ratos e primatas não humanos in vivo^{1,2,3,4, 5,6,7,8,9,13}. É importante notar que PFFs não levará à formação de inclusão α-SYN em todos os modelos de cultura celular e alguns neurônios cultivados vai semente melhor do que outros.

Outra característica importante do modelo in vivo de PFF α-SYN é as fases patológicas sequenciais distintas que emergem ao longo de vários meses. Em roedores, após injeção intraestrial, a formação de inclusão α-SYN geralmente atinge o SNPC e muitas regiões corticais dentro de 1-2 meses. Este pico de agregação é seguido pela degeneração nigrostriatal ≈ 2-4 meses mais tarde^1,3,5. Esses estágios patológicos distintos fornecem aos pesquisadores a plataforma com a qual estudar e desenvolver estratégias que 1) diminuem a agregação α-SYN, 2) claras já formadas α-SYN inclusões, e/ou 3) impedem a subsequente neurodegeneração. O modelo de pff oferece vantagens e desvantagens distintas em comparação aos modelos neurotoxicant, transgenic, e virais mediados vetor do superexpressão do α-SYN como revistos previamente⁶. A escolha do modelo ou abordagem a tomar deve ser determinada pelo modelo que melhor se adapte à pergunta que os investigadores estão pedindo.

Embora o modelo PFF tenha sido utilizado com sucesso por muitos laboratórios, ainda existem grupos que sofreram inconsistências com a geração de fibrilas e produzindo uma patologia α-SYN consistente¹⁴. Exemplos de inconsistências variam de PFFs que produzem pouca ou nenhuma patologia α-SYN, lote para a eficiência de semeadura em lote, e até mesmo a falha de fibrilas para formar. Assim, a padronização da geração de α-SYN PFF e da aplicação in vivo é fundamental para possibilitar interpretações precisas sobre o impacto de novas intervenções terapêuticas. O seguinte protocolo esboça as etapas exigidas para a geração de PFFs dos monómeros do α-SYN, o controle in vitro da qualidade dos PFFs formados uma vez, o sonication e a medida dos PFFs antes do uso, e as sugestões para facilitar in vivo bem sucedida a injeção de PFFs em ratos ou ratos.

Protocolo

Todos os métodos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade Estadual de Michigan (IACUC).

1. formação de fibrilas pré-formadas α-sinucleina a partir de monómeros (Figura 1)

1. Monômeros do α-synuclein do Thaw no gelo, Ressuspender delicadamente sacudendo o tubo, e centrifugue em 15.000 x g por 10 minutos em 4 ° c.
   Nota: o monômero α-SYN deve ser formulado especificamente para a fibrilização. Os monómeros recombinantes podem ser adquiridos a partir de fontes comerciais ou gerados por protocolos no local^4,9,14,15. Se comprado de fontes comerciais, o produto deve indicar que o monômero α-SYN é especificamente para a geração de fibrilas. Independentemente de se os monómeros são comprados ou gerados no local, as etapas de controle de qualidade descritas abaixo devem ser executadas com cada lote para garantir que as fibrilas tenham formado e semente eficientemente antes do uso em experimentos.
2. Transfira o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga 1,5 mL limpo e registre o valor transferido.
   Nota: tenha cuidado para evitar o pellet, que, se presente, será pequeno.
3. Meça a concentração da proteína do sobrenadante transferido por um teste ácido ácido padrão (BCA), ou medindo a absorvência em 280 nanômetro com um espectrofotômetro do microespectrômetro.
   Nota: o ensaio de BCA não é tão exato para a medida específica de α-SYN e pode render resultados que superestimaam a concentração da proteína. Como resultado, a medição da absorvência em 280 nm é o método recomendado para determinar a concentração proteica.
   1. Para medir com o ensaio de BCA, siga protocolos padrão de BCA e realize com três diluições diferentes do monomer do α-SYN. As diluições sugeridas são 1:25, 1:50 e 1:100.
   2. Para medir com o método A280, em branco o leitor com estéril 1x Dulbecco ' s tampão fosfato salina (dPBS) sem cálcio e magnésio, com uma concentração de sal de aproximadamente 100 mM NaCl, e faixa de pH 7.0-7.3 (tabela de materiais).
   3. Adicionar 2 μL de amostra ao leitor e ler a absorvância a 280 nm.
   4. Use a lei Beer-Lambert para determinar a concentração dos monómeros.
      
      Nota: o coeficiente de extinção ε para α-SYN humano é 5.960 M^-1cm^-1 e para o rato α-SYN é 7.450 m¹cm^-1. O comprimento do caminho é medido em cm. o peso molecular de α-SYN (14 kDa) é estimado assumindo 1 da = 1 g/mol.
4. Diluir os monómeros com 1x dPBS para uma concentração final de 5 mg/mL. Use a equação abaixo para calcular a quantidade de 1x dPBS adicionado para diluir os monómeros.
   
   Nota: todas as concentrações estão em mg/mL e volumes em μL. as diluições de monômero devem ser realizadas com 1x dPBS. O volume total utilizado para gerar fibrilas deve estar entre 100 e 500 μL para obter resultados de fibrilização reprodutível.
5. Momentaneamente Vortex para misturar, e centrifugar para recolher todo o líquido na parte inferior do tubo. Aliquot monômeros para comparação de controle de qualidade com fibrilas conforme indicado nas etapas 1.8.1-1.8.4.
6. Use um fechamento do tubo ou uma película da cera/plástico (tabela dos materiais) para fixar a tampa do tubo do microcentrifugador fechado.
7. Coloc o tubo em um no orbital com uma tampa por 7 dias em 37 ° c, agitando em 1.000 rpm (tabela dos materiais).
   Nota: no final do 7 dias, o conteúdo do tubo deve aparecer turbid. O termomisturador deve ter uma tampa para evitar a formação de condensação nas tampas do tubo.
8. Deslize suavemente o tubo para suspender as fibrilas α-SYN. Aliquot fibrilas para as seguintes etapas de controle de qualidade, conforme indicado nas etapas 1.8.1-1.8.4.
   Nota: as fibrilas para as etapas de controle de qualidade podem ser armazenadas no RT durante a noite.
   1. Alíquota 6 μL para o ensaio de sedimentação.
   2. Alíquota 5 μL para o ensaio de ligação tioflavina T.
   3. Alíquota 2 μL para a microscopia eletrônica de transmissão para visualização fibrila.
   4. Alíquota de pelo menos 10 μL para o ensaio de endotoxina.
      Nota: para o ensaio de endotoxina, é utilizado um Limulus amebocyte lysate (LAL) comercial, seguindo as instruções do fabricante (tabela de materiais). Os níveis de endotoxina devem ser ≤ 0,5 unidades de endotoxina/mL para as fibrilas. Um kit de remoção de endotoxina pode ser usado se esse critério não for atendido.
9. Aliquot as restantes fibrilas e loja. Para o armazenamento a longo prazo (12-18 meses), congele ràpida no gelo seco, e armazene em-80 ° c.
   Observação: o valor para alíquota depende do aplicativo downstream desejado. O uso in vivo normalmente requer mais fibrilas em concentrações mais elevadas do que o uso in vitro, e os volumes de alíquota devem ser planejados em conformidade. As fibrilas devem ser armazenadas em direção à parte de trás do congelador para evitar danos causados por potenciais congelamentos/degelo. O protocolo pode ser pausado aqui.

2. ensaio de sedimentação

1. Em um tubo de microcentrífuga limpo, adicione 6 μL de PFF a 54 μL de dPBS para diluir fibrilas 1:10, e Pipet para misturar.
   1. Em um tubo separado, adicione 6 μL de monómero a 54 μL de dPBS como um controle adicional.
2. Centrifugue amostras em 10.000 x g por 30 min em RT e transfira o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga limpo.
3. Adicione 60 μL de dPBS à pelota restante e ao Vortex para ressuscitem.
4. Adicionar 30 μL de tampão de amostra 3x (140 μL de 50% de glicerol/0,1% de bromofenol azul, 40 μL de SDS a 10% e 20 μL de β-Mercaptoetanol) a cada tubo e vórtice para misturar.
5. Incubar amostras a 100 ° c por 10 min e deixe esfriar por 5 min no gelo.
6. Use um padrão de sódio Dodecil sulfato-poliacrilamida gel electroforese (SDS-PAGE) protocolo para separar a proteína em massa. Use uma escada da proteína com uma escala que inclua 14 kDa (a faixa do tamanho esperada para o α-SYN monoméricas).
7. Transfira o gel para um prato de coloração e cubra o gel com mancha azul Coomassie (0,1% Coomassie azul brilhante, 20% metanol em volume e 10% de ácido acético em volume em ddH₂O). Incubar durante 3 h na RT enquanto treme.
8. Derrame a mancha azul de Coomassie e adicione bastante senhor (50% metanol pelo volume, e ácido acético de 10% pelo volume em DDH₂o) para cobrir o gel. Incubar durante 30 min na RT enquanto treme.
9. Despeje senhor e repita o passo senhor até que o gel é claro e as bandas são visíveis.
10. Lave o gel 3 vezes durante 5 min cada, agitando em ddH₂o e a imagem do gel.

3. microscopia eletrônica de transmissão para visualização fibrila

1. Pesar 20 mg de acetato de uranilo em um tubo de microcentrífuga e adicionar 1 ml de DDH₂o para fazer uma solução aquosa a 2%. Vortex até que o acetato do uranilo esteja na solução, e deixe-o sentar-se durante a noite.
   Nota: o acetato de Uranyl deve ser feito no dia anterior à preparação de amostras para microscopia eletrônica de transmissão. A exposição à luz ou agitação pode fazer com que o acetato de uranilo precipitate, como tal, o tubo contendo a solução de acetato de uranilo deve ser coberto em folha de alumínio, mantido em um lugar escuro, e não agitado após o acetato de uranilo está em solução.
2. Adicione 2 μL de PFF a 98 μL de dPBS para diluir fibrilas 1:50 e, em seguida, Pipet para misturar.
3. Prepare uma cera limpa/película plástica (tabela de materiais) superfície coberta (aproximadamente 50 milímetros x 50 milímetros) na parte superior de banco. Na cera limpa/filme plástico (tabela de materiais), adicione o seguinte (Figura 2).
   1. Adicionar 4 x 10 μL de gotas de ddH₂O.
   2. Adicionar 1 x 10 μL de fibrilas diluídas ou amostras de monómeros.
   3. Adicionar 2 x 10 μL de gotas de acetato de uranilo a 2%.
4. Use fórceps fino-derrubado para pegarem um formvar/carbono revestido, grade da microscopia de elétron da transmissão do cobre do engranzamento (tabela dos materiais).
   Nota: Certifique-se de apenas pegar a grade pela borda, evitando a porção de malha no centro (Figura 2a). Se o fórceps toca na malha, a película revestida de formvar/carbono será danificada, fazendo a imagem latente nessa área da grade impossível.
5. Flutue o lado formvar/carbono revestido da grade (lado brilhante) para baixo na primeira gota de ddH₂o. Use suavemente a pinça para segurar a grade e empurre para baixo para garantir que toda a superfície revestida esteja em contato com o DDH₂o. Deixe a grade flutuar por 1 min.
6. Pegue a grade, e sem tocar a porção de malha da grade, pavio afastado o ddH₂o com papel de filtro.
7. Flutue a grade como acima na segunda gota de ddH₂o para 1 minuto e pavio afastado o DDH₂o.
8. Flutue a grade na gota de fibrilas diluídas por 1 minuto e pavio afastado o excesso como acima.
9. Flutue a grade na primeira gota do acetato do uranilo por 1 minuto e pavio afastado o excesso.
10. Flutue a grade na segunda gota do acetato do uranilo por 1 minuto, pavio afastado o excesso.
11. Flutuar a grade como acima na terceira gota de ddH₂o brevemente e pavio afastado o DDH₂o.
12. Flutue a grade como acima na quarta gota de ddH₂o momentaneamente e pavio afastado o DDH₂o, sendo certo remover tanto DDH₂o como possível.
13. Transfira para uma caixa de grade para armazenamento até a imagem.
    Nota: as grelhas devem secar durante pelo menos 5 minutos antes da imagem. As grades podem ser imaged por pelo menos um ano após a preparação e devem ser mantidas em um ambiente seco.

4. ensaio tioflavina T

1. Em um tubo de microcentrífuga limpo, adicione 5 μL de PFF a 245 μL de dPBS para diluir fibrilas 1:50, e Pipet para misturar.
2. Adicione 250 μL de dPBS a um tubo de microcentrífuga separado para servir como um controle negativo.
3. Adicione 5 μL de monómero a 245 μL de dPBS para servir como controle de monómero.
4. Adicionar 250 μL de tioflavina T em tampão glicina (25 μM de tioflavina T, 100 mM glicina, 1% Triton X-100, pH 8,5) para cada amostra e misture suavemente.
5. O Pipet 2 Replica, 200 μL cada, em uma placa preta do poço 96. Mantenha a placa no escuro para evitar o fotobranqueamento.
6. Incubar por 1 h em RT e ler a placa usando uma excitação de 450 nm e emissão de 510 nm.
   Nota: as leituras de Thioflavin T flutuarão ao longo do tempo. As amostras devem ser lidas no mesmo tempo de incubação. Se desejado, as leituras múltiplas podem ser tomadas durante a incubação da hora e plotadas sobre o tempo.

5. sonication de α-synuclein pré-formados fibrilas

Cuidado: o sonicador e todos os passos sonication são realizados em uma capa de cultura para evitar a exposição a fibrilas que podem aerosolize durante sonication. O pessoal que executa os passos de sonication deve usar equipamentos de proteção pessoal, incluindo luvas, proteção de roupas na forma de um jaleco, e um escudo de rosto enquanto sonicating. Risco de exposição fibrila pode ser reduzida por sonicating com um copo sonicator chifre, permitindo que o tubo contendo fibrilas para permanecer fechado durante sonication.

Nota: os parâmetros de sonicação ideais de fibrilas dependem do modelo de sonicador utilizado. Por esse motivo, algumas otimizações precisarão ser executadas para garantir que as fibrilas sejam o tamanho correto. O sonicador usado pode ser encontrado na tabela de materiais e os parâmetros descritos são baseados em resultados anteriores com este modelo de sonicador. Os parâmetros abaixo funcionarão para 2-4 μg/μL de PFFs em 200-400 μL de solução. O sonication do teste com o instrumento deve ser executado e os fibrilas analisados para assegurar os resultados desejados são conseguidos antes do uso de PFFs nos experimentos.

1. Anexe uma sonda de diâmetro de 3,2 mm (tabela de materiais) ao conversor e defina os parâmetros do sonicador conforme indicado abaixo na etapa 5.1.1-5.1.3.
   1. Defina a amplitude para 30%.
   2. Ajuste o pulso para 01 01 (1 s em; 1 s desligado).
   3. Defina o tempo para 0:01:00.
      Nota: 1 min de pulsante equivale a 60 pulsos, e este modelo de sonicador (tabela de materiais) irá parar automaticamente. Com outros modelos sonicador, o número de pulsos terá de ser contado.
2. Descongelar fibrilas em RT e diluir com dPBS estéreis em uma capa de cultura.
   Nota: um tubo claro do microcentrifugador de 0,6 mL trabalha melhor para o sonication e a concentração final do fibrila depende do uso pretendido. Os resultados representativos apresentados são de uma concentração final de fibrila de 4 μg/μL.
3. Limpe a sonda do sonicador com um tecido de laboratório umedecido com 70% de etanol para limpar a sonda. Mergulhe a ponta da sonda em ddH₂o e Pulse 10 vezes para limpar ainda mais a sonda e, em seguida, seque com um tecido de laboratório.
4. Coloque a ponta da sonda no tubo de fibrilas diluídas e posicione a ponta na parte inferior do tubo.
5. SONICATE para 60 pulsos (1 s em; 1 s desligado). Mova a sonda para cima e para baixo durante cada pulso para garantir que todas as fibrilas no líquido estejam sonicadas. e limpo.
6. Após 60 pulsos, retire a sonda dos PFFs e adicione 2 μL de PFF a 98 μL de dPBS em um tubo de microcentrífuga limpo para diluir as fibrilas 1:50 para medição de fibrila sonicada por microscopia eletrônica.
   Nota: idealmente, um pequeno subconjunto de fibrilas deve ser medido antes da injeção in vivo e uma medida mais abrangente de fibrilas executadas quando o tempo permitir.
7. Após sonication, brevemente centrifugar PFFs para 1 s em 2.000 x g para recolher todo o líquido fora dos lados do tubo.
   Atenção: se o tubo se aquecer ao toque, pare de sonicar após 30 pulsos, Aguarde 1 min e proceda à sonicação para os 30 pulsos finais.
   Nota: quando sonicating, mantenha a ponta da ponta de prova para a parte inferior do líquido no começo de cada pulso, demasiado perto da parte superior do líquido causará a perda da amostra.
8. Mergulhe a ponta da sonda em 1% SDS e Pulse 10 vezes para limpar a sonda. Remova a ponta do SDS, mergulhe em ddH₂o e Pulse 10 vezes.
9. Limpe a sonda com um tecido de laboratório umedecido com 70% de etanol e, em seguida, limpe a sonda com um tecido de laboratório seco. Desanexar a sonda do conversor e da loja.
10. Limpe todas as superfícies no capô com 1% de SDS, seguido de 70% de etanol.
    Nota: a solução de SDS a 1% é utilizada para dissociar fibrilas e superfícies limpas e equipamento¹⁶.

6. microscopia eletrônica de transmissão para a medição de fibrilas sonicadas

Nota: se a microscopia eletrônica não for viável, um ensaio de cinética de tioflavina T e dispersão de luz dinâmica podem ser utilizados como medidas indiretas de eficiência de semeadura e tamanho de fibrila^4,14.

1. Prepare amostras usando o protocolo da seção "microscopia eletrônica para visualização fibrila" acima.
2. Use um microscópio de elétron da transmissão para tomar uma imagem das fibrilas de 6 a 10 aberturas diferentes da grade.
   Nota: as imagens devem ser uma ampliação suficientemente alta para medir fibrilas, mas suficientemente baixas para visualizar várias fibrilas simultaneamente. Uma ampliação final de aproximadamente 75, 000x deve ser suficiente.
3. Meça o comprimento de um pequeno subconjunto de pelo menos 25 fibrilas antes de usar fibrilas em um experimento.
   Nota: estas medidas podem tipicamente ser executadas usando o software da imagem latente associado com o microscópio. Para a validação rápida, a pessoa que mede deve selecionar fibrilas representativas e calcular o tamanho médio. Comprimento fibril deve média em torno de 50 nm ou menos, com uma medida mais precisa a seguir.
4. Medir os comprimentos de 500 + fibrilas para obter resultados mais abrangentes.
   Nota: o software da imagem latente associado com o microscópio pode ser usado para medidas do fibrila. Alternativamente, as imagens podem ser abertas e fibrilas medidos com o software de processamento de imagem, usando a barra de escala associada a cada imagem como uma referência de tamanho com o qual comparar os comprimentos fibrila.

7. preparação de seringas de agulha de vidro personalizadas para injeções estereotáticas (Figura 3)

1. Adicione aproximadamente 10 mL de reagente de siliconização (tabela de materiais) a um copo limpo de 50 ml.
2. Coloque os tubos capilares de vidro (comprimento de 54 mm; diâmetro exterior: 0,86 mm; diâmetro interno 0,59 mm) verticalmente na taça de reagente de siliconização e permita que a ação capilar Extraia o reagente de siliconização até o tubo através da abertura do tubo inferior submersa na Reagente de siliconização.
3. Reagente de siliconização adicional de Pipet na abertura superior do tubo que não é submerso no reagente siliconização para encher completamente o tubo capilar de vidro.
4. Retire os tubos capilares do reagente de siliconização e borre as extremidades abertas dos tubos em uma toalha de papel para remover o reagente de siliconização nos tubos. Deixe os tubos capilares secar durante pelo menos 8 horas.
5. Coloc um tubo capilar de vidro siliconized em um extrator de vidro da agulha (tabela dos materiais).
6. Gire sobre o elemento de aquecimento e permita que os pesos Unidos esticem o tubo capilar de vidro aquecido.
7. Corte o tubo capilar de vidro puxado com tesouras no ponto mais fino do meio e retire a agulha de vidro do extrator de agulhas de vidro.
   Nota: o diâmetro interno e externo da agulha puxada deve ser de aproximadamente 80 e 100 μm, respectivamente. As agulhas de vidro múltiplas podem ser feitas em uma vez e armazenadas até que apronte para prender a uma seringa de vidro com a agulha unida do metal (tabela dos materiais).
8. Corte um comprimento da tubulação do shrink-wrap (diâmetro interno médio 0, 21 "e espessura de parede média 0, 1") a aproximadamente 40 milímetros com tesouras. Deslize o envoltório do psiquiatra sobre a agulha metálica de uma seringa chanfrada de 10 μL (tabela de materiais).
9. Use uma chama aberta para aquecer e adira o envoltório do psiquiatra à agulha ao girar a agulha para aplicar o calor uniformente.
10. Deslize a extremidade maior da agulha de vidro puxada cuidadosamente sobre a agulha metálica da seringa.
11. Corte um comprimento da tubulação do shrink-wrap (diâmetro interno médio 0, 36 "e espessura de parede média 0, 5") a aproximadamente 40 milímetros com tesouras e deslize com cuidado sobre a agulha de vidro para sobrepor a base da agulha de vidro e a agulha do metal da seringa (tabela de Materiais). Use uma chama aberta para aquecer o shrink-wrap para fixar a agulha de vidro à agulha de metal.
12. Adicione uma camada adicional de shrink-wrap para fixar a agulha de vidro. Corte um comprimento da tubulação do shrink-wrap (diâmetro interno médio 0, 44 "e espessura de parede média 0, 5") a aproximadamente 40 milímetros com tesouras e deslize com cuidado sobre a agulha de vidro para sobrepor a base da agulha de vidro e a agulha do metal da seringa (tabela de Materiais). Use uma chama aberta para aquecer o shrink-wrap para fixar a agulha de vidro à agulha de metal.
13. Aparar a agulha de vidro com uma tesoura para que a ponta tenha aproximadamente 8 mm de comprimento.
    Nota: a agulha precisa ser suficientemente longa para atingir as regiões cerebrais desejadas (o comprimento exigido depende das coordenadas dorsal/ventral).
14. Use os passos 7.14.1-7.14.3 para testar a agulha para segurar não há vazamentos e não há fluxo adequado tanto em retirar e dispensar líquido da agulha de vidro.
    1. Encha uma seringa de 1 mL com uma agulha de calibre 26 anexa com dH₂O.
    2. Retire o êmbolo metálico da seringa de agulha de vidro personalizada e insira a agulha da seringa cheia dH₂o na base da seringa. Aplique pressão para dispensar dH₂o da agulha de vidro. Inspecione a interface da agulha de vidro e a agulha metálica para vazamentos e confirme um fluxo contínuo de dH₂o.
       Nota: se necessário, a agulha de vidro pode ser aparada para aumentar a facilidade de fluxo e camadas adicionais de shrink-wrap adicionado para corrigir quaisquer vazamentos da base da agulha de vidro.
    3. Encha um tubo de microcentrífuga com dH₂o. Use a seringa de agulha de vidro personalizada para desenhar no DH₂o. Inspecione a agulha para confirmar que o líquido está sendo tomado na seringa e que não há bolhas.
       Nota: se existirem bolhas ou dH₂o não está a ser desenhado na agulha, aparar a agulha pode ajudar a aliviar a pressão.
15. Guarde cuidadosamente a seringa com agulhas de vidro anexadas nas caixas da seringa até que seja necessário para cirurgias.
16. Use métodos de cirurgia estereotástrica padrão para a entrega intraestrial de PFFS em coordenadas otimizadas em camundongos (um local: AP + 0,2 mm e ml + 2,0 mm de Bregma, DV-2,6 mm de dura) ou em ratos (dois sítios: AP + 1,6 mm e ml + 2,0 mm de Bregma, DV-4,0 de dura; AP + 0,1 mm e ml + 4,2 mm de Bregma, DV-5,0 de dura)^1,14,17.
    Nota: estas coordenadas foram utilizadas em camundongos C57BL6/C3H e ratos Fischer 344. Ao usar outras cepas, as coordenadas devem ser otimizadas.

Resultados

A geração de fibrilas de monômeros α-SYN começa com a determinação da concentração dos monómeros. O teste de BCA e a medida da absorvância em 280 nanômetro (A280) podem ser usados para medir o índice de proteína; os resultados do ensaio de BCA, entretanto, sugeriram uma concentração mais elevada do que o método A280. Os PFFs derivados do monômero α-SYN do camundongo apresentaram um valor de BCA de 14, 5 ± 0,22 e um A280 de 8, 5 ± 0, 3 μg/μL (Figura 1). Da mesma forma, os PFFs derivados do monômero α-SYN humano também pareciam estar em maior concentração, com um valor de BCA de 12,95 ± 0,38 e um A280 de 7,83 ± 0, 5 μg/μL (Figura 1). As medidas de A280 são específicas para α-SYN com base na inclusão dos coeficientes de extinção e estes resultados foram utilizados para diluir os monómeros antes da incubação de 7 dias.

Antes da incubação, o líquido contendo os monômeros α-SYN foi claro, mas deve aparecer turvo após a formação da fibrila. O exame com microscopia eletrônica de transmissão confirmou a presença de fibrilas longas, medindo 10-20 nm de largura (Figura 4). Em comparação, os monômeros α-SYN eram pouco visíveis e não apresentavam forma discernível aparente (Figura 4). Com a confirmação visual de estruturas fibrilar, a conformação do amilóide dos fibrilas é a característica seguinte dos PFFS que devem confirmado usando um ensaio do thioflavin T. A tioflavina T apresenta fluorescência aumentada quando se liga ao amiloide; assim, o sinal fluorescente aumentado das amostras indica a presença de amyloid. Como exemplo, a tioflavina em dPBS produziu um sinal de 3.287 ± 580 unidades fluorescentes relativas (RFU), o monômero α-SYN do rato produziu um sinal de 4.174 ± 158 RFU, e os PFFs do rato produziram um sinal de 59.754 ± 6.224 RFU (Figura 5). Em comparação, o monômero α-SYN humano produziu um sinal semelhante de 4.158 ± 105 RFU para monômero de camundongo, e os PFFs humanos produziram um sinal mais alto de 1.235.967 ± 113.747 RFU em comparação com os PFFs do mouse (Figura 5). Para avaliar a presença de fibrilas pelletáveis, realizou-se um ensaio de sedimentação. Fibrils vai sedimento com centrifugação. Tanto nas amostras de camundongo quanto no PFF humano, a fração sobrenadante deve ter mais proteínas no pellet do que o sobrenadante (Figura 6). Em contrapartida, a maioria das proteínas do camundongo e dos monómeros humanos esteve presente no sobrenadante, com pouco presente no pellet (Figura 6). Com os PFFs visivelmente presentes por microscopia eletrônica, estruturas amilóides presentes, e fibrilas pelletable, os PFFs passaram todos os passos de controle de qualidade in vitro.

Tanto o mouse quanto os PFFS humanos foram sonicados para produzir PFFS de comprimentos apropriados para a semeadura de inclusões α-SYN^4,18. Os PFFs foram diluídos para a concentração desejada de 4 μg/μL e sonicados. Imediatamente antes da cirurgia, 25 fibrilas representativas foram fotografadas por microscopia eletrônica e medidas para verificar o tamanho da fibrila. Os PFFs sonicated do rato mediram 48,8 ± 3,1 nanômetro, visto que os PFFs humanos mediram 52,1 ± 4,4 nanômetro do comprimento; As PFFs de ambas as espécies foram, portanto, o comprimento adequado (50 nm ou menos) para induzir a atividade de semeadura. Uma examinação mais detalhada de aproximadamente 500 fibrilas revelou a distribuição média do comprimento e do comprimento das fibrilas sonicated do rato. O comprimento médio foi de 44,4 ± 0,6 nm, com 86,6% dos PFFs medindo 60 nm ou menos (Figura 4). Em comparação, os PFFs humanos tinham média de 55,9 ± 1,1 nm com 69,6% dos PFFs medindo 60 nm ou menos (Figura 4).

Depois da injeção intraestrial de PFFS sonicated do rato em ratos como descrito previamente^3,5, uma série de seções do tecido foram processadas em 2 meses de borne-cirurgia, quando o número de inclusão que contem neurônios é sabido ao pico em o SNpc, para a confirmação de inclusões α-SYN fosforiladas⁵. Os neurônios do rolamento de inclusão, como indicado pela coloração imuno-histoquímica para pSyn (anticorpo na tabela de materiais) estão presentes dentro do SNPC (Figura 7), bem como outras regiões em todo o cérebro que inervam o estriado (anterior núcleo olfativo, motor, cingulado, piriforme, prelímbico, somatossensorial, entorhinal e córtices insulares, amígdala, striatum)^1,3,4,5,19. Estas inclusões compartilham propriedades similares com corpos de Lewy, tais como a ligação thioflavin S, e a resistência do α-SYN total à proteinase K (Figura 7), como mostrado pela mancha immunohistochemical (anticorpo e proteinase K na tabela de materiais) . A confirmação da semeadura dentro do cérebro indica que o controle de qualidade in vivo foi passado, e alíquotas de PFFs previamente congeladas e salvas do mesmo lote podem ser sonicadas parâmetros idênticos, com comprimentos validados, em experimentos maiores.

Figura 1 . Métodos para a geração de fibrilas α-SYN. Esboço dos passos necessários para produzir fibrilas de monômeros α-SYN. Os monómeros são centrifugados por 10 min (15.000 x g, a 4 ° c). O sobrenadante é transferido para um tubo limpo e a concentração proteica é determinada pela absorvência a 280 nm, ou um ensaio de BCA. O gráfico mostra as concentrações dos monômeros α-SYN humanos e do rato. As colunas indicam os meios do grupo, as barras de erro representam o erro padrão de ± 1 da média. Depois que a concentração da proteína é determinada, os monómeros do α-SYN são diluídos, vórtice momentaneamente e incubados para o ° c 37 por 7 dias, ao agitar em um misturador orbital ajustado em 1.000 rpm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 . Métodos de coloração para microscopia eletrônica de transmissão. Diagrama de coloração negativa para microscopia eletrônica. A) imagens que descrevem grades de amostras de microscopia eletrônica. A grade tem um lado maçante ou leve e um lado brilhante ou escuro. O lado brilhante/escuro é revestido com um filme de apoio formvar/carbono. B) ilustração do procedimento de coloração. A grade é lado brilhante/escuro flutuado para baixo na primeira gota de ddH₂o para 1 minuto e o excesso é ímpios afastado com papel de filtro. O processo é repetido com a segunda gota de DDH₂o, PFFS diluídos ou monómeros, duas gotas de acetato de uranilo, e duas gotas adicionais de DDH₂o. grades podem ser armazenadas em uma caixa de grade até imaged. Barra de escala = 3 mm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 . Montagem de seringas de agulhas de vidro personalizadas. Diagrama das etapas necessárias para montar seringas de agulha de vidro anexadas. Os tubos capilares de vidro siliconized são puxados e cortados no meio para produzir as agulhas de vidro. A tubulação do envoltório do psiquiatra é usada para preparar a agulha do metal e para dar forma a um selo interno quando a agulha de vidro é deslizada na agulha do metal. Duas camadas adicionais de tubulação do shrink-wrap que sobrepõem a base da agulha de vidro e a agulha do metal são adicionadas consecutivamente e o calor aplicou-se para fixar a agulha de vidro e para dar forma a um selo água-apertado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4 . Visualização de monômeros α-SYN e fibrilas α-SYN via microscopia eletrônica de transmissão. Micrografias representativas de monômeros α-SYN e fibrilas. Painéis superiores: rato e monômero α-SYN humano. Painéis médios: comprimento total do rato e humanos α-SYN PFFs. painéis inferiores: mouse e humanos α-SYN PFFs após sonication. Gráfico inferior: distribuição de mouse sonicado e humanos α-SYN PFF comprimentos. Barra de escala = 500 nm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5 . Confirmação de estruturas amilóides por ensaio tioflavina T. Medida do sinal fluorescente do rato e do monômero humano do α-SYN e das amostras de pff. Esquerda: resultados do rato α-SYN monômeros e α-SYN PFFs. Direita: resultados de monômeros α-SYN humanos e PFFs α-SYN. Um controle negativo do dPBS é mostrado em cada gráfico. Todas as medições são expressas em unidades fluorescentes relativas (RFU). As colunas indicam os meios do grupo, as barras de erro representam o erro padrão de ± 1 da média. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6 . Ensaio de sedimentação para α-SYN. imagens de géis manchados de Coomassie. As bandas mostradas estão em aproximadamente 14 kDa com base na escada de proteínas. Esquerda: monômero do rato e PFFs. Direita: monómeros humanos e PFFs. Para todas as amostras de monômero e PFF, a pelota de ressuspensão (P) e o sobrenadante (S) são mostrados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7 . Características das inclusões no modelo do rato que confirma a patologia do α-SYN. Micrografias representativas do substância negra nigra pars compacta em 2 meses após a injeção. Esquerda: neurônios contendo pSyn e contramanchado com violeta cresilo. Médio: os neurônios positivos de Thioflavin S. Direita: inclusões contendo α-SYN resistentes à proteinase K. barra de escala = 50 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

A produção de PFFS α-SYN capazes de semeadura neurônios e levando a Lewy corpo-como inclusões é dependente de vários fatores e etapas. Um fator crítico é que os monómeros utilizados para a geração de fibrilas precisam ser especificamente formulados paraa fibrilização^4,9,14,15. Se os monómeros não forem formulados para fibrilização, as fibrilas não podem formar-se ou as fibrilas que formam não podem produzir patologia α-SYN. Da mesma forma, o tampão que os monómeros também influenciam a fibrilização. Como tal, para os melhores resultados, a concentração de sal deve ser de aproximadamente 100 mM NaCl e pH entre 7,0 e 7,3. Uma etapa inicial que introduz a variabilidade é o método pelo qual o conteúdo inicial de proteína é determinado, com a medição em A280 susceptível de produzir resultados mais precisos e, portanto, é o método preferencial. A discrepância na concentração proteica pode diminuir a eficácia do processo de fibrilização, bem como alterar a concentração assumida de PFF utilizada em experimentos. Ambos podem levar a uma diminuição na eficiência de semeadura e variação de lote entre experimentos.

As etapas iniciais do controle da qualidade confirmarão características críticas dos PFFS, especificamente que têm uma conformação fibrilary (microscopia de elétron), contêm estruturas do amilóide (ensaio do thioflavin T), e são pelletable (ensaio do sedimentation). É importante notar que os resultados do ensaio de tioflavina T flutuarão com o tempo e não são uma medida direta da quantidade de estruturas amilóides presentes, em vez disso, o ensaio de tioflavina T deve ser utilizado apenas como um indicador da presença de estruturas amilóides dentro a amostra. Thioflavin T é normalmente utilizado em ensaios in vitro, tais como o referido ensaio para mostrar as fibrilas contêm estruturas amilóides. Alternativamente, a tioflavina S é usada no tecido para detectar estruturas amilóides, como mostrado na Figura 7. Em relação ao ensaio de sedimentação, os resultados mostram apenas que os PFFs são encontrados predominantemente na fração peletizável. Como as amostras são executadas em condições de desnaturação, uma única faixa proeminente de aproximadamente 14 kDa, o tamanho dos monômeros α-SYN, está presente nos géis. Isto é ao contrário das bandas múltiplas presentes em pesos moleculares mais elevados que seria esperado com PFFs se um gel nativo ou não-desnaturação foi usado. Por fim, a aprovação bem-sucedida de todos esses passos de controle de qualidade inicial não garante a atividade de semeadura de inclusão α-SYN. Por esta razão, experimentos de cultura celular ou uma pequena coorte de animais injetados cirurgicamente devem ser usados para testar a eficácia dos PFFs antes de usar em experimentos maiores.

Sonication é um passo crucial no processo e os parâmetros serão diferentes dependendo do modelo de sonicador usado. Os parâmetros de sonicação devem ser aplicados e verificados para mostrar que fragmentos curtos de PFF foram produzidos. O tamanho do fibril tem o rolamento na semeadura, com as fibrilas mais curtas que semeam mais eficientemente. Embora a semente mais curta dos fibrilas mais eficientemente, este platôs do efeito e o comprimento optimal de pff são aproximadamente 50 nanômetro^4,18. Também é importante não over-SONICATE as amostras e expor os PFFs ao calor excessivo, pois isso pode diminuir a eficiência de semeadura. Estes PFFs sonicated devem ser testados para a eficácia na cultura pequena da pilha ou experimentos in vivo antes do uso em experimentos de maior escala. Como diferentes sessões de sonication têm o potencial para introduzir a variabilidade, os grupos de tratamento experimental devem ser planejados em conformidade.

Ao entregar PFFS in vivo, a localização do (s) local (es) de injeção e a quantidade total de PFFS utilizados podem afetar o número de neurônios que desenvolverão inclusões, bem como a extensão da neurodegeneração^7,14. As coordenadas no protocolo fornecem um lugar a começar, mas devem ser testadas dentro do laboratório para assegurar-se de que a região desejada do alvo desenvolva a patologia do α-SYN antes do uso em experimentos em grande escala. Se desejado, o rastreamento de corante ou grânulos fluorescentes pode ser usado como uma forma de testar a segmentação regional antes de usar PFFs. A quantidade de PFFS utilizada in vivo varia entre os grupos, sendo que a maioria dos grupos utiliza um total entre 5 a 20 μg de PFFS em um ou dividido entre dois locais de injeção^{1,2,3,4,5 , 6} anos de ^{, 7} anos de ^{, 14}. como o número de locais de injeção, localização de locais de injeção, e quantidade de PFFS injetado pode efeito resultados e progressão da synucleinopathy, os resultados a jusante dos parâmetros utilizados devem ser caracterizados antes de usar o modelo para testar as intervenções potenciais ou examinar as características temporais do modelo.

Ao selecionar um modelo a ser usado para testar a terapêutica ou estudar a progressão da doença, o modelo utilizado deve ser selecionado para melhor responder à pergunta feita. Nem todos os modelos possuirão determinadas características da doença do PD, ou oferecerão o timeframe necessário para testar intervenções potenciais. O modelo de PFF recapitula características chaves do paládio, tal como a patologia do α-SYN e o neurodegeneração, e pode conduzir aos prejuízos modestos do motor. O modelo oferece um tempo-curso previsível e prolongado, onde as inclusões formam meses antes da neurodegeneração. Isso permite que os pesquisadores examinem e explorem as diferentes fases ao longo da progressão prolongada da synucleinopatia. Espera-se que o uso atual e futuro do modelo global seja benéfico no estudo da progressão da doença e no desenvolvimento de novas terapias.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1x Dulbecco' s solução salina tamponada com fosfato	Thermo Fisher (Gibco)	14190144
anticorpo anti-alfa-sinucleína (fosforilada na serina 129)	Abcam	AB184674
anticorpo anti-alfa-sinucleína	Abcam	AB15530
ácido bicincônico	Thermo Fisher (Pierce)	PI23228
Tubo retrátil médico transparente (0,036" de diâmetro interno)	Nordson Medical	103-0143
Tubo retrátil médico transparente (0,044" de diâmetro interno)	Nordson Medical	103-0296
Sulfato de cobre	Thermo Fisher (Pierce)	PI23224
Eppendorf ThermoMixer C	Eppendorf	2231000574
Eppendorf Tampa aquecida ThermoTop	Eppendorf	5308000003
Formvar/Carbono Electron	Microscopy Sciences	FCF300-
Tubo capilar de vidro (0,53 mm de diâmetro externo; 0,09 mm de diâmetro interno; 54 mm de comprimento)	Drummond	22-326223
Extrator de agulha de vidro	Seringa Narishige	PC-10
Hamilton	Hamilton	80000
Monômero de alfa-sinucleína humana para gerar fibrilas pré-formadas	Proteos	RP-003
Monômero de alfa-sinucleína de camundongo para gerar fibrilas pré-formadas	laranja Proteos	RP-009
(diâmetro interno de 0,021")	Nordson Medical	103-0152
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7543
Proteinase K	Invitrogen	25530015
Qsonica ponta	de 3,2 mmQsonica	4422
Qsonica Q125 sonicator	Qsonica	Q125
Tioflavina S	Sigma-Aldrich	T1892
Tioflavina T	EMD Millipore	596200
ToxinSensor Cromogênico LAL Kit de Ensaio de Endotoxina	Genscript	L00350C
Acetato de uranila	Microscopia Eletrônica Ciências	22400