Summary
Aquí, presentamos un protocolo para formar con precisión endotelio hemogénico a partir de células madre pluripotentes humanas en una condición libre de alimentador y xeno. Este método tendrá amplias aplicaciones en el modelado de enfermedades y cribado de compuestos terapéuticos.
Abstract
La derivación funcional de células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) a partir de células madre pluripotentes humanas (PSC) ha sido un objetivo esquivista para los trasplantes autólogos para tratar trastornos hematológicos y malignos. El endotelio hemogénico (HE) es una plataforma amenable para producir HSCCP funcionales por factores de transcripción o para inducir linfocitos de una manera robusta. Sin embargo, los métodos actuales para derivar HE son costosos o variables en rendimiento. En este protocolo, establecimos un método rentable y preciso para derivar HE en un plazo de 4 días en una condición definida libre de alimentadores y xeno. El loque HE se sometió a una transición endotelial a hematopoyética y produjo PROgenitores hematopoyéticos cd34+CD45+ clonogénicos. La capacidad potencial de nuestra plataforma para generar HSCCP funcionales tendrá amplias aplicaciones en el modelado de enfermedades y cribado de compuestos terapéuticos.
Introduction
El desarrollo de nuevas terapias para trastornos hematológicos e inmunológicos se ha visto obstaculizado por la falta de plataformas robustas para el modelado de enfermedades y la detección de fármacos de alto rendimiento con células madre hematopoyéticas autólogas derivadas del paciente células madre pluripotentes (PSC). El avance de la tecnología inducida (i)PSC promete modelar enfermedades a partir de las células de los pacientes, pero el establecimiento de HSC funcionales a partir de iPSCs de pacientes ha sido esquiva. Con el fin de derivar HSCs de PSCs humanos, la inducción adecuada de patrones embrionarios y programas de transcripción es clave1,2,3,4,5,6, 7,8. Los progresos recientes en el desarrollo hematopoyético han demostrado el papel del endotelio hemogénico (HE) en el desarrollo de HSC9. Se puede inducir de los PSC y es susceptible de intervención posterior como transferencia de genes10,11,12,13. Utilizando HE como plataforma, la combinación de 5 factores de transcripción(ERG, HOXA5, HOXA9, LCOR, RUNX1)indujo con éxito HSC funcionales que injertan a largo plazo y se diferencian en múltiples linajes14. Sin embargo, la generación variable e ineficiente de HE a partir de PSCs ha obstaculizado la manipulación y el análisis sistemáticos de las células junto con la producción lista para usar y la inducción a gran escala de células hematopoyéticas para uso clínico.
Aquí, describimos un método rentable y preciso para derivar HE en 4 días con una condición definida libre de alimentador y xeno. En este método, la formación de esferoides y el re-aplanamiento espontáneo en iMarix-511 aseguran una densidad constante de las colonias de PSC, que es crucial para la inducción eficiente de las células HE.
Protocol
1. Reactivos
- Líneas celulares (PSC humanas): obtener células madre embrionarias (ESC) o líneas iPSC 409B2 y 201B7(317-9)) y CBA11.
-
Preparación de reactivos
- Medio de chapado PSC: mezcle el medio de mantenimiento del PSC con 10 M Y-27632 y guárdelo a 4oC.
- PSC Spheroid tiling medium: mezclar el medio de mantenimiento PSC con 625–1,250 ng/mL humano recombinante Fragmento Laminin-511 E8 (LM511-E8) (dependiendo de la línea celular) justo antes de su uso.
NOTA: LM511-E8 se puede mezclar en medios15. Otra matriz como la minin-511 de longitud completa necesita ser pre-recubierta, e incluso lo hacen, no sostienen organoides mesodérmicos adheridos durante el proceso de diferenciación. - Medio de diferenciación del día 0: mezclar el medio basal mesodermico con 2 M CHIR99021, 80 ng/mL Proteína morfogenética ósea 4 (BMP4) y 80 ng/ml Factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF).
- Medio de diferenciación del día 2: mezclar el medio basal hemogénico con 1 M SB431542, 80 ng/mL VEGF y 100 ng/mL Factor de células madre (SCF).
- Preparar solución salina tampón de fosfato (PBS) sin calcio o magnesio (Ver Tabla de Materiales).
- 1 mM tampón de ácido etilendiaminetetraacético (EDTA): añadir 1 mL de 0,5 M EDTA a 500 ml de PBS.
- Medio EHT: mezcla de medio basal hematopoyético con 50 ng/ml SCF, trombopoietin a 20 ng/ml (TPO), 50 ng/mL Fms-relacionado con la tirosina quinasa 3 ligando (Flt-3L), 20 ng/ml Interleucina-6/Interleucina-6 receptor alfa (IL-6/IL-6R), insulina-transferrina-selenio-etanolamina, L-glutamina y penicilina/estreptomicina/amphotericina B.
- Tampón FACS: mezclar PBS con 2% de suero de becerro fetal y 1 mM EDTA.
- Preparar el búfer de separación magnética (Ver Tabla de Materiales).
- Preparar medios basados en metilcelulosa (Ver Tabla de Materiales).
2. Formación de colonias PSC
- Cultivar hPSCs a 70 – 80% de confluencia en una placa de 0,5 g cm-2 LM511-E8 recubierta de 6pocillos en mTeSR1 en una incubadora de 37 oC con 5% de CO 2.
-
Disociación del PSC (Día -4)
- Aspirar el medio y lavar las células con PBS dos veces. Enjuague las células con solución de disociación. Incubar a 37oC durante 15 min (las células no se desecizarán en este tiempo).
- Suspenda las células en el medio de mantenimiento del PSC, transfiera la suspensión a un tubo de tamaño adecuado y centrifugar las células a 200 x g durante 3 minutos.
- Placar la suspensión PSC a una densidad de 48.000 – 70.000 células cm-2 (dependiendo de la línea celular) en un recipiente deplástico microfabricado e incubar durante la noche en la incubadora de 37 oC con 5% de CO2.
NOTA: Recomendamos 100 ol de pozo-1 de suspensión celular en un recipiente de plástico microfabricado de 96 pozos. Por lo general, sembrará 20.000 célulasbien -1 en una placa de 96 pocillos para producir aproximadamente 100 esferoides. -
Alicatado de esferoides PSC en LM511-E8 (Día -3)
- Recoger los esferoides PSC en un tubo cónico de 15 ml pipeteando suavemente con micropipete de P1000 y dejar que los esferoides se parejen a temperatura ambiente durante 2 minutos para precipitarse por gravedad. Aspira al sobrenadante.
- Suspenda en medio de chapado esferoide, dispensar la suspensión en una placa de cultivo de 6 pocillos no recubierta a una densidad de 4 esferoides cm-2 y cultivo en la incubadora de 37oC con 5% de CO2 durante tres días.
3. Inducción hemogénica (día 0)
- Aspirar el medio, añadir el medio de diferenciación Day0 y el cultivo en la incubadora de 37oC con 5% O2 y 5% CO2 (incubadora hipoxica).
- Después de dos días de cultivo en el medio de diferenciación Day0, aspirar el medio, luego añadir el medio de diferenciación Day2 y el cultivo en la incubadora hipoxica.
4. Aislamiento del endotelio hemogénico (día 4)
- Dos días más tarde, aspirar el medio y lavar las células con PBS dos veces. Enjuague las células con solución de disociación. Incubar en la incubadora de 37oC con 5% deCO2 durante 30 min.
- Suspenda suavemente las células en 1 mM EDTA para disociar al nivel de una sola célula, transfiera la suspensión a un tubo cónico de 50 ml y centrifugar las células a 200 x g durante 3 min. Búfer.
- Añadir 100 s de CD34+ microperlas y pipeteado suavemente. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente. Se pueden utilizar hasta 20 millones de células por CD34 + perlas de 100 ml+ perlas.
- Filtrar la suspensión a través de un colador de células de 40 m.
- Separe las células CD34+ utilizando un separador magnético.
5. Inducción de la transición endotelial a hematopoyética (EHT)
-
Recubrimiento de fibronectina
- Preparar el volumen requerido de solución de recubrimiento de fibronectina de 5 g/ml diluyendo 1 mg/ml de fibronectina en PBS.
- Dispensar 0,5 ml de la solución de recubrimiento en cada pocal de una placa de cultivo de 24 pocillos. Incubar la placa a temperatura ambiente durante 30 min.
- Centrifugar las células CD34+ ordenadas a 200 x g durante 3 min. Resuspender el pellet celular en 1 ml de medio EHT.
- Determine la densidad de celda viable con el contador de celdas. Ajuste la densidad celular a 200.000 celdas ml-1 agregando medio EHT.
- Aspirar y desechar la solución de recubrimiento del pozo recubierto de fibronectina. Dispensar 0,5 ml de CD34+ suspensión celular en cada pozo recubierto de fibronectina.
- Incubar en la incubadora hipoxica durante una semana.
6. Análisis de citometría de flujo de células hematopoyéticas
- Colección de celdas flotantes: Transfiera el medio de cultivo a un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar el medio a 200 x g durante 3 min. Aspirar el sobrenadante.
-
Colección celular adherente
- Lave las células con 0,5 ml de PBS dos veces.
- Enjuague las células con solución disociante y aspire el líquido sobrante.
- Incubar la placa en la incubadora de 37oC durante 5 min.
- Resuspenda las celdas en 1 mL del buffer FACS.
- Mezclar las células flotantes y las células adherentes.
- Centrifugar las células a 200 x g durante 3 min. Aspirar el sobrenadante. Resuspender en 50 l de búfer FACS. Incubar las células con anticuerpos anti-CD34 y anti-CD45 durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad.
- Lavar las células con PBS dos veces y centrifugar a 200 x g durante 3 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender en 0,5 ml de tampón FACS con 0,5 g/mL 4',6-diamidino-2-fenilindolo.
- Mida la expresión CD34 y CD45 por el citómetro de flujo.
7. Ensayo de células hematopoyéticas de la Unidad formadoras de colonias (CFU)
- Colección de células hematopoyéticas: Transfiera el medio del cultivo a un tubo cónico de 15 ml. Enjuague suavemente el pozo dos veces con PBS.
- Centrifugar las células a 200 x g durante 3 min. Aspirar el sobrenadante. Resuspender en 1 ml de medio EHT. Determine el número de celda con el contador de celdas.
- Añadir un volumen de suspensión equivalente a 10.000 células a 3 ml de medios a base de metilcelulosa complementados con antibióticos y mezclar bien 5 veces con una jeringa de 16 G o 18 G.
- Dispensar toda la suspensión de medios a base de metilcelulosa en cada pocal de una placa de 6 pocillos.
- Incubar en la incubadora de 37oC con 5% deCO2 durante dos semanas manteniendo la humedad. No moleste el plato. Las colonias son sensibles al movimiento.
- Después de dos semanas, cuente las colonias bajo un microscopio.
Representative Results
En la Figura 1Ase muestra un esquema de formación de colonias de PSC. Los esferoides del PSC se forman en un recipiente de plástico microfabricado durante un día. Como resultado representativo, 20.000 células 409B2 podrían ser manejadas por 96-pozo de recipiente plástico microfabricado, aunque otras líneas celulares pueden requerir una mayor densidad (30,000-40,000 células por 96-pozo de recipiente plástico microfabricado). Esas esferas se aplanan espontáneamente a un cultivo casi bidimensional cuando se enchapan en un plato de cultivo en presencia del LM511-E8.
En la Figura 1Bse ilustra un esquema de inducción hemogénica. Cuando las colonias de PSC crecen hasta un diámetro de 750 m, el medio se cambia secuencialmente para inducir organoides mesodérmicos. Las colonias del PSC se convertirán gradualmente en una estructura de lado soleado durante la diferenciación a los organoides mesodérmicos por cambio medio secuencial hasta el día 4. En el día 4, la endotelia hemogénica se especifica a partir de organoides mesodérmicos por clasificación magnética y posteriormente chapado en fibronectina en medio EHT. 5-10 millones de CD34+CD45- se esperan células de esferoides que contienen 1 millón de PSC (Figura1C).
Se observa que las células cambian morfológicamente de células endoteliales a hematopoyéticas (VídeoSuplementario1). En la Figura 2Ase muestra una imagen representativa de contraste de fase de las células progenitoras hematopoyéticas tras la estimulación con un cóctel hematopoyético el día 7. Las colonias celulares hematopoyéticas surgieron en la cultura.
En la Figura 2Bse muestra una gráfica representativa de citometría de flujo. Toda la cultura se estimula con un cóctel hematopoyético y en el día 7 se analiza para la expresión de CD34 y CD45 por citometría de flujo. Las células progenitoras hematopoyéticas expresan CD34 y CD45.
Un ensayo de CFU mostró la generación de granulocitos/colonias de macrófagos a partir de las células progenitoras CD34+ CD45+ hematopoyéticas (Figura2C). El número estimado de colonias es de 38 CFU-G/M por 10.000 celdas (Figura2D)
Figura 1: Esquema de las colonias de PSC de mosaico y posterior diferenciación hematopoyética a través de endotelia hemogénica. (A) Proceso esquemático de formación de colonias psC. Los PSC se mantienen en una placa de 6 pocillos recubierta de LM511-E8 en un medio de mantenimiento PSC. En el día -4, las células se separan y se disocian al nivel de una sola célula utilizando una solución disociante, posteriormente chapadas en recipientes de plástico microfabricados en medio de mantenimiento de PSC con Y-27632 y cultivadas durante la noche para formar esferoides. En el Día -3, los esferoides se chapan en medio de mantenimiento del PSC con LM511-E8 y se cultivan durante tres días. Para el día 0, los esferoides se aplanan espontáneamente a una cultura casi bidimensional. Barras de escala a 200 m. (B) El día 0, el medio se sustituye por medio de diferenciación Day0 y se cultiva en la incubadora hipoxica. En el día 2 de la diferenciación, el medio se sustituye por el medio de diferenciación Day2. En el día 4 del enriquecimiento de endotelio hemogénico, las células CD34+ se clasifican magnéticamente y se cultivan en una placa de 12 pocillos recubierto de fibronectina en medio EHT durante 6 días. (C) Gráfica representativa de la flowcytometry de la expresión CD45 y CD34 de las células del día 4 ordenadas por CD34. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Análisis de la propiedad hematopoyética. (A) Imagen representativa de la fase-contraste de las células progenitoras hematopoyéticas después de la estimulación con el cóctel hematopoyético el día 7. Barra de escala a 200 m.(B) Gráfica representativa de la citometría de flujo de CD45 y CD34 expresión de toda la cultura tras la estimulación con cóctel hematopoyético el día 7. (C) Imagen representativa de la fase-contraste de una colonia de granulocitos/macrofago generada a partir de células progenitoras hematopoyéticas del día 11. Barra de escala a 500 m. (D) Número de UFC por cada 10.000 celdas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Vídeo suplementario 1: Video EHT. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Discussion
Nuestro método de inducción definida libre de alimentadores y xenos ofrece una plataforma precisa y rentable para inducir células HE de una manera escalable. La formación fiel de endotelio hemogénico en los protocolos convencionales10,11,12,13,14 se han visto obstaculizadas por la falta de control preciso de la densidad y el tamaño de las colonias PSC, que afecta a la eficiencia de la diferenciación dirigida basada en mortogen/citoquina. Habíamos experimentado incoherencia de inducción de endotelio hemogénico en cada lote independiente de los protocolos convencionales. El nuevo protocolo permite una regulación estricta de la densidad y el tamaño de las colonias PSC, por lo que supera la incoherencia de la inducción de endotelio hemogénico.
Aprovechamos la formación uniformada de esferoides y posteriormente transmitimos una condición definida libre de comederos y xeno según el estado de formación de HE en un total de 4 días. Confirmamos el uso de tres líneas celulares independientes que la formación de esferoides asegura la formación constante de células HE. Como resultado representativo, las líneas celulares 409B2 produjeron 12,7%-23,6% CD34+ eficiencia celular basada en tres experimentos independientes. El factor crítico para teselar esferoides PSC es LM511-E8. No recomendamos sustituir esto por otra matriz, como Matrigel o productos lamininales de larga duración en nuestras experiencias. Experimentamos que los organoides mesodérmicos se separaban fácilmente de Matrigel y se perdían durante el proceso de diferenciación. Y ni Matrigel ni la minin de longitud completa no anclan las células sin pre-recubrimiento.
La limitación potencial de este protocolo es que dependemos del medio de mantenimiento del PSC para mantener los PSC. Hemos probado otros medios como StemFit, pero comprometimos la inducción hemogénica. Presumiblemente las células eran resistentes a la salida del estado pluripotente en nuestro protocolo de inducción de corto tiempo (4 días). Si se mantienen los PSC en otros medios, se recomienda adaptar las células en el medio de mantenimiento del PSC y realizar un par de pasajes antes de la diferenciación. Esta plataforma permitirá la manipulación y el análisis sistemáticos de las células, y la producción inmediata y la inducción a gran escala de células hematopoyéticas para un posible uso clínico. Un objetivo a largo plazo de este sistema es modelar enfermedades de inmunodeficiencia en modelos de ratón humanizados para investigar los mecanismos celulares y moleculares responsables y realizar pruebas de detección de fármacos.
Disclosures
Los autores no declaran conflictos de intereses.
Acknowledgments
Agradecemos a Alina Li y Seiko Benno por su asistencia técnica. También queremos dar las gracias a la Sra. Harumi Watanabe por la prestación de asistencia administrativa y al Dr. Peter Karagiannis por la edición del documento. Este trabajo fue apoyado por el Centro Básico para la Investigación Celular iPS de la Red de Centros de Investigación para la Realización de la Medicina Regenerativa de la Agencia Japonesa para la Investigación y el Desarrollo Médicos (AMED) [M.K.S.], el Programa de Investigación de Enfermedades Intratables Utilizando. Células iPS específicas para enfermedades de AMED (17935423) [M.K.S.] y el programa Center for Innovation de la Agencia Japonesa de Ciencia y Tecnología (JST) [R.O. y M.K.S.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575 | 0.5 M EDTA |
| 40 μm cell strainer | Corning | 352340 | 40μM cell strainer |
| 6 well plate | Corning | 353046 | 6 well plate |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240-112 | Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B |
| anti-CD34 antibody | Beckman Coulter | A07776 | anti-CD34 antibody |
| anti-CD45 antibody | Biolegend | 304012 | anti-CD45 antibody |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP-010 | BMP4 |
| CD34 microbeads | Miltenyi | 130-046-703 | CD34 microbeads |
| CHIR99021 | Wako | 038-23101 | CHIR99021 |
| Essential 6 | Thermo Fisher Scientific | A15165-01 | Hemogenic basal medium |
| Essential 8 | Thermo Fisher Scientific | A15169-01 | Mesodermal basal medium |
| Ezsphere SP Microplate 96well | AGC | 4860-900SP | micro-fabricated plastic vessel |
| FCS | Biosera | FB-1365/500 | FCS |
| Fibronectin | Millipore | FC010-100MG | Fibronectin |
| Flt-3L | R&D Systems | 308-FK-005 | Flt-3L |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | L-Glutamine |
| IL-6/IL-6Rα | R&D Systems | 8954-SR | IL-6/IL-6Rα |
| iMatrix-511 | Matrixome | 892 001 | LM511-E8 |
| ITS-X | Thermo Fisher Scientific | 51500-056 | Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine |
| MACS buffer | Miltenyi | 130-091-221 | magnetic separation buffer |
| Methocult 4435MethoCult™ H4435 Enriched | STEMCELL TECHNOLOGIES | 04435 | Methylcellulose-based media |
| mTeSR1 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 85850 | PSC maintenance medium |
| PBS | nacalai tesque | 14249-24 | PBS |
| SB431542 | Wako | 031-24291 | SB431542 |
| SCF | R&D Systems | 255-SC-010 | SCF |
| Stemline II Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium | Sigma Aldrich | S0192-500ML | Hematopoietic basal medium |
| TPO | R&D Systems | 288-TPN | TPO |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12604-021 | dissociation solution |
| VEGF | R&D Systems | 293-VE-010 | VEGF |
| Y-27632 | Wako | 253-00513 | Y-27632 |
References
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