Summary
Her presenterer vi en protokoll for å presist danne hemogenic endotelet fra menneskelige Pluripotent stamceller i en mater-og Xeno-fri tilstand. Denne metoden vil ha brede anvendelser i sykdoms modellering og screening for terapeutiske forbindelser.
Abstract
Avledet funksjonell blodkreft stilk og stamceller (HSPCs) fra menneskelige Pluripotent stamceller (PSCer) har vært en unnvikende mål for autologous transplantasjon å behandle hematologiske og ondartede lidelser. Hemogenic endotelet (HE) er en mottagelig plattform for å produsere funksjonell HSPCs ved transkripsjon faktorer eller for å indusere lymfocytter i en robust måte. Men dagens metoder for å utlede han er enten kostbare eller variable i yield. I denne protokollen, etablerte vi en kostnadseffektiv og presis metode for å utlede HE innen 4 dager i en mater-og Xeno-fri definert tilstand. Den resulterende HE gjennomgikk en endothelial-til-blodkreft overgang og produsert CD34+CD45+ clonogenic blodkreft forfedre. Den potensielle kapasiteten til vår plattform for å generere funksjonelle HSPCs vil ha brede anvendelser i sykdoms modellering og screening for terapeutiske forbindelser.
Introduction
Utviklingen av nye legemidler for hematologiske og immunologiske lidelser har blitt hemmet av mangelen på robuste plattformer for sykdoms modellering og høy gjennomstrømming narkotika screening med autologous blodkreft stamceller (HSCs) avledet fra pasienten Pluripotent stamceller (PSCer). Gjennombruddet av indusert (i) PSC-teknologi holder løftet om å modellere sykdommer fra pasientens celler, men etableringen av funksjonelle HSCs fra pasient iPSCs har vært unnvikende. For å utlede HSCs fra humant PSCer, er riktig induksjon av embryonale mønstre og transcriptional programmer nøkkelen1,2,3,4,5,6, 7,8. Siste fremgang i blodkreft utvikling har vist rollen som hemogenic endotelet (HE) i HSC utvikling9. Han kan bli indusert fra PSCer og er mottagelig for nedstrøms intervensjon som genoverføring10,11,12,13. Ved hjelp av HE som en plattform, kombinasjonen av 5 transkripsjon faktorer (ERG, HOXA5, HOXA9, LCOR, RUNX1) vellykket indusert funksjonell HSCs som engraft langsiktig og differensiere til flere linjene14. Men, variabel og ineffektiv generasjon av HE fra PSCer har hemmet systematisk manipulering og analyse av celler sammen med off-the-sokkel produksjon og stor skala induksjon av blodkreft celler for klinisk bruk.
Her beskriver vi en kostnadseffektiv og presis metode for å utlede han i 4 dager med en mater-og Xeno-fri definert tilstand. I denne metoden sikrer spheroid dannelse og spontane re-sammenslåing på iMarix-511 en konsistent tetthet av PSC-kolonier, som er avgjørende for effektiv induksjon av HE-celler.
Protocol
1. reagenser
- Cellelinjer (humant PSCer): få enten embryonale stamceller (ESCs) eller iPSC linjer 409B2 og 201B7 (317-9)) og CBA11.
-
Forberedelse av reagenser
- PSC plating medium: Bland PSC vedlikeholds medium med 10 μM Y-27632 og oppbevares ved 4 ° c.
- PSC spheroid flislegging medium: Bland PSC vedlikeholds medium med 625 – 1250 ng/mL humant rekombinant Laminin-511 E8-fragment (LM511-E8) (avhengig av cellelinje) like før bruk.
Merk: LM511-E8 kan blandes i Media15. Andre matrise som full lengde laminin-511 må være pre-belagt, og selv gjorde det, har de ikke opprettholde mesodermal organoids levd under differensiering prosessen. - Dag 0 differensiering medium: Bland Mesodermal basal medium med 2 μM CHIR99021, 80 ng/mL Bone Morfogenetiske protein 4 (BMP4) og 80 ng/ml vaskulær endothelial vekstfaktor (VEGF).
- Dag 2 differensiering medium: Bland Hemogenic basal medium med 1 μM SB431542, 80 ng/mL VEGF og 100 ng/mL stilk cellen faktoren (SCF).
- Klargjør fosfat buffer saltvann (PBS) uten kalsium eller magnesium (se tabell over materialer).
- 1 mM ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) buffer: Tilsett 1 mL 0,5 M EDTA til 500 mL PBS.
- EHT medium: Bland blodkreft basal medium med 50 ng/mL SCF, 20 ng/mL thrombopoietin (TPO), 50 ng/mL FMS-relaterte tyrosin kinase 3 ligand (flt-3L), 20 ng/mL interleukin-6/interleukin-6 reseptor Alpha (IL-6/IL-6Rα), insulin-transferrin-selen-ethanolamine, L-glutamin og penicillin/Streptomycin/amfotericin B.
- FACS buffer: Bland PBS med 2% fosterets kalv serum og 1 mM EDTA.
- Klargjør en buffer for magnetisk separasjon (se tabell over materialer).
- Klargjør methylcellulose medier (se tabell med materialer).
2. opprettelsen av en koloni
- Vokse hPSCs til 70 – 80% confluency på en 0,5 μg cm-2 LM511-E8-belagt 6-brønn plate i mTeSR1 i en 37 ° c inkubator med 5% co2.
-
PSC dissosiasjon (dag-4)
- Aspirer mediet og vask cellene med PBS to ganger. Skyll cellene med dissosiasjon oppløsning. Ruge ved 37 ° c i 15 min (celler vil ikke desiccate i denne perioden).
- Suspendere cellene i PSC vedlikehold medium, overføre suspensjonen til et passende størrelse rør og sentrifuger cellene ved 200 x g i 3 min. aspirer supernatanten og suspendere CELLENE i PSC plating medium.
- En plate PSC-suspensjon ved en tetthet på 48 000 – 70 000 celler cm-2 (avhengig av cellelinjen) på en mikro-fabrikkert plast fartøy og ruge over natten i 37 ° c inkubator med 5% co2.
Merk: Vi anbefaler 100 μL brønn-1 av celle fjæring i en 96-brønn med mikro-fabrikkert plast fartøy. Du vil typisk frø 20 000 celler godt-1 i en 96-brønn plate å gi ca 100 spheroids. -
Å flislegging PSC spheroids på LM511-E8 (Dag-3)
- Samle inn PSC-spheroids i et 15 mL konisk rør ved å forsiktig pipettering med P1000 micropipetter og la spheroids stå i romtemperatur i 2 minutter for å utløse tyngdekraften. Aspirer supernatanten.
- Suspendere i spheroid plating medium, dispensere suspensjonen i en ikke-belagt 6-brønn kultur plate i en tetthet på 4-spheroids cm-2 og kultur i 37 ° c inkubator med 5% co2 i tre dager.
3. Hemogenic induksjon (dag 0)
- Aspirer mediet, tilsett Day0 differensiering medium og kultur i 37 ° c inkubator med 5% O2 og 5% co2 (hypoxic inkubator).
- Etter to dager med kultur i Day0 differensiering medium, aspirer mediet, og deretter legge Virkedag2 differensiering medium og kultur i hypoxic inkubator.
4. isolering av Hemogenic endotelet (dag 4)
- To dager senere, aspirer mediet og vask cellene med PBS to ganger. Skyll cellene med dissosiasjon oppløsning. Ruge i 37 ° c inkubator med 5% CO2 i 30 minutter.
- Forsiktig suspendere cellene i 1 mM EDTA til distansere til enkelt cellenivå, overføre suspensjonen til en 50 mL konisk rør og sentrifuger cellene ved 200 x g i 3 min. aspirer supernatanten og suspendere celle pellet med 300 μL av magnetisk separasjon Buffer.
- Tilsett 100 μL av CD34+ mikroperler og forsiktig Pipet. Ruge i 30 minutter ved romtemperatur. Opptil 20 000 000 celler per 100 μL CD34+ perler kan brukes.
- Filter suspensjonen gjennom en 40 μm celle sil.
- Skill CD34+ cellene ved hjelp av et magnetisk skilletegn.
5. induksjon av endothelial-til-blodkreft overgang (EHT)
-
Fibronektin belegg
- Klargjør det nødvendige volumet av 5 μg/mL fibronektin-oppløsning ved å fortynne 1 mg/mL fibronektin i PBS.
- Dispensere 0,5 mL av belegget løsning i hver brønn av en 24-brønn kultur plate. Ruge platen ved romtemperatur i 30 min.
- Sentrifuger det sorterte CD34+ celler for 200 x g for 3 min. Resuspend cellen pellet inne 1 ml av EHT medium.
- Bestem levedyktig celle tetthet med celle telleren. Juster celle tettheten til 200 000-cellene mL-1 ved å legge til EHT-medium.
- Aspirer og kast belegget fra den fibronektin brønnen. Dispensere 0,5 mL CD34+ celle fjæring i hver fibronektin brønn.
- Ruge i hypoxic inkubator i en uke.
6. Flow flowcytometri analyse av blodkreft celler
- Flytende celle samling: Overfør kultur mediet til et 15 mL konisk rør. Sentrifuger mediet ved 200 x g i 3 min. aspirer supernatanten.
-
Tilhenger celle samling
- Vask cellene med 0,5 mL av PBS to ganger.
- Skyll cellene med dissociating oppløsning og aspirer overskudds væsken.
- Ruge platen i 37 ° c inkubator i 5 min.
- Resuspend cellene i 1 mL FACS buffer.
- Bland flytende celler og tilhenger celler.
- Sentrifuger cellene ved 200 x g i 3 min. aspirer supernatanten. Resuspend i 50 μL av FACS buffer. Ruge cellene med anti-CD34 og anti-CD45 antistoffer for 1 t ved romtemperatur i mørket.
- Vask cellene med PBS to ganger og sentrifuger på 200 x g i 3 min. aspirer supernatanten og resuspend i 0,5 ml FACS buffer med 0,5 μg/ml 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole.
- Mål CD34 og CD45 uttrykk ved flyt flowcytometer.
7. Colony forming Unit (CFU) analysen av blodkreft celler
- Blodkreft celle samling: Overfør mediet fra kulturen til en 15 mL konisk rør. Forsiktig skylle brønnen to ganger med PBS.
- Sentrifuger cellene ved 200 x g i 3 min. aspirer supernatanten. Resuspend i 1 mL EHT medium. Bestem celle nummer med celle telleren.
- Legg til en suspensjon volum tilsvarende 10 000 celler til 3 mL methylcellulose medier supplert med antibiotika og bland godt 5 ganger med en 16 G eller 18 G sprøyte.
- Dispensere hele den methylcellulose medie fjæringen i hver brønn på en 6-brønn plate.
- Ruge i 37 ° c inkubator med 5% CO2 i to uker mens du holder fuktig. Ikke forstyrr parabolen. Kolonier er bevegelsesfølsomme.
- Etter to uker, telle koloniene under et mikroskop.
Representative Results
En skjematisk fremstilling av PSC-koloniene er avbildet i figur 1a. PSC spheroids er dannet på en mikro-fabrikkert plast fartøy for en dag. Som et representativt resultat, kan 20 000 409B2 celler håndteres per 96-vel av mikro-fabrikkert plast fartøy, selv om andre cellelinjer kan kreve en høyere tetthet (30000-40000 celler per 96-vel av mikro-fabrikkert plast fartøy). Disse kulene er spontant flatet til en nesten to-dimensjonal kultur når belagt på en kultur parabolen i nærvær av LM511-E8.
En skjematisk fremstilling av hemogenic induksjon er illustrert i figur 1B. Når PSC-koloniene vokser til en diameter på 750 μm, endres mediet sekvensielt for å indusere mesodermal organoids. PSC-koloniene vil gradvis bli en solrik side opp struktur under differensiering til mesodermal organoids ved sekvensiell medium endring til dag 4. På dag 4, hemogenic endothelia er spesifisert fra mesodermal organoids ved magnetisk sortering og deretter belagt på fibronektin i EHT medium. 5-10 millioner CD34+CD45- celler forventes fra spheroids inneholdende 1 000 000 PSCer (figur 1C).
Det er observert at cellene morfologisk endres fra endothelial til blodkreft celler (supplerende video 1). En representativ fase-kontrast bilde av blodkreft stamceller ved stimulering med blodkreft cocktail på dag 7 er vist i figur 2a. Blodkreft celle kolonier dukket opp i kulturen.
En representativ flyt flowcytometri tomten er vist i figur 2b. Hele kulturen stimuleres med blodkreft cocktail og på dag 7 er analysert for uttrykk for CD34 og CD45 ved flyt flowcytometri. Blodkreft stamceller uttrykke CD34 og CD45.
En CFU analysen viste generering av granulocytter/macrophage kolonier fra CD34+ CD45+ blodkreft stamceller (figur 2C). Estimert koloni nummeret er 38 CFU-G/M per 10 000 celler (figur 2D)
Figur 1: skjematisk å flislegging av PSC-kolonier og påfølgende blodkreft differensiering via hemogenic endothelia. (A) skjematisk prosess med å danne PSC-kolonier. PSCer vedlikeholdes på en LM511-E8-belagt 6-brønn plate i PSC vedlikeholds medium. På dag-4, celler er løsrevet og dissosiert til enkelt cellenivå ved hjelp av dissociating løsning, senere belagt på mikro-fabrikkert plast fartøy i PSC vedlikehold medium med Y-27632 og kultivert over natten for å danne spheroids. På dag-3 er spheroids belagt i PSC vedlikeholds medium med LM511-E8 og kultivert i tre dager. Etter dag 0, spheroids er spontant flatet til en nesten to-dimensjonal kultur. Skala bars = 200 μm. (B) på dag 0, er mediet erstattet med Day0 differensiering medium og kultivert i hypoxic inkubator. På dag 2 av differensiering, er mediet erstattet med Virkedag2 differensiering medium. Opp på dag 4 av det hemogenic endotelet berikelse, CD34+ celler er magnetisk sorterte og kultivert opp på en fibronektin-belagt 12-frisk TALLERKEN inne EHT medium for 6 dager. (C) representative flowcytometry plott av CD45 og CD34 uttrykk for dag 4 celler SORTERT etter CD34. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: analyse av blodkreft eiendom. (A) representative fase-kontrast bilde av blodkreft stamceller etter stimulering med blodkreft cocktail på dag 7. Scale bar = 200 μm. (B) representant flyt flowcytometri TOMTEN av CD45 og CD34 uttrykk for hele kulturen ved stimulering med blodkreft cocktail på dag 7. (C) representative fase-kontrast bilde av en granulocytt/macrophage koloni generert fra dag 11 blodkreft stamceller. Scale bar = 500 μm. (D) antall CFUs per 10 000 celler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tilleggs video 1: EHT-video. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Vår mater-og Xeno definerte induksjon metode tilbyr en presis og kostnadseffektiv plattform for å indusere HE celler på en skalerbar måte. Den trofaste dannelsen av hemogenic endotelet i konvensjonelle protokoller10,11, 12,13,14 har blitt hemmet av mangel på presis kontroll av PSC koloni tetthet og størrelse, som påvirker effektiviteten av morphogen/cytokin-basert rettet differensiering. Vi hadde opplevd inkonsekvens i hemogenic endotelet induksjon i hver uavhengige batch fra konvensjonelle protokoller. Den nye protokollen muliggjør tett regulering av PSC koloni tetthet og størrelse, og dermed overvinner inkonsekvens i hemogenic endotelet induksjon.
Vi utnyttet den uniformerte dannelsen av spheroids og senere formidlet en mater-og Xeno-fri definert stand til å danne han i totalt 4 dager. Vi bekreftet ved hjelp av tre uavhengige cellelinjer som spheroid formasjon sikrer konsistent dannelsen av HE celler. Som et representativt resultat, ga 409B2 cellelinjer 12.7%-23,6% CD34+ celle effektivitet basert på tre uavhengige eksperimenter. Den kritiske faktoren for å Tile PSC-spheroids er LM511-E8. Vi anbefaler ikke å erstatte dette med andre matrise, slik som Matrigel eller full-lengde laminin produkter i våre erfaringer. Vi opplevde at mesodermal organoids var lett løsrevet fra Matrigel og tapt under differensiering prosessen. Og verken Matrigel eller full-lengde laminin ikke forankre celler uten pre-belegg.
Den potensielle begrensningen av denne protokollen er at vi er avhengige av et vedlikeholds medium fra PSC for å opprettholde PSCer. Vi har testet andre medier som StemFit, men vi kompromittert hemogenic induksjon. Antagelig celler var resistente å gå ut av pluripotent tilstand i vår korte tid (4 dager) induksjon protokollen. Hvis man opprettholder PSCer i andre medier, anbefaler vi å tilpasse cellene i PSC vedlikeholds medium og gjennomføre et par passasjer før differensiering. Denne plattformen vil tillate systematisk manipulering og analyse av celler, og off-the-sokkel produksjon og stor skala induksjon av blodkreft celler for potensiell klinisk bruk. Et langsiktig mål av dette systemet er å modellere immunsvikt sykdommer i humanisert mus modeller for å undersøke de ansvarlige cellulære og molekylære mekanismer og gjennomføre narkotika screenings.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi er takknemlige for Alina Li og Seiko Benno for deres tekniske assistanse. Vi vil også gjerne takke MS Harumi Watanabe for å gi administrativ bistand og Dr. Peter Karagiannis for redigering av papir. Dette arbeidet ble støttet av Core Center for iPS Cell Research av Research Center Network for realisering av regenererende medisin fra Japan Agency for medisinsk forskning og utvikling (AMED) [M.K.S.], programmet for intractable sykdommer Research Utnytte. Sykdomsspesifikke iPS-celler i AMED (17935423) [M.K.S.] og senter for innovasjonsprogram for Japan Science and Technology Agency (JST) [R.O. og M.K.S.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575 | 0.5 M EDTA |
| 40 μm cell strainer | Corning | 352340 | 40μM cell strainer |
| 6 well plate | Corning | 353046 | 6 well plate |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240-112 | Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B |
| anti-CD34 antibody | Beckman Coulter | A07776 | anti-CD34 antibody |
| anti-CD45 antibody | Biolegend | 304012 | anti-CD45 antibody |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP-010 | BMP4 |
| CD34 microbeads | Miltenyi | 130-046-703 | CD34 microbeads |
| CHIR99021 | Wako | 038-23101 | CHIR99021 |
| Essential 6 | Thermo Fisher Scientific | A15165-01 | Hemogenic basal medium |
| Essential 8 | Thermo Fisher Scientific | A15169-01 | Mesodermal basal medium |
| Ezsphere SP Microplate 96well | AGC | 4860-900SP | micro-fabricated plastic vessel |
| FCS | Biosera | FB-1365/500 | FCS |
| Fibronectin | Millipore | FC010-100MG | Fibronectin |
| Flt-3L | R&D Systems | 308-FK-005 | Flt-3L |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | L-Glutamine |
| IL-6/IL-6Rα | R&D Systems | 8954-SR | IL-6/IL-6Rα |
| iMatrix-511 | Matrixome | 892 001 | LM511-E8 |
| ITS-X | Thermo Fisher Scientific | 51500-056 | Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine |
| MACS buffer | Miltenyi | 130-091-221 | magnetic separation buffer |
| Methocult 4435MethoCult™ H4435 Enriched | STEMCELL TECHNOLOGIES | 04435 | Methylcellulose-based media |
| mTeSR1 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 85850 | PSC maintenance medium |
| PBS | nacalai tesque | 14249-24 | PBS |
| SB431542 | Wako | 031-24291 | SB431542 |
| SCF | R&D Systems | 255-SC-010 | SCF |
| Stemline II Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium | Sigma Aldrich | S0192-500ML | Hematopoietic basal medium |
| TPO | R&D Systems | 288-TPN | TPO |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12604-021 | dissociation solution |
| VEGF | R&D Systems | 293-VE-010 | VEGF |
| Y-27632 | Wako | 253-00513 | Y-27632 |
References
- Pereira, C. F., et al. Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts. Cell Stem Cell. 13, 205-218 (2013).
- Lancrin, C., et al. The haemangioblast generates haematopoietic cells through a haemogenic endothelium stage. Nature. 457, 892-895 (2009).
- Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. , 451-467 (2016).
- Ng, E. S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to HOXA+ hemogenic vasculature that resembles the aorta-gonad-mesonephros. Nature Biotechnology. 34, 1168-1179 (2016).
- Batta, K., et al. Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells. Cell Reports. 9, 1871-1884 (2014).
- Sturgeon, C. M., et al. Defining the path to hematopoietic stem cells. Nature Biotechnology. 31, 416-418 (2013).
- Ivanovs, A., et al. Human haematopoietic stem cell development: from the embryo to the dish. Development. 144, 2323-2337 (2017).
- Blaser, B. W., Zon, L. I. Making HSCs in vitro: don't forget the hemogenic endothelium. Blood. , (2018).
- Speck, N., Dzierzak, E. Of lineage and legacy: the development of mammalian hematopoietic stem cells. Nature imunology. , (2008).
- Niwa, A., et al. A novel serum-free monolayer culture for orderly hematopoietic differentiation of human pluripotent cells via mesodermal progenitors. PLoS One. 6, e22261 (2011).
- Sturgeon, C. M., et al. Wnt signaling controls the specification of definitive and primitive hematopoiesis from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32, 554-561 (2014).
- Ditadi, A., et al. Human definitive haemogenic endothelium and arterial vascular endothelium represent distinct lineages. Nature Cell Biology. 17, 580-591 (2015).
- Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Reports. 2, 1722-1735 (2012).
- Sugimura, R., et al. Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature. 545, 432-438 (2017).
- Miyazaki, T., et al. Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner. Scientific Reports. 7, 41165 (2017).
