A imagem latente ótica de Transcranial permite a imagem latente do largo-campo do transporte do líquido cerebrospinal no córtice de ratos vivos através de um crânio intacto.
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Artigo de método
In vivo Imaging do transporte de fluido cefalorraquidiano através do crânio do rato intacto usando fluorescência macroscopia
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O fluxo de líquido cefalorraquidiano (LCR) em roedores tem sido largamente estudado com quantificação ex vivo de Traçadores. As técnicas tais como a microscopia do dois-fotão e a imagem latente de ressonância magnética (MRI) permitiram in vivo a quantificação do fluxo do CSF mas são limitadas por volumes reduzidos da imagem latente e pela baixa definição espacial, respectivamente. O trabalho recente constatou que o LCR entra no parênquima cerebral através de uma rede de espaços perivasculares em torno das artérias piais e penetrantes do córtex do roedor. Esta entrada perivascular do CSF é um excitador preliminar do sistema glymphatic, um caminho implicado no afastamento de solutos metabólicos tóxicos (por exemplo, amyloid-β). Aqui, nós ilustramos uma técnica macroscópica nova da imagem latente que permita o tempo real, imagem latente mesoscópicos de traçadores fluorescentes do CSF através do crânio intacto de ratos vivos. Este método minimamente invasivo facilita uma infinidade de experimentos experimentais e permite o teste único ou repetido da dinâmica do LCR. Os macroscópios têm alta resolução espacial e temporal e seu grande pórtico e distância de trabalho permitem a criação de imagens durante a execução de tarefas em dispositivos comportamentais. Esta aproximação da imagem latente foi validada usando a imagem latente do dois-fotão e as medidas da fluorescência obtidas desta técnica correlacionam fortemente com a fluorescência ex vivo e a quantificação de Tracers rádio-etiquetados. Neste protocolo, nós descrevemos como a imagem latente macroscópica Transcranial pode ser usada para avaliar o transporte glymphatic em ratos vivos, oferecendo uma alternativa acessível às modalidades mais caras da imagem latente.
Introdução
O líquido cefalorraquidiano (LCR) Bane o cérebro e a medula espinhal e está envolvido na manutenção da homeostase, fornecendo nutrientes e regulando a pressão intracraniana1. O CSF no espaço subarachnoid entra no cérebro através de uma rede de espaços perivasculares (PVS) que cercam artérias pial corticais e flui então para baixo ao longo das arteríolas penetrantes2. Uma vez no parênquima, as trocas de LCR com fluido intersticial (ISF), transportando metabólitos nocivos como amiloide-β (aβ) e proteínas tau agregam fora do cérebro através de intervalos de matéria branca de baixa resistência e espaços perivenosos
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Protocolo
Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê universitário de recursos animais (UCAR, protocolo n º 2011-023) da Universidade de Rochester e realizados de acordo com o guia NIH para o cuidado e uso de animais de laboratório.
1. preparando a cânula da cisterna magna, a placa principal, e o suporte principal
- Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos e placas de cabeça antes da cirurgia.
Nota: os traçadores fluorescentes são entregados diretamente no CSF através de um cannulation do Magna do cisterna. Para instruções detalhadas sobre este procedimento, por favor consulte Xavier et al9. - Mom....
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Resultados
O afluxo do CSF é imaged em um Macroscópio epifluorescente (Figura 1a), que permita a imagem latente mesoscópicos do transporte do Tracer do CSF no córtice murino. A placa da cabeça do inteiro-crânio permite o visualização dos ossos nasais rostral, dos ossos frontais e parietal no centro, e da parcela rostral do osso interparietal caudalmente (Figura 1b). Durante a imagem, as suturas nasofrontal, sagital, coronal e lambdóide podem ser prontamente identificadas (.......
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Discussão
Nós descrevemos um protocolo detalhado para executar a imagem latente Transcranial do CSF em ratos vivos usando macroscópios e traçadores fluorescentes comercialmente-disponíveis. Esta técnica é simples e minimamente invasiva, mas quantitativa. A imagem latente in vivo correlaciona bem com os métodos sensíveis tais como a contagem líquida do cintilação de traçadores rádio-etiquetados que incluem 3H-Dextran e 14C-Inulin após a entrega do cm, e com a quantificação ex vivo da seção coronal
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de distúrbios neurológicos e AVC e pelo Instituto Nacional de envelhecimento (institutos nacionais de saúde dos EUA; R01NS100366 e RF1AG057575 a MN), o programa de redes de excelência transatlântica Fondation Leducq e o programa de investigação e inovação da UE Horizon 2020 (subvenção n. º 666881; SVDs @ Target). Também gostaríamos de agradecer a Dan Xue pela assistência especializada com ilustrações gráficas.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,25% Bupivacaína HCl | Universidade de Rochester Vivarium | ||
| 100 µ L Seringa à prova de gás modelo 1710 TLL, PTFE Luer Lock | Hamilton Company | 81020 | |
| A-M Systems Cimento dental em pó | Fisher | Scientific NC9991371 | |
| Carprofeno | Universidade de Rochester Biotério | ||
| Clorexidina | Prevantics | B10800 | |
| Câmera CMOS | Hammamatsu | ORCA Flash 4.0 | |
| Placa de cabeça | Universidade de Rochester | Sem catálogo # | Feito sob medida na oficina mecânica da Universidade de Rochester |
| Cautério de Alta Temperatura | Bovie Medical Corporation | AA01 | |
| Acelerador Insta-set | Bob Smith Industries | BSI-151 | |
| Isoflurano - Fluriso | Vet One | 502017 | University of Rochester Vivarium |
| Ketamine | Strong Memorial Hospital Pharmacy | ||
| Krazy Glue | Elmer's Products, Inc | Sem catálogo #, veja o link nos comentários | https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG |
| Fita cirúrgica Micropore | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
| Paraformaldeído | Sigma-aldrich | P6148 | |
| PE10 - Polietileno .011" x .024" por pé, 100 ft. contínuo | Braintree Scientific | PE10 100 FT | |
| Bomba 11 Elite Infusão Apenas Seringa Dupla | Harvard Apparatus | 70-4501 | |
| POMADA VET PURALUBE | Dechra | ||
| Puritan PurSwab Bastões de Limpeza com Ponta de Algodão | Fisher Scientific | 22-029-553 | |
| Olympus | MVX10 | ||
| Placa de Suporte de Cabeça Simples (para ratos) | Narishige International USA Inc | MAG-1 | |
| Agulhas de uso único, BD Medical | VWR | BD305106 | |
| Almofadas de preparação de álcool estéril | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| LED ajustável | PRIOR Lumen 1600-LED | ||
| Xylazine | University of Rochester Vivarium |
Referências
- Tumani, H., Huss, A., Bachhuber, F. The cerebrospinal fluid and barriers - anatomic and physiologic considerations. Handbook of Clinical Neurology. , 21-32 (2017).
- Jessen, N. A., Munk, A. S., Lundgaard, I., Nedergaard, M. The Glymphatic System: A Beginner's Guide. Neurochemi....
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Reimpressões e permissões
