Summary
Qui, presentiamo un protocollo per formare con precisione l'endotelio emogenico dalle cellule staminali pluripotenti umane in una condizione senza alimentatore e xeno. Questo metodo avrà ampie applicazioni nella modellazione della malattia e nello screening per i composti terapeutici.
Abstract
La derivazione di cellule staminali ematopoietiche funzionali (HPG) da cellule staminali pluripotenti umane (PSC) è stato un obiettivo sfuggente per i trapianti autologhi per il trattamento di disturbi ematologici e maligni. L'endotelio emogenico (HE) è una piattaforma suscettibile per produrre HSPC funzionali per fattori di trascrizione o per indurre i linfociti in modo robusto. Tuttavia, i metodi attuali per derivare HE sono costosi o variabili nel rendimento. In questo protocollo, abbiamo stabilito un metodo conveniente e preciso per derivare HE entro 4 giorni in una condizione definita feeder e xeno-free. La risultante HE è stata sottoposta a una transizione endoteliale-ematopoietica e ha prodotto CD34-CD45- progenitori ematopoietici clonogeni. La capacità potenziale della nostra piattaforma per la generazione di HSPC funzionali avrà ampie applicazioni nella modellazione e nello screening delle malattie per i composti terapeutici.
Introduction
Lo sviluppo di nuove terapie per disturbi ematologici e immunologici è stato ostacolato dalla mancanza di piattaforme robuste per la modellazione delle malattie e dallo screening farmacologico ad alto consumo con cellule staminali ematopoietiche autologo (HSC) derivate dal paziente cellule staminali pluripotenti (PSC). La svolta della tecnologia indotta (i)PSC promette di modellare le malattie delle cellule dei pazienti, ma la creazione di HSC funzionali da iPSC dei pazienti è stata sfuggente. Al fine di derivare HSC da RPC umane, la corretta induzione del patterning embrionale e dei programmi trascrizionali è la chiave1,2,3,4,5,6, 7,8. I recenti progressi nello sviluppo ematopoietico hanno dimostrato il ruolo dell'endotelio emogenico (HE) nello sviluppo dell'HSC9. Egli può essere indotto da PSC ed è suscettibile di intervento a valle come il trasferimento genico10,11,12,13. Utilizzando HE come piattaforma, la combinazione di 5 fattori di trascrizione (ERG, HOXA5, HOXA9, LCOR, RUNX1) ha indotto con successo gli HSC funzionali che innevano i linfa a lungo termine e si differenziano in più lignaggi14. Tuttavia, la generazione variabile e inefficiente di HE da PSC ha ostacolato la manipolazione sistematica e l'analisi delle cellule insieme alla produzione pronta all'uso e all'induzione su larga scala di cellule ematopoietiche per uso clinico.
Qui, descriviamo un metodo conveniente e preciso per derivare HE in 4 giorni con una condizione definita senza alimentatore e xeno. In questo metodo, la formazione di sferoidi e la ri-appiattimento spontaneo su iMarix-511 assicurano una densità costante delle colonie di PSC, che è fondamentale per l'induzione efficiente delle cellule HE.
Protocol
1. Reagenti
- Linee cellulari (PSC umane): ottenere cellule staminali embrionali (ESC) o linee iPSC 409B2 e 201B7(317-9)) e CBA11.
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Preparazione del reagente
- Mezzo di placcatura PSC: mescolare il supporto di manutenzione PSC con 10 SM Y-27632 e conservare a 4 gradi centigradi.
- PsC Spheroid appunta media: mescolare il mezzo di manutenzione PSC con 625–1,250 ng/mL ricombinante umano Laminin-511 E8 frammento (LM511-E8) (a seconda della linea cellulare) poco prima dell'uso.
NOT: LM511-E8 può essere miscelato in supporti15. Un'altra matrice, come la laminina-511 a lunghezza intera, deve essere prerivestita, e anche lo ha fatto, non sostengono gli organorizzati mesodermici adered adered durante il processo di differenziazione. - Giorno 0 differenziazione media: mescolare il mezzo basale mesodermico con 2 unità DiM, 80 ng/mL proteina morfogenetica dell'osso 4 (BMP4) e 80 ng/mL Fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF).
- Mezzo di differenziazione del secondo giorno: mescolare il mezzo basale emogenico con 1 SB431542, 80 ng/mL VEGF e 100 ng/mL Fattore di cellule staminali (SCF).
- Preparare il buffer di fosfato (PBS) senza calcio o magnesio (vedere Tabella dei materiali).
- Buffer di acido etilenediaminea-tracetaceto (EDTA): aggiungere 1 mL di 0,5 M EDTA a 500 mL di PBS.
- EHT medio: mescolare mezzo basale ematopoietico con 50 ng/mL SCF, 20 ng/mL thrombopoietin (TPO), 50 ng/mL Fms-correlate tirosine chinaase 3 ligando (Flt-3L), 20 ng/mL Interleukin-6/Interleukin-6 recettore alfa (IL-6/IL-6R), insulino-trasferino-selenio-etanolamina, L-glutamina e Penicillina/Streptomycin/Amphotericin B.
- Buffer FACS: mescolare PBS con 2% siero di vitello fetale e 1 mM EDTA.
- Preparare il buffer diseparazione magnetica (vedere Tabella dei materiali ).
- Preparare i supporti basati sulla metilcellulosa (vedere Tabella dei materiali).
2. Formazione colonia PSC
- Coltivare hPSCs fino a 70 – 80% di confluenza su una piastra 6-po rivestita di 4 LM511-E8 rivestita in mTeSR1 in un'incubatrice 37 C con 5% di CO2.
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Dissociazione PSC (Giorno -4)
- Aspirare il mezzo e lavare le cellule con PBS due volte. Sciacquare le cellule con soluzione di dissociazione. Incubare a 37 gradi centigradi per 15 min (le cellule non si scistreranno in questo momento).
- Sospendere le cellule nel mezzo di manutenzione PSC, trasferire la sospensione in un tubo di dimensioni adeguate e centrifugare le cellule a 200 x g per 3 min. Aspirate il supernatante e sospendere le cellule in PSC plating medium.
- Piastra recellina della sospensione PSC ad una densità di 48.000 – 70.000 cellulecm -2 (a seconda della linea cellulare) su un recipiente di plastica microfabbricato e incubare durante la notte nell'incubatrice di 37 gradi centigradi con 5% di CO2.
NOT: Si consiglia un pozzo di 100 -1 di sospensione cellulare in un recipiente di plastica microfabbricato da 96 pozze. In genere si seminano 20.000 cellule ben-1 in una piastra di 96 pozzetti per produrre circa 100 sferoidi. -
Appuntando sferoidi PSC su LM511-E8 (Giorno -3)
- Raccogliere gli sferoidi PSC in un tubo conico da 15 mL pipettando delicatamente con micropipetter P1000 e lasciare che gli sferoidi si fermino a temperatura ambiente per 2 min per precipitare per gravità. Aspirare il super-attuoso.
- Sospendere nel mezzo di placcatura sferoide, erogare la sospensione in una piastra di coltura a 6 pozze non rivestita ad una densità di 4-spheroids cm-2 e coltura nell'incubatrice a 37 gradi centigradi con 5% di CO2 per tre giorni.
3. Induzione emogenica (giorno 0)
- Aspirare il mezzo, aggiungere il mezzo di differenziazione Day0 e la coltura nell'incubatore di 37 gradi centigradi con il 5% O2 e 5% di CO2 (incubatore ipossico).
- Dopo due giorni di cultura nel mezzo di differenziazione Day0, aspirare il mezzo, quindi aggiungere Day2 differenziazione medio e cultura nell'incubatrice ipossica.
4. Isolamento dell'endotelio emogenico (giorno 4)
- Due giorni dopo, aspirare il mezzo e lavare le cellule con PBS due volte. Sciacquare le cellule con soluzione di dissociazione. Incubare nell'incubatrice a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2 per 30 min.
- Sospendere delicatamente le cellule in 1 mM EDTA per dissociare al livello a cella singola, trasferire la sospensione in un tubo conico da 50 mL e centrificare le cellule a 200 x g per 3 min. Aspirare il supernatante e sospendere il pellet cellulare con 300 buffer m inv.
- Aggiungete 100 l di CD34e fate pipistrare delicatamente. Incubare per 30 min a temperatura ambiente. È possibile utilizzare fino a 20 milioni di celle per CD34 da 100 .
- Filtrare la sospensione attraverso un colino cellulare da 40 m.
- Separare il CD34- celle utilizzando un separatore magnetico.
5. Induzione della transizione endoteliale-ematopoietica (EHT)
-
Rivestimento di fibronectina
- Preparare il volume richiesto di 5 mafibrosi di 5 g/mL con la diluizione di 1 fibronectin a mg/mL in PBS.
- Distribuisci 0,5 mL della soluzione di rivestimento in ogni pozzo di una piastra di coltura di 24 pozze. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 30 min.
- Centrifugare il CD34 ordinato- cellule a 200 x g per 3 min. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di mezzo EHT.
- Determinare la densità delle cellule vitali con il contatore cellulare. Regolare la densità della cella a 200.000 celle mL-1 aggiungendo il supporto EHT.
- Aspirare e scartare la soluzione di rivestimento dal pozzo rivestito di fibronectina. Distribuisci 0,5 mL di CD34- sospensione cellulare in ogni pozzo rivestito di fibronectina.
- Incubare nell'incubatrice ipossica per una settimana.
6. Analisi della citometria di flusso delle cellule ematopoietiche
- Raccolta di celle mobili: Trasferire il mezzo di coltura in un tubo conico da 15 mL. Centrifugare il mezzo a 200 x g per 3 min. Aspirate il supernatante.
-
Raccolta di cellule aderenti
- Lavare le cellule con 0,5 mL di PBS due volte.
- Sciacquare le cellule con soluzione dissociante e aspirare il liquido in eccesso.
- Incubare la piastra nell'incubatrice da 37 gradi centigradi per 5 min.
- Risospendere le celle in 1 mL di buffer FACS.
- Mescolare le cellule galleggianti e le cellule aderenti.
- Centrifugare le cellule a 200 x g per 3 min. Aspirate il super-natante. Risospendere in 50 : L di buffer FACS. Incubare le cellule con anticorpi anti-CD34 e anti-CD45 per 1 h a temperatura ambiente al buio.
- Lavare le cellule con PBS due volte e centrifugare a 200 x g per 3 min. Aspirare il supernatante e respendere in 0,5 mL di tampone FACS con 0,5 g / mL 4',6-diamidino-2-fenilondole.
- Misurare l'espressione CD34 e CD45 per citometro di flusso.
7. Unità di formazione colonia (CFU) Saggio di cellule ematopoietiche
- Raccolta di cellule ematopoietiche: Trasferire il mezzo dalla coltura a un tubo conico da 15 mL. Sciacquare delicatamente il pozzo due volte con PBS.
- Centrifugare le cellule a 200 x g per 3 min. Aspirate il super-natante. Risospendere in 1 mL di mezzo EHT. Determinare il numero di cella con il contatore di celle.
- Aggiungere un volume di sospensione equivalente a 10.000 cellule a 3 mL di media a base di metilcellulosa integrati con antibiotici e mescolare bene 5 volte con una siringa da 16 G o 18 G.
- Distribuisci l'intera sospensione multimediale a base di metilcellulosa in ogni pozzo di una piastra di 6 pozze.
- Incubare nell'incubatrice a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2 per due settimane mantenendosi umido. Non disturbare il piatto. Le colonie sono sensibili al movimento.
- Dopo due settimane, contare le colonie al microscopio.
Representative Results
Uno schema di formazione di colonie di PSC è raffigurato nella Figura 1A. Gli sferoidi PSC si formano su un recipiente di plastica microfabbricato per un giorno. Come risultato rappresentativo, 20.000 409B2 cellule potrebbero essere maneggiate per 96 pozzetti di vaso di plastica microfabbricato, anche se altre linee cellulari possono richiedere una densità maggiore (30.000-40.000 cellule per 96-pozzetti di vaso di plastica micro-fabbricato). Queste sfere sono spontaneamente appiattite ad una cultura quasi bidimensionale quando placcate su un piatto di coltura in presenza di LM511-E8.
Uno schema di induzione emogenica è illustrato nella figura 1B. Quando le colonie di PSC crescono fino a un diametro di 750 m, il mezzo viene modificato in sequenza per indurre organoidi mesodermici. Le colonie di PSC diventeranno gradualmente una struttura di lato soleggiato durante la differenziazione agli organoidi mesodermici con un cambiamento medio sequenziale fino al giorno 4. Il giorno 4, l'endotelia emogenico è specificato dagli organoidi mesodermici mediante selezione magnetica e successivamente placcato su fibronectina nel mezzo EHT. 5-10 milioni di CD34-CD45- si prevedono cellule da sferoidi contenenti 1 milione di PSC (Figura 1C).
Si osserva che le cellule cambiano morfologicamente da cellule endoteliali a cellule ematopoietiche (Video supplementare 1). Un'immagine rappresentativa a contrasto di fase delle cellule progenitrici ematopoietiche dopo la stimolazione con cocktail ematopoietico il giorno 7 è mostrata nella Figura 2A. Le colonie cellulari ematopoietiche emersero nella cultura.
Un grafico di citometria a flusso rappresentativo è illustrato nella figura 2B. L'intera coltura viene stimolata con cocktail ematopoietico e il giorno 7 viene analizzata per l'espressione di CD34 e CD45 per citometria di flusso. Le cellule progenitrici ematopoietiche esprimono CD34 e CD45.
Un'affermazione della CFU ha mostrato la generazione di colonie di granulociti/macrofagi dal CD34- CD45- cellule progenitrici ematopoietiche (Figura 2C). Il numero di colonia stimato è 38 CFU-G/M per 10.000 celle (Figura 2D)
Figura 1: Schema delle colonie di PSC di tinto e successiva differenziazione ematopoietica tramite endotelio emogenico. (A) Processo schematico di formazione delle colonie di PSC. I PSC sono mantenuti su una piastra a 6 pozzetti rivestita LM511-E8 nel mezzo di manutenzione PSC. Il giorno -4, le cellule vengono staccate e dissociate a livello di singola cellula utilizzando una soluzione dissociante, successivamente placcate su recipienti di plastica microfabbricati nel mezzo di manutenzione PSC con Y-27632 e coltivati durante la notte per formare sferoidi. Il giorno -3, gli sferoidi sono placcati nel mezzo di manutenzione PSC con LM511-E8 e coltivati per tre giorni. Entro il giorno 0, gli sferoidi vengono spontaneamente appiattiti in una cultura quasi bidimensionale. Barre di scala ( 200 m. (B) Il giorno 0, il mezzo viene sostituito con il mezzo di differenziazione Day0 e coltivato nell'incubatrice ipossico. Il secondo giorno della differenziazione, il mezzo viene sostituito con il mezzo di differenziazione Day2. Il giorno 4 dell'arricchimento dell'endotelio emogenico, le cellule CD34sono smistate magneticamente e coltivate su una piastra da 12 pozzetti rivestita di fibronectina nel mezzo EHT per 6 giorni. (C) Rappresentazione flowcitometria stampa di CD45 e CD34 espressione di giorno 4 celle ordinate per CD34. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Analisi della proprietà ematopoietica. (A) Immagine rappresentativa a contrasto di fase delle cellule progenitrici ematopoietiche dopo la stimolazione con cocktail ematopoietico il giorno 7. Barra di scala (B) Grafico di citometria a flusso rappresentativo di CD45 e CD34 espressione di tutta la cultura su stimolazione con cocktail ematopoietico il giorno 7. (C) Immagine rappresentativa a contrasto di fase di una colonia di granulociti/macrofasi generata dalle cellule progenitrici ematopoietiche dell'11 giorno. Barra della scala : 500 m. (D) Numero di CFU per 10.000 celle. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Video supplementare 1: video EHT. Fare clic qui per scaricare questo file.
Discussion
Il nostro metodo di induzione definita senza alimentatore e xeno offre una piattaforma precisa ed economica per indurre le cellule HE in modo scalabile. La formazione fedele dell'endotelio emogenico nei protocolli convenzionali10,11,12,13,14 sono stati ostacolati dalla mancanza di un controllo preciso della densità e delle dimensioni della colonia di PSC, che influisce sull'efficienza della differenziazione diretta a morfogeni/citochine. Avevamo sperimentato l'incoerenza dell'induzione dell'endotelio emogenico in ogni lotto indipendente dai protocolli convenzionali. Il nuovo protocollo consente una stretta regolazione della densità e delle dimensioni della colonia di PSC, superando così l'incoerenza dell'induzione dell'endotelio emogenico.
Abbiamo sfruttato la formazione uniforme di sferoidi e successivamente abbiamo trasmesso una condizione definita senza alimentatore e xeno per formare HE in un totale di 4 giorni. Abbiamo confermato utilizzando tre linee cellulari indipendenti che la formazione di sferoidi assicura la formazione costante delle cellule HE. Come risultato rappresentativo, le linee cellulari 409B2 hanno prodotto 12,7%-23,6% CD34: efficienza cellulare basata su tre esperimenti indipendenti. Il fattore critico per piastrelle sferoidi PSC è LM511-E8. Non consigliamo di sostituendoquesto con altre matrici, come i prodotti Matrigel o laminin full-length nelle nostre esperienze. Abbiamo sperimentato che gli organoidi mesodermici erano facilmente staccati da Matrigel e persi durante il processo di differenziazione. E né Matrigel né laminina full-length non ancorano le cellule senza pre-rivestimento.
La potenziale limitazione di questo protocollo è che dipendiamo dal mezzo di manutenzione PSC per mantenere i PSC. Abbiamo testato altri media come StemFit, ma abbiamo compromesso l'induzione emogenica. Presumibilmente le cellule erano resistenti all'uscita dallo stato pluripotente nel nostro breve protocollo di induzione del tempo (4 giorni). Se uno mantiene i PSC in altri supporti, si consiglia di adattare le cellule nel mezzo di manutenzione PSC e condurre un paio di passaggi prima della differenziazione. Questa piattaforma consentirà la manipolazione sistematica e l'analisi delle cellule, e la produzione pronta all'uso e l'induzione su larga scala di cellule ematopoietiche per un potenziale uso clinico. Un obiettivo a lungo termine di questo sistema è quello di modellare le malattie dell'immunodeficienza nei modelli murini umanizzati per studiare i meccanismi cellulari e molecolari responsabili e condurre screening farmacologici.
Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Siamo grati ad Alina Li e Seiko Benno per la loro assistenza tecnica. Vorremmo anche ringraziare la signora Harumi Watanabe per aver fornito assistenza amministrativa e il dr. Peter Karagiannis per la modifica del documento. Questo lavoro è stato supportato dal Core Center for iPS Cell Research of Research Center Network for Realization of Regenerative Medicine dell'Agenzia Giapponese per la Ricerca E lo Sviluppo Medicina (AMED) [M.K.S.], il Programma per la Ricerca Sulle Malattie Intrattabili Utilizzando. Cellule iPS specifiche della malattia di AMED (17935423) [M.K.S.] e del programma Center for Innovation della Japan Science and Technology Agency (JST) [R.O. e M.K.S.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575 | 0.5 M EDTA |
| 40 μm cell strainer | Corning | 352340 | 40μM cell strainer |
| 6 well plate | Corning | 353046 | 6 well plate |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240-112 | Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B |
| anti-CD34 antibody | Beckman Coulter | A07776 | anti-CD34 antibody |
| anti-CD45 antibody | Biolegend | 304012 | anti-CD45 antibody |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP-010 | BMP4 |
| CD34 microbeads | Miltenyi | 130-046-703 | CD34 microbeads |
| CHIR99021 | Wako | 038-23101 | CHIR99021 |
| Essential 6 | Thermo Fisher Scientific | A15165-01 | Hemogenic basal medium |
| Essential 8 | Thermo Fisher Scientific | A15169-01 | Mesodermal basal medium |
| Ezsphere SP Microplate 96well | AGC | 4860-900SP | micro-fabricated plastic vessel |
| FCS | Biosera | FB-1365/500 | FCS |
| Fibronectin | Millipore | FC010-100MG | Fibronectin |
| Flt-3L | R&D Systems | 308-FK-005 | Flt-3L |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | L-Glutamine |
| IL-6/IL-6Rα | R&D Systems | 8954-SR | IL-6/IL-6Rα |
| iMatrix-511 | Matrixome | 892 001 | LM511-E8 |
| ITS-X | Thermo Fisher Scientific | 51500-056 | Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine |
| MACS buffer | Miltenyi | 130-091-221 | magnetic separation buffer |
| Methocult 4435MethoCult™ H4435 Enriched | STEMCELL TECHNOLOGIES | 04435 | Methylcellulose-based media |
| mTeSR1 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 85850 | PSC maintenance medium |
| PBS | nacalai tesque | 14249-24 | PBS |
| SB431542 | Wako | 031-24291 | SB431542 |
| SCF | R&D Systems | 255-SC-010 | SCF |
| Stemline II Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium | Sigma Aldrich | S0192-500ML | Hematopoietic basal medium |
| TPO | R&D Systems | 288-TPN | TPO |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12604-021 | dissociation solution |
| VEGF | R&D Systems | 293-VE-010 | VEGF |
| Y-27632 | Wako | 253-00513 | Y-27632 |
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