A tecnologia CRISPR-Cas9 fornece um método eficiente para editar precisamente o genoma dos mamíferos em qualquer tipo de célula e representa um novo meio para realizar telas genéticas de todo o genoma. Um protocolo detalhado que discute as etapas necessárias para o desempenho bem-sucedido de telas de CRISPR-Cas9 agrupadas em todo o genoma é fornecido aqui.
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Artigo de método
Telas genéticas com base em CRISPR agrupadas em células de mamíferos
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A edição do genoma usando o sistema CRISPR-CAS avançou enormente a capacidade de editar precisamente os genomas de vários organismos. No contexto das células de mamíferos, esta tecnologia representa um novo meio para realizar telas genéticas de todo o genoma para estudos de genômica funcional. Bibliotecas de guia RNAs (sgRNA) visando todos os quadros de leitura aberta permitem a geração facile de milhares de perturbações genéticas em um único pool de células que podem ser rastreados para fenótipos específicos para implicar a função gênica e processos celulares em um forma imparcial e sistemática. As telas CRISPR-CAS fornecem aos pesquisadores um método simples, eficiente e barato para descobrir os esquemas genéticos para fenótipos celulares. Além disso, a análise diferencial de telas realizadas em várias linhagens celulares e de diferentes tipos de câncer pode identificar genes que são contextualmente essenciais nas células tumorais, revelando potenciais alvos para terapias anticâncer específicas. A realização de telas de todo o genoma em células humanas pode ser assustadora, pois isso envolve o manuseio de dezenas de milhões de células e requer a análise de grandes conjuntos de dados. Os detalhes dessas telas, como a caracterização da linha celular, as considerações da biblioteca CRISPR e a compreensão das limitações e capacidades da tecnologia CRISPR durante a análise, são muitas vezes negligenciadas. Aqui é fornecido um protocolo detalhado para o desempenho bem-sucedido de telas baseadas em agregados de CRISPR-Cas9 em todo o genoma.
Introdução
CRISPR-CAS, abreviação de repetições palindrômicas curtas interespaçadas regularmente e nuclease associada a CRISPR, consiste em uma única proteína nuclease (por exemplo, Cas9) em complexo com um RNA guia sintético (sgRNA). Este complexo de ribonucleoproteína tem como alvo a enzima Cas9 para induzir quebras de DNA de dupla cadeia em um locus genómico específico1. As rupturas dobro-encalhado podem ser reparadas através da reparação dirigida homologia (HDR) ou, mais geralmente, com a junção não-homóloga da extremidade (nhej), um mecanismo de reparo propenso ao erro que resulte na inserção e/ou nos deleções (indels) que interrompem freqüentemente ....
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Protocolo
Os experimentos descritos abaixo devem seguir as diretrizes do escritório de saúde e segurança ambiental do Instituto.
1. amplificação do plasmídeo da biblioteca de Lentivirus CRISPR sgRNA
- Diluir a biblioteca de DNA de plasmídeo CRISPR sgRNA pronta para 50 ng/μL em TE (por exemplo, TKOv3).
- Electroporate a biblioteca usando pilhas electrocompetentes. Configure um total de quatro reações de electroporação, conforme descrito abaixo.
- Adicionar 2 μL de 50 ng/μL de biblioteca TKO a 25 μL de células electrocompetentes descongelados para as cobetas pré-refrigeradas (1,0 mm) no gelo.
- Electroporate usando ajuste....
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Resultados
Visão geral do fluxo de trabalho de triagem CRISPR em escala de genoma
A Figura 1 ilustra uma visão geral do fluxo de trabalho de triagem crispr agrupado, começando com a infecção de células-alvo com Lentivirus da biblioteca crispr em um moi baixo para garantir eventos de integração única e representação de biblioteca adequada (tipicamente 200-para 1000 -fold). Após a infecção, as c.......
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Discussão
Devido à sua simplicidade de uso e alta maleabilidade, a tecnologia CRISPR tem sido amplamente adotada como a ferramenta de escolha para a edição precisa do genoma. A triagem de CRISPR agrupada fornece um método para interrogar milhares de perturbações genéticas em um único experimento. Em telas agrupadas, as bibliotecas sgRNA servem como códigos de barras moleculares, pois cada sequência é única e é mapeada para o gene alvo. Isolando o ADN genomic da população da pilha, os genes que causam o phenotype do interesse podem.......
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Divulgações
Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo genoma do Canadá, o fundo de investigação de Ontário, e os institutos canadenses de pesquisa em saúde (MOP-142375, PJT-148802).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| de 0,22 mícron | |||
| 30° incubadora | |||
| 37° C agitando incubadora | |||
| 37° C, 5% CO2 incubadora | |||
| 5 M NaCl | Promega | V4221 | |
| 50X tampão TAE | BioShop | TAE222.4 | |
| 6 N Solução de ácido clorídrico | BioShop | HCL666.500 | |
| 95% Etanol | |||
| Alamar azul | ThermoFisher Scientific | DAL1025 | |
| Transiluminador de luz azul | ThermoFisher Scientific | G6600 | |
| Albumina de soro bovino, isolamento de choque térmico, fração V. Min. 98%, grau de biotecnologia | Bioshop | ALB001.250 | |
| Modificação de Dulbecco da Eagles Medium | Life Technologies | 11995-065 | Meios de cultura de células |
| Cubetas de eletroporação | BTX | 45-0134 | |
| Células eletrocompetentes de Electroporator | BTX | 45-0651 | |
| Endura | Lucigen | 90293 | |
| Soro bovino fetal | GIBCO | 12483-020 | |
| HEK293T as pilhas de empacotamento | ATCC | CRL-3216 | recomendam o número da passagem < 15 |
| Brometo de hexadimetrina (Polybrene) | Sigma | H9268 | Polímero catiônico para aumentar a eficiência da transdução |
| Placas de ágar brometo de hexadimetrina (Polybrene) | |||
| LB com carbenicilina | |||
| LB meio com carbenicilina | |||
| Escada de DNA de baixo peso molecular | New England Biolabs | N3233S | |
| Espectrofotômetro Nanodrop | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | |
| NEBNext Ultra II Q5 Master Mix | New England Biolabs | M0544L | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Mídia de soro reduzida |
| Kit de purificação maxi de plasmídeo | Qiagen | 12963 | |
| pMD2.G (plasmídeo de envelope) | Plasmídeo Addgene #12259 | sistema lentiviral | |
| psPAX2 (plasmídeo de embalagem) | Addgene | Plasmid #12260 | sistema lentiviral |
| Puromicina | Wisent | 400-160-UG | |
| Kit de extração de gel QIAquick | Qiagen | 28704 | |
| Qubit dsDNA BR ensaio | ThermoFisher Scientific | Q32853 | |
| Qubit fluorômetro | ThermoFisher Scientific | Q33226 | |
| RNAse A | Invitrogen | 12091021 | |
| S.O.C meio de recuperação | Invitrogen | 15544034 | |
| SYRB Safe DNA gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - Cas9 incluído | Addgene | Addgene ID #90203 | Biblioteca CRISPR em todo o genoma, inclui Cas9, 71,090 sgRNA |
| Biblioteca Toronto KnockOut CRIPSR (TKOv3) - não-cas9 | Addgene | Addgene ID #125517 | Biblioteca CRISPR em todo o genoma, não-Cas9, solução de 71.090 sgRNA |
| Tris-EDTA (TE), pH8.0 | |||
| Agarose UltraPure | ThermoFisher Scientific | 16500500 | |
| Wizard | Reagente de | A1120 | |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 06 365 809 001 | Reagente de transfecção à base de lipídios |
Referências
- Jiang, F., Doudna, J. A. CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms. Annual Review of Biophysics. 46, 505-529 (2017).
- Baliou, S., et al. CRISPR therapeutic tools for complex genetic disorders and cancer (Review). International Journal of Oncology. <....
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Reimpressões e permissões
