Summary
Doliolids، بما في ذلك الأنواع Dolioletta gegenbauri، هي العوالق الحيوانية البحرية الجيلاتينية الصغيرة ذات الأهمية الإيكولوجية الموجودة على نظم الجرف شبه القارية المنتجة في جميع أنحاء العالم. صعوبة زراعة هذه الكائنات الحساسة تحد من تحقيقها. في هذه الدراسة، ونحن نصف نهج زراعة لجمع وتربية، والحفاظ على doliolid Dolioletta gegenbauri.
Abstract
تلعب العوالق الحيوانية الجيلاتينية دوراً حاسماً في النظم الإيكولوجية للمحيطات. ومع ذلك، فمن الصعب عموما للتحقيق في علم وظائف الأعضاء، والنمو، والخصوبة، والتفاعلات الغذائية ويرجع ذلك في المقام الأول إلى التحديات المنهجية، بما في ذلك القدرة على ثقافتهم. وهذا ينطبق بشكل خاص على دوليوليد، دوليوليتا غيغنبوري. D. gegenbauri يحدث عادة في نظم الجرف القاري شبه الاستوائية المنتجة في جميع أنحاء العالم، وغالبا ما يكون في تركيزات ازهر قادرة على استهلاك جزء كبير من الإنتاج الأولي اليومي. في هذه الدراسة، نقوم بوصف نُهج الزراعة لجمع وتربية وصيانة D. gegenbauri لغرض إجراء دراسات مختبرية. D. gegenbauri وغيرها من الأنواع doliolid يمكن التقاطها على الهواء مباشرة باستخدام شبكات العوالق المخروطية قطرها بشكل غير مباشر 202 م من سفينة عائمة. يتم تأسيس الثقافات بشكل موثوق به عندما تكون درجات حرارة المياه أقل من 21 درجة مئوية وتبدأ من الغونوزويد غير ناضجة، وphorozooids النضج، والممرضات الكبيرة. ويمكن الحفاظ على الثقافات في أوعية الثقافة المستديرة على عجلة العوالق الدوارة ببطء والحفاظ عليها على نظام غذائي من الطحالب المستزرعة في مياه البحر الطبيعية لأجيال عديدة. بالإضافة إلى القدرة على إنشاء الثقافات المختبرية من D. gegenbauri،ونحن نثبت أن حالة جمع، تركيز الطحالب، ودرجة الحرارة، والتعرض لمياه البحر مكيفة بشكل طبيعي كلها حاسمة للثقافة إنشاء, النمو, البقاء على قيد الحياة, واستنساخ D. gegenbauri.
Introduction
تمثل العوالق الحيوانية أكبر كتلة حيوية حيوانية في المحيط، وهي مكونات رئيسية في شبكات الأغذية البحرية، وتلعب أدوارا هامة في الدورات البيوجيوكيميائية للمحيطات1و2. العوالق الحيوانية، على الرغم من أنها تتألف من تنوع كبير من الكائنات الحية، يمكن تمييزها بشكل صارخ في فئتين: الجيلاتين وغير الجيلاتينمع عدد قليل من الضريبة المتوسطة3،4. بالمقارنة مع العوالق الحيوانية غير الجيلاتينية، العوالق الحيوانية الجيلاتينية من الصعب بشكل خاص لدراسة بسبب تاريخها الحياة المعقدة5، وتلف الأنسجة الحساسة بسهولة أثناء التقاط والتعامل معها. أنواع العوالق الحيوانية الجيلاتينية، وبالتالي، من الصعب على نحو سيء السمعة للثقافة في المختبر وعموما أقل دراسة بالمقارنة مع الأنواع غير الجيلاتينية6.
ومن بين مجموعات العوالق الحيوانية الجيلاتينية، هناك مجموعة وفيرة وذات أهمية إيكولوجية في محيط العالم هي التالياسيين. Thaliaceans هي فئة من التونيكات البحرية التي تشمل أوامر سالبيدا، بيروسوميدا، وDoliolida7. وDoliolida، التي يشار إليها مجتمعة باسم الدوليوليدات، هي كائنات بحرية صغيرة على شكل برميل سباحة حرة يمكن أن تصل إلى وفرة عالية في المناطق النِرية المنتجة للمحيطات شبه المدارية. Doliolids هي من بين الأكثر وفرة من جميع مجموعات العوالق الحيوانية4،8. كما مغذيات التعليق، doliolids جمع جزيئات الطعام من عمود الماء عن طريق خلق تيارات فلتر والتقاطها على شبكات المخاط9. تصنيف هادليوليدات في فيلوم أوروخورداتا10. الأجداد إلى الجوقة، وبالإضافة إلى أهميتها الإيكولوجية كمكونات رئيسية للنظم البحرية البحرية، Thaliaceans هي ذات أهمية لفهم أصول تاريخ الحياة الاستعمارية10،11 والتطور من الجوقة5،7،10،12،13،14.
تاريخ حياة doliolids معقد ويسهم في صعوبة في زراعة والحفاظ عليها من خلال دورة حياتهم. ويمكن الاطلاع على استعراض لدورة حياة دولوليد والتشريح في Godeaux وآخرون15. دورة حياة دولوليد، التي تنطوي على التناوب الإلزامي بين مراحل الحياة الجنسية وغير الجنسية تاريخ الحياة، وترد في الشكل 1. يتم إنتاج البيض والحيوانات المنوية من قبل gonozooids hermaphroditic، المرحلة الانفرادية الوحيدة من دورة الحياة. تطلق الحيوانات المنوية من الغونوزويد إلى عمود الماء ويتم تخصيب البويضات داخلياً وإطلاقها لتصبح يرقات. تفقس اليرقات وتتحول إلى oozooids التي يمكن أن تصل إلى 1-2 ملم. الأوزويد تنتج براعم غير جنسية على stolon البطني. هذه البراعم ترك stolon والهجرة إلى cadophore الظهرية حيث يصطفون في ثلاثة صفوف مقترنة. يصبح الصفوف مركزية مزدوجة [فوروزويدس] والخارجيّة اثنان صفوف مزدوجة يصبح [تروبهوزويدس]. هذا الأخير توفير الغذاء لكل من الممرضة وphorozooids16،17. التروبهوزويد تزود الممرضة بالتغذية لأنها تفقد جميع الأعضاء الداخلية. مع زيادة وفرة التروبهوزويد ، يمكن أن يصل حجم الممرضة إلى 15 مم في المختبر. كما تنمو phorozooids، فإنها بتزايد تناول فريسة العوالق وتصل إلى ~ 1.5 ملم في الحجم قبل أن يطلق سراحه كأفراد17. ممرضة واحدة قد تطلق سراح > 100 phorozooids خلال عمرها18. بعد أن يتم تحرير phorozooids من cadophore، فإنها لا تزال تنمو وهي المرحلة الاستعمارية الثانية من دورة الحياة. بمجرد أن تصل إلى حوالي 5 ملم في الحجم، كل phorozooid يطور مجموعة من الغونوزويد على peduncle البطني. هذه gonozooids يمكن تناول الجسيمات عندما تصل إلى ~ 1 ملم في الطول. بعد أن وصلت gonozooids ~ 2 إلى 3 ملم في الحجم يتم الإفراج عنهم من phorozooid وتصبح المرحلة الانفرادية الوحيدة من دورة الحياة. بمجرد أن تصل إلى ~ 6 ملم في الحجم، gonozooids تصبح ناضجة جنسيا17. يمكن أن تصل الغونوزويد إلى 9 مم أو أكثر في الطول. Gonozooids هي hermaphroditic ، يتم تحرير الحيوانات المنوية بشكل متقطع في حين أن تخصيب البيض يحدث داخليا16،17. عندما يكون الغونوزويد ≥ 6 مم في الحجم، فإنه يطلق ما يصل إلى 6 البيض المخصبة. يتطلب النجاح في الزراعة دعم الاحتياجات المحددة لكل مرحلة من مراحل تاريخ الحياة الفريدة هذه.
نظراً للأهمية الإيكولوجية والتطورية للثالياسيين، بما في ذلك الدوليوليدات، هناك حاجة لمنهجيات الزراعة لتعزيز فهم البيولوجيا الفريدة لهذا الكائن الحي، وعلم وظائف الأعضاء، والإيكولوجيا، والتاريخ التطوري19 . Doliolids لديها وعد كبير ككائنات نموذجية تجريبية في البيولوجيا التنموية وعلم الجينوم الوظيفي لأنها شفافة ومن المرجح أن تكون الجينومات مبسطة20،21. غير أن الافتقار إلى أساليب زراعة موثوقة يعوق فائدتها كنماذج مختبرية. على الرغم من أن حفنة من المختبرات قد نشرت نتائج على أساس doliolids المستزرعة، لم يتم نشر نهج زراعة المعرفة لدينا والبروتوكولات التفصيلية من قبل. استنادا إلى سنوات من الخبرة، ومحاولات زرع التجربة والخطأ، وكان الغرض من هذه الدراسة لاستعراض الخبرات وتبادل بروتوكولات لجمع وزراعة doliolids، وعلى وجه التحديد الأنواع Dolioletta gegenbauri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1- إعداد مرافق الزراعة لتربية د.
ملاحظة: جميع المواد والمعدات المطلوبة مدرجة في جدول المواد.
- إعداد 1 M هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم NaOH)، 0.06 M برمنغنات البوتاسيوم (KMnO4)الحل. لإعداد هذا الحل، حل 400 غرام من هيدروكسيد الصوديوم في 10 L الماء منزوع الأيونات. أضف 100 غرام من KMnO4 إلى حل هيدروكسيد الصوديوم واخلطجيداً.
- إعداد 0.1 M الصوديوم bisulfite(NaHSO 3) الحل عن طريق حل 100 غرام من NaHSO3 في 10 L الماء منزوع الأيونات ومزيج جيدا.
تحذير: هذه الكواشف هي المهيجات التي قد تسبب مشاكل في الجهاز التنفسي إذا استنشق. مكان في منطقة جيدة التهوية مثل غطاء محرك الدخان. تجنب أي اتصال الجلد. ارتداء قفازات واقية، والملابس الواقية، وحماية العين، وحماية الوجه عند المناولة. - قبل إنشاء وتربية الثقافات doliolid في المختبر، وتنظيف وتعقيم الجرار الثقافة.
- شطف 1.9 L و 3.8 L الجرار ثقافة 3 مرات على الأقل مع الماء منزوع الأيونات. السماح للقبعات المسمار لتجف، كما لا يتم تضمين قبعات في خطوات التنظيف التالية.
- تنظيف وتعقيم 1.9- و 3.8 L الجرار ثقافة الزجاج عن طريق غمر لهم في حل هيدروكسيد الصوديوم / KMnO 4. السماح للجرار لنقع بين عشية وضحاها.
- إزالة الجرار من محلول هيدروكسيد الصوديوم / KMnO4 وتزج الجرار في ثنائيصود الصوديوم (NaHSO3)الحل. السماح للجرار لنقع بين عشية وضحاها.
- إزالة الجرار من محلول NaHSO3 وشطف جيدا بالماء منزوع الأيونات. السماح للجرار لتجف.
- وضع عجلة العوالق (الشكل2)في مساحة التحكم في درجة الحرارة (غرفة البيئية). معادلة درجة الحرارة إلى 20 درجة مئوية. للحصول على وصف أكثر تفصيلا لعجلة العوالق المخصصة يرجى الرجوع إلى الشكل التكميلي 1.
2- ثقافة العوالق النباتية
- الحصول على ثقافات الطحالب من المركز الوطني للطحالب البحرية والميكروبيوتا (NCMA) أو مصادر أخرى لاستخدامها كغذاء لD. gegenbauri. تم الحصول على خليط من نوعين من الفلاجيلات بما في ذلك Isochrysis galbana (CCMP 1323)، Rhodomonas sp (CCMP 740)، ودياتوم صغير، Thalassiosira weissflogii (CCMP 1051) وتم استخدامها في المختبر السابق دراسات إلى [دولوليدس] خلفيّة بنجاح17.
- إعداد L1 و L1-Si نمو وسائل الإعلام22 على النحو الموصى به من قبل NCMA.
- اتبع التعليمات التي يقدمها المورد لبدء الثقافات الطحالب الجديدة.
- للحفاظ على ثقافات الأسهم، وذلك باستخدام تقنيات صارمة للثقافة الفأس، نقل 0.5 مل من الثقافة senescing القديمة إلى 25 مل من وسائل الإعلام النمو الطازجة في أنابيب ثقافة الزجاج معقمة 55 مل كل أسبوعين.
ملاحظة: ليس من الممكن تخزين الثقافات الطحالب الحية دون نقلها بانتظام. وإذا لم تستخدم الثقافات لفترات طويلة، ولم يكن من الممكن الحفاظ على الثقافات طوال فترة عدم الاستخدام، يوصى بإعادة اكتساب هذه الثقافات الطحالب الشائعة من مصادرها الأصلية (على سبيل المثال، NCMA). - إعداد كميات أكبر من العوالق النباتية لتغذية doliolids في نظيفة 500 مل براميل زراعة الأنسجة البلاستيكية التي تحتوي على 200 مل من وسائل الإعلام النمو.
- تلقيح العوالق النباتية من مخزونات axenic (4 مل) إلى 200 مل من وسائل الإعلام النمو (1:50 تخفيف).
- حضانة في 20 درجة مئوية مع 12:12 ساعة ضوء: دورة مظلمة تحت إضاءةالضوء الأبيض بارد من 65-85 درجة مئوية / م 2. وضع قارورة الثقافة شقة لتحقيق أقصى قدر من الإضاءة. تدور الثقافة بلطف يوميا.
- تحديد تركيز الخلايا باستخدام عداد الجسيمات أو المجهر لرصد نمو الثقافات.
ملاحظة: بعد 7-10 أيام من التلقيح، سوف تحتوي الثقافاتflagellate ~ 10 5-106 خلايا/مل وثقافة دياتوم سوف تحتوي على ~ 10 4-105 خلايا /مل. هذه التركيزات كافية للحفاظ على الثقافات doliolid. - بدء مخزونات تغذية جديدة على الأقل كل أسبوعين لتوفير ما يكفي من الكتلة الحيوية الطحالب لدعم جميع الأنشطة الثقافية.
3- جمع الدوليوليدات البرية ومياه البحر من أجل الثقافة
ملاحظة: يرد في الشكل 3بيان عام عن نُهُج الجمع والزراعة. ويرد في الشكل 4وصف لصافي العوالق المتخصصة ونهاية سمك القد.
- حدد موقع doliolids عن طريق الكشف عنها باستخدام إما شبكات العوالق أو أنظمة التصوير في الموقع23.
ملاحظة: لأن doliolids نادرا ما تكون موجودة في المياه السطحية وغير قابلة للكشف عن طريق تكنولوجيا الاستشعار عن بعد، تسترشد المعرفة المسبقة للظروف المواتية للdoliolids (انظر المناقشة)،يجب تحديد وجود doliolids قبل أخذ العينات. - جمع مياه البحر الغنية بالجسيمات قبل جمع doliolids الحية استعدادا لبدء ثقافة D. gegenbauri.
- نشر زجاجات نيسكين المثبتة على وردة CTD أو ما يعادلها من المعدات لجمع المياه من الموقع حيث توجد doliolids ومن العمق الذي يحتوي على أعلى تقديرات الكلوروفيل تركيز يقدر من قبل قياس الفلوروم في الموقع.
ملاحظة: يستخدم الكلوروفيل تركيز كمؤشر لتركيزات الجسيمات. وفي الجرف القاري في جنوب المحيط الأطلسي، يكون الكلوروفيل تحت سطح الأرض، وهو الحد الأقصى، عادة ما يكون قريبا ً من القاع، ولكن في مواقع أخرى، قد لا يكون كذلك.
- نشر زجاجات نيسكين المثبتة على وردة CTD أو ما يعادلها من المعدات لجمع المياه من الموقع حيث توجد doliolids ومن العمق الذي يحتوي على أعلى تقديرات الكلوروفيل تركيز يقدر من قبل قياس الفلوروم في الموقع.
- بمجرد أن يتم تحديد موقع doliolids، واستعادة zooids doliolid غير التالفة باستخدام شبكة العوالق المتخصصة ونهاية سمك القد. قبل نشر الشبكة، ملء نهاية سمك القد مع مياه البحر.
- من سفينة الانجراف، وانخفاض ورفع الشبكة من خلال عمود المياه الحفاظ على زاوية سحب مائلة من ~ 15 - 25 درجة وسرعة النشر واسترجاع عمودي لا يزيد عن 15 م / دقيقة.
- بمجرد أن تكون الشبكة على متن الطائرة، نقل بلطف وتقسيم محتويات نهاية سمك القد إلى 3، 5 غالون (~ 20 L) الدلاء البلاستيكية كل تحتوي على ~ 10 لتر من مياه البحر السطحية التي تم جمعها من الموقع.
ملاحظة: يجب أن تكون مشروطة الدلاء البلاستيكية الجديدة بإضافة أيام مياه البحر قبل جمع doliolid المعيشة. والهدف من ذلك هو الحد من غسل المواد الكيميائية من البلاستيك. إذا لم تكن مياه البحر متوفرة، استخدم مياه المناقية (على سبيل المثال، ميلي كيو) أو مياه الصنبور الخالية من الملوثات السامة لتكييف الدلاء. - عزل zooids doliolid من العوالق الأخرى.
- في دفعات صغيرة (~ 2 L) نقل العوالق مختلطة من محتويات السحب صافي (الآن في 20 L الدلاء البلاستيكية) إلى كوب زجاجي 2 L.
- باستخدام ماصة زجاجية واسعة الملل (8 مم ID × 38 سم طول)، سيفون بعناية ونقل بنشاط السباحة zooids doliolid من الكأس إلى الجرار ثقافة الزجاج النظيف التي تحتوي على مياه البحر الغنية بالجسيمات التي تم جمعها باستخدام زجاجات Niskin من حيث doliolids كانت الموقع.
- قم بالإفراج برفق عن الحيوانات الحيوانية الدوليوليدة تحت سطح مياه البحر.
ملاحظة: جمع gonozooids، phorozooids التي تحتوي على الغونوزويد النامية المرفقة، ومراحل التمريض التي تحتوي على trophozooids المرفقة (الشكل1).
- بعد إضافة doliolids، إضافة ثقافة Rhodomonas sp. إلى تركيز نهائي من ~ 5 × 103 - 104 خلايا / مل (~ 50 مل من ثقافة تحتوي على ~ 5 × 104 - 1 × 105 خلايا / مل في جرة 3.8 لتر). هذا هو لتحديد ما إذا كانت doliolids تتغذى بنشاط. عندما doliolids تناول Rhodomonas sp.، سوف تظهر الجهاز الهضمي الأحمر في اللون. إزالة zooids التي لا يبدو أن التغذية.
- لمنع doliolids من الوقوع في المحاصرين في واجهة الهواء والماء، وتجنب مساحة الرأس في الجرار الثقافة عن طريق ملء تماما الجرار مع مياه البحر الغنية بالجسيمات غير المصفاة ووضع قطعة من البلاستيك التفاف على فتح جرة (89 ملم واسعة).
- تجنب إنشاء فقاعات الهواء التي يمكن أن تضر أيضا الحيوانات. المسمار بعناية الغطاء على جرة وعكس بلطف جرة لتحديد ما إذا كانت فقاعات موجودة. إذا كانت الفقاعات موجودة، قم بإزالتها.
- بعد ملء الجرار، امسح المياه الزائدة من خارج الجرة.
- جبل كل جرة على عجلةالعوالق (الشكل 2) عن طريق وضع جرة على قضبان معدنية عمودية مغطاة أنابيب المطاط، وبين المشبك خرطوم الفولاذ المقاوم للصدأ.
- تأكد من أن الجزء الخلفي من جرة خففت ضد أنابيب المطاط. تشديد المشبك خرطوم حول جرة عن طريق ضبط المسمار.
- تأكد من أن الجرة لا تتحرك بمجرد تثبيتها بشكل آمن في مكانها. السماح للجرار لتدوير في 0.3 دورة في الدقيقة للحفاظ على doliolids في تعليق.
تحذير: من المهم عدم الإفراط في تشديد جرة لمنع جرة من تكسير.
- على متن السفينة، والحفاظ على السفن الثقافة على عجلة العوالق في 20 درجة مئوية في ضوء خافت حتى يمكن نقلها إلى منشأة الثقافة المختبرية.
- عند العودة إلى المختبر، نقل الجرار التي تحتوي على doliolids في مرفق الثقافة المعدة. جبل الجرار على عجلة العوالق (انظر الخطوة 3.8) والسماح للجرار لمواصلة تدوير في 0.3 دورة في الدقيقة.
ملاحظة: تم إجراء جميع تربية doliolids في هذه الدراسة في 20 درجة مئوية.
4- الحفاظ على ثقافات د. غيغينبوري
- من السفينة إلى المختبر، والسماح للالحيوانات لالتكيف في الجرار الأصلية لظروف المختبر لمدة 3 أيام.
- خلال فترة التأقلم، استخدم ماصة زجاجية واسعة لمبادلة 10٪ من المياه مع مياه البحر الغنية بالجسيمات غير المصفاة من موقع الجمع كل يوم لمدة 3 أيام.
- الحفاظ على العديد من الكوببودات في جرة ولكن إزالة جميع العوالق الحيوانية الأخرى، والكريات البراز كبيرة، والجسيمات المجمعة الكبيرة التي قد تسد جهاز تصفية doliolid (شبكة المخاط). إذا كانت الثقافة تتكون من الممرضات في وقت مبكر، والحفاظ على واحد gonozooid كبيرة (≥ 6 ملم) في جرة.
ملاحظة: ليس من المهم أي الأنواع كوببود المدرجة في الثقافة، ولكن في هذه التجربة، تم استخدام الأنواع الأكثر وفرة موجودة من حيث تم التقاط doliolids.
- بعد فترة التأقلم، نقل zooids doliolid وcopepods من جرة الأصلي إلى جرة زراعة نظيفة تحتوي على 80٪ فلتر الألياف الزجاجية (GF / F) تصفية مياه البحر و 20٪ من مياه البحر من جرة الأصلي. إعداد مياه البحر المصفاة عن طريق تصفية مياه البحر من خلال GF / F مع حجم المسام الاسمية من ورقة فلتر 0.7 m.
- الحفاظ على الثقافة الجديدة من خلال تبادل 10٪ من المياه مع GF / F مياه البحر المصفاة كل 3 أيام وعن طريق إزالة المجاميع والكريات البراز. أسبوعيا، نقل الحيوانات إلى جرة جديدة كما هو موضح في الخطوة 4.2.
- تغذية doliolids عن طريق الحفاظ على تركيزات العوالق النباتية في الجرار الثقافة بين 40-95 درجة مئوية / لتر.
ملاحظة: هذه التركيزات تحاكي الظروف البيئية التي من المعروف أن تدعم ظروف ازهر لD. gegenbauri17. يختلف خليط أنواع الطحالب حسب مرحلة الحياة وعدد الحيوانات الحيوانية في كل جرة. خلال مراحل الحياة المبكرة، إضافة 1:1 خليط (حسب محتوى الكربون) من الطحالب cryptomonad(Isochrysis galbana وRhodomonas sp.) فقط. ويمكن لأنواع الفرائس الأكبر أن تسد بسهولة جهاز تغذية الممرضات الصغيرات ويطورن التروبهوزويد. إضافة دياتوم Thalassiosira weissflogii إلى خليط الطحالب، وأيضا في محتوى الكربون على قدم المساواة، عند تغذية الممرضات أكبر، phorozooids، وgonozooids.- رصد تركيزات الطحالب قبل وبعد التغذية لتوجيه قرار كم مرة وكم الطحالب لإضافة إلى الثقافات. استخدام عداد الجسيمات لتحديد تركيزات الطحالب، لأن تركيزات الطحالب في الجرار الثقافة تضعف نسبيا.
- إزالة ما يكفي من zooids للحفاظ على تركيزات الطحالب من 40 - 95 ميكروغرام / لتر بحيث يكون doliolids المتبقية لديها ما يكفي من الغذاء لزراعة.
ملاحظة: أصعب مرحلة حياة للحفاظ على بنجاح في ظل الظروف المختبرية هي اليرقات النامية وoozooid (ممرضة في وقت مبكر). خلال هذه المرحلة من الثقافة، والحفاظ على واحد gonozooid كبيرة (≥ 6 ملم) بالإضافة إلى العديد من الكوببودات في جرة مع اليرقات النامية وoozooids (~ 20 لكل جرة 3.8 لتر). - نقل ما لا يقل عن 4 ممرضات إلى جرة زراعة جديدة مرة واحدة على الأقل من 8 trophozooids مرئية على cadophore الممرضة (الشكل1B).
ملاحظة: سوف تتضاعف التروبوزويد في عدد كل 1 - 2 أيام في 20 درجة مئوية. التروبهوزويد كبيرة بما يكفي لتكون مرئية للعين المجردة.- إزالة اثنين من الممرضات مرة واحدة الممرضات تطوير 20 trophozooids.
- إزالة ممرضة واحدة عندما تتطور الممرضات > 30 trophozooids على cadophores بهم. السماح للممرضة المتبقية لتطوير phorozooids على cadophore لها.
- إزالة الممرضة بمجرد أن تطلق الممرضة ما يصل إلى 30 phorozooids.
- تقليل عدد الحيوانات في جرة مرة واحدة في phorozooids تصل إلى 3 ملم في الحجم.
- إزالة جميع phorozooids ما عدا أربعة عندما تصبح phorozooids أكبر (> 5 ملم) وقد وضعت مجموعات gonozooid.
- تقليل الثقافة إلى اثنين phorozooids عندما يزيد عدد مجموعات gonozooids في الحجم والبدء في تغذية.
- إزالة phorozooids مرة واحدة phorozooids الإفراج عن ما يصل إلى 30 gonozooids.
- تقليل عدد الغونوزويد من 30 zooids إلى 2 لكل جرة. السماح بالإفراج عن البيض المخصبة في الجرة.
- إزالة gonozooid واحد ترك gonozooid واحد في جرة بمجرد تطوير oozooids.
ملاحظة: يمكن استخدام الممرضات المهملات وphorozooids وgonozooids لزرع ثقافات إضافية وإجراء المزيد من التجارب.
- إزالة gonozooid واحد ترك gonozooid واحد في جرة بمجرد تطوير oozooids.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بعد الإجراءات الموصوفة لجمع وزراعة doliolid، D. gegenbauri المبينة في الشكل3، فمن الممكن للحفاظ على ثقافة D. gegenbauri عبر تاريخ حياتها المعقدة (الشكل 1) و الحفاظ عليه لعدة أجيال. على الرغم من أن زراعة D. gegenbauri موصوفة هنا، فإن هذه الإجراءات ينبغي أن تكون ذات صلة أيضا لزراعة الأنواع الأخرى من الدولوليد.
يتطلب التقاط الحيوانات الحيوانية الدولويدات الصحية وغير التالفة تطبيقالناموسيات المتخصصة وإجراءات القطر (الشكل 4). كالحيوانات الحساسة مع عدم وجود هياكل صلبة، ينبغي توخي الحذر للحد من الإجراءات التي قد تؤدي إلى أي ضرر مادي. ويمكن أن تشمل هذه العوامل الاضطرابات والضغط والتفاعلات مع الأسطح بما في ذلك فقاعات الشبكة والهواء والهواء. على الرغم من طبيعتها الحساسة، ومع ذلك، يمكن جمع zooids doliolid غير التالفة باستخدام شبكة العوالق المخروطية مع قطر فتح لطول نسبة 1:5 ومجهزة كبيرة نسبيا المرجحة غير تصفية نهاية سمك القد. بشكل روتيني استخدمنا شبكة 202 م 2.5 م (طول) شبكة العوالق مع فتحة 0.5 م شنت في تسخير دوارومجهزة 4 L المرجحة غير تصفية سمك القد نهاية (الشكل 4). على الرغم من أن تأثير حجم شبكة العوالق على التقاط الحيوانات الأليفة D. gegenbauri القابلة للزراعة لم يتم التحقيق بشكل منهجي، من الناحية النظرية، فإن استخدام شبكة مع حجم شبكة أكبر قد يؤدي إلى مزيد من التحسن كما أكبر حجم شبكة من شأنه أن تقليل مجال الضغط المتولد أثناء القطر. وبدلاً من ذلك، سيؤدي حجم الشبكة الأكبر إلى زيادة تدفق المياه عبر الشبكة، مما قد يؤدي إلى تلف الحيوانات الحيوانية في الدوليوليد. يجب تحسين سرعات القطر والزاوية الصافية لتقليل وقت السحب والتلف أثناء التجميع. في تجربتنا، وجدنا أن ظروف القطر لطيف بما فيه الكفاية يمكن تحقيقها عن طريق سحب الشبكة بشكل غير مباشر في زاوية 15-25 درجة من سفينة الانجراف مع سرعة النشر الرأسي واسترجاع لا تزيد عن 15 م / دقيقة. لتوجيه الشبكة إلى اتجاه تدفق المياه، يتم تركيب شبكة العوالق في تسخير دوار. وعادة ما يكون توزيع doliolids في عمود الماء ليست عشوائية وكبيرة عموما في المنطقة مع أعلى الجسيمات الأحمال24. ولذلك، ينبغي أخذ عينات من عمود الماء من تحت الحد الأقصى للكلوروفيل تحت سطح الأرض إلى السطح. في الجرف الضحلة SAB منتصف القارة (20-45 م)، يتم أخذ عينات من عمود الماء من حوالي 1 متر فوق القاع إلى السطح.
وبمجرد جمع الحيوانات الحيوانية السليمة، من الأهمية بمكان الحفاظ عليها بطريقة تقلل من التعرض للأسطح. لتقليل اللقاءات مع الأسطح يتم الاحتفاظ doliolids في الجرار مدورة مليئة بمياهالبحر وتعثرت بلطف على عجلة العوالق تدور ببطء (الشكل 2).
على الرغم من أنه من الممكن نظريا لبدء ثقافة مع zooids من أي مرحلة من مراحل الحياة، واستكشاف النجاحات والفشل في إنشاء ثقافات جديدة من D. gegenbauri من 6 محاولات بين 2015-2018 في Bight جنوب المحيط الأطلسي تشير إلى أن النجاح غالباً ما يتحقق عندما يتم جمع zooids من المياه التي هي < 21°C، وعندما يتم استخدام مراحل الحياة غير gonozooids ناضجة كبيرة لبدء ثقافة جديدة (الجدول1 والجدول 2). في الممارسة العملية، فمن المفيد، أو على الأقل ليس ضارا، لتشمل مراحل حياة متعددة من zooids doliolid عند بدء ثقافة جديدة.
النجاح في الحفاظ على ثقافة D. gegenbauri، كما تم وصفه لأنواع أخرى من التونيكات البحرية20، يعتمد على توفير ما يكفي، ولكن ليس المفرط، الغذاء والتنوع الغذائي اللازمة لدعم كل مرحلة من مراحل الحياة. وبما أن متطلبات النظام الغذائي تختلف طوال دورة الحياة، يجب أن تختلف كمية الطحالب المقدمة في كل وقت من وقت التغذيةللحفاظ على تركيزات الأغذية عند المستويات المستهدفة المطلوبة (40 - 95 ميكروغرام C/L) (الجدول 3). ويمكن أن تؤدي التركيزات التي تتجاوز هذه المستويات أو دونها إلى زيادة معدلات الوفيات (G.A. Paffenhöfer pers. comm.). على الرغم من أن النظام الغذائي الطبيعي من D. gegenbauri لا يزال غير مفهومة بشكل جيد6،يمكن الحفاظ على الثقافات من خلال توفير خليط بسيط نسبيا من الطحالب المستزرعة واستخدام الإجراءات التي تسمح للمجتمعات الميكروبية المتنوعة لإنشاء في الثقافة. وتتحقق زيادة التنوع المحتمل لحقل الفرائس عن طريق الاحتفاظ بجزء من مياه الجسيمات المحملة من الثقافات القديمة وإدراج عدد صغير من الكوببودات الحية والدوليوليدات الكبيرة في كل تغيير أو نقل للمياه. ويفترض أن هذه الكائنات تعالج الطحالب والمواد الحطاطية وتعمل على تنويع حجم الجسيمات وطيف الجودة المتاح للتغذية الدوليوليدة، ولكن يلزم إجراء دراسات إضافية لتأكيد هذه الفرضية.
توافر الثقافات doliolid يوفر وسيلة للتحقيق، في ظل الظروف التجريبية الخاضعة للرقابة، العديد من الجوانب الهامة من البيولوجيا doliolid، علم وظائف الأعضاء، والإيكولوجيا، والبيولوجيا الجزيئية. على سبيل المثال، على الرغم من أن doliolids وفيرة في العديد من مناطق المحيط الساحلي والرعي العوالق الرئيسية25،لا تزال البيانات عن معدلات التغذية والنمو نادرة26. وباستخدام ثقافات D. gegenbauri،كان التركيز على البحوث القائمة على الثقافة هو تحديد معدلات التغذية والنمو كمياً استجابة للبارامترات البيئية الحرجة بما في ذلك درجات الحرارة وتركيزات الأغذية26. وقد أشارت نتائج هذه الدراسات إلى أن معدلات التطهير متشابهة بتركيزات تتراوح بين 20 و60 ميكروغرام من الغرام من اللتر/لتر وتنخفض مع زيادة التركيزات الغذائية (الشكل5ألف). معدلات التخليص زيادة تناسبيا على نطاقات درجة الحرارة الداعمة لنمو D. gegenbauri (الشكل5B). وتتراوح معدلات النمو (ك) بين 0.1 و0.7 في اليومكدالة لدرجة الحرارة وتوافر الأغذية (الشكل 6). وقد أتاحت هذه الدراسات، بالإضافة إلى توفير معلومات عملية للزراعة، تحديد العلاقات الكمية بين التغذية الدوليوليدة ومعدلات النمو كدالة للبارامترات البيئية، وتوفر رؤى نقدية في البيولوجيا والإيكولوجيا من doliolids المطلوبة لإدراج هذه المجموعة العوالق الحيوانية الهامة في أطر النمذجة27.
الشكل 1: دورة حياة D. gegenbauri عند 20 درجة مئوية.
تم تعديل رسم دورة الحياة (1A) بعد والترز وآخرون 20186 وإعادة رسمها بإذن. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: عجلة العوالق المستخدمة في الثقافة د. غيجينبوري. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: نظرة عامة تخطيطية على دال - نهج جمع وزراعة الغيغنبوري.
جمع فيالبحر (أ)، نقل من الدلاء المركزة إلى الكأس الزجاجية الصغيرة في دفعات صغيرة (B)، وعزل zooids doliolid في زراعة الجرار التي تحتوي على مياه البحر الغنية بالجسيمات (C)، والصيانة على عجلة العوالق طوال دورة الحياة(D،E). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: شبكة العوالق والنشر.
النشر (أعلى اليسار)، واسترجاع (أعلى اليمين)، والتخطيطي ة من صافي ونهاية سمك القد (أسفل). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: معدلات إزالة الطحالب من د. غيجينبوري غونوزويدس.
(أ) العلاقة بين (أ) متوسط (± S.E.) معدلات التخليص (مل / zooid / يوم) مقابل تركيز العوالق النباتية (ميكروغرام C / L) لثلاثة أحجام من الجونوزويد D. gegenbauri. تمثل كل نقطة 4-11 ملاحظة. (ب) متوسط (± S.E.) معدلات التخليص (مل / zooid / يوم) مقابل درجة الحرارة (درجة مئوية) لثلاثة أحجام من الغونوزويد D. gegenbauri. وتمثل كل نقطة 4-12 ملاحظة. أحجام Gonozooids هي 2.5 مم
()،
4.5 مم
()، و 6.5 ملم (). وقد أعيد رسم الأرقام بإذن26. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: معدلات النمو في د. جيجينبوري غونوزويد.
العلاقةبين (A) متوسط (± S.E.) معدلات النمو (ك) مقابل تركيز العوالق النباتية (ميكروغرام C / L) لثلاثة أحجام من gonozooids Dolioletta gegenbauri. تمثل كل نقطة 4-11 ملاحظة. (ب) متوسط (± S.E.) معدلات النمو (ك) مقابل درجة الحرارة (°C) لثلاثة أحجام من gonozooids Dolioletta gegenbauri. وتمثل كل نقطة 4-12 ملاحظة. أحجام Gonozooids هي 2.5 مم()،4.5 مم()، و 6.5 ملم (). وقد أعيد رسم الأرقام بإذن من جيبسون وPaffenhöfer26. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الجدول 1 الظروف الأوقيانوغرافية ووفرة دولوليد | |||||||||||
| السطح | اسفل | السطح | اسفل | السطح | اسفل | وفرة دولوليد | |||||
| تاريخ | هوية الرحلة البحرية | خط العرض (N) | خط الطول (W) | العمق (م) | درجة الحرارة (درجة مئوية) | درجة الحرارة (درجة مئوية) | الملوحة (PSU) | الملوحة (PSU) | الكلا (ميكروغرام / لتر) | الكلا (ميكروغرام / لتر) | zooids/m3 |
| 20/05/2015 | SAV-15-10 | 31.1889 | 80.1527 | 41.30 | 25.26 | 22.43 | 33.58 | 36.96 | Na | 0.20 | Na |
| 04/08/2015 | SAV-15-19 | 29.5687 | 80.3269 | 40.00 | 26.40 | 21.75 | 36.26 | 36.32 | 1.04 | 1.35 | 218 |
| 02/12/2015 | SAV-15-31 | 31.1674 | 80.1249 | 40.80 | 23.24 | 22.60 | 35.91 | 35.81 | 1.06 | 1.70 | 13 |
| 02/02/2017 | SAV-17-03 | 31.2139 | 80.1823 | 41.00 | 18.72 | 18.84 | 36.00 | 36.12 | 0.83 | 1.50 | 3 |
| 07/11/2017 | SAV-17-23 | 31.2144 | 80.1822 | 42.00 | 24.19 | 23.85 | 36.00 | 36.04 | 0.63 | 1.30 | 254 |
| 01/02/2018 | SAV-18-02 | 31.1835 | 80.1466 | 43.00 | 16.85 | 16.45 | 36.50 | 36.48 | 0.56 | 0.89 | Na |
| NA: البيانات غير متوفرة | |||||||||||
الجدول 1: الظروف الأوقيانوغرافية ووفرة الدوليوليد على الجرف القاري في جنوب المحيط الأطلسي في الوقت والموقع الذي تم جمع الحيوانات الحيوانية Gegenbauri وتستخدم لبدء ثقافات جديدة.
| الجدول 2 نتائج محاولات زراعة الجيغنبوري D. | ||||
| تاريخ | هوية الرحلة البحرية | الزوويدات التي تم جمعها | نتائج | تعليقات |
| 20/05/2015 | SAV-15-10 | ناضجة جنسيا كبيرة (6-7 مم) gonozooids | فشل | جميع الـ(غونوزويد) ماتوا بعد 4 أيام تم إنتاج مراحل حياة أوسويد وممرضة مبكرة ولكنها فشلت في الازدهار. |
| 04/08/2015 | SAV-15-19 | ناضجة جنسيا كبيرة (8-10 مم) gonozooids | فشل | توفي الغونوزويد بعد وقت قصير من جمعها. تم إنتاج Oozooids والممرضات في وقت مبكر ولكن فشلت في الازدهار. |
| 02/12/2015 | SAV-15-31 | مجموعة مختلطة بما في ذلك ممرضة في وقت متأخر (4-5 ملم) مع trophozooids المرفقة، ناضجة جنسيا كبيرة (6 ملم) gonozooids، وoozooids (2 ملم) | الناجحه | تم إضافة الجينوزويد والممرضات الإضافيين الذين تم جمعهم في يناير ومارس 2016 إلى الثقافة. تم إخلاء المختبر لمدة 4 أيام خلال إعصار ماثيو في أكتوبر 2016 ولم تنج الثقافة. |
| 02/02/2017 | SAV-17-03 | مجموعة مختلطة بما في ذلك gonozooids (1.5-5 مم) وphorozooids كبيرة (6 ملم) مع مجموعات gonozooid المرفقة | الناجحه | تم إضافة الغونوزويد اتُمعت في أبريل 2017 إلى الثقافة، بعد أن كانت مثقفة لمدة 4 أجيال كاملة. تم إنهاء الثقافة في سبتمبر 2017 قبل إعصار إيرما. |
| 07/11/2017 | SAV-17-23 | الغونوزويدس (3-6 ملم) | فشل | توفي gonozooid كبيرة بعد 1 يوم. الجونوزويد غير ناضجة نجا في الثقافة لمدة 14 يوما. تم إطلاق البيض من قبل كل من الغونوزويد. تم إنتاج Oozooids ولكن فشل في التطور إلى مراحل التمريض. الثقافة فشلت بعد شهر واحد. |
| 01/02/2018 | SAV-18-02 | ممرضة كبيرة (6-7 ملم) في وقت متأخر دون trophozooids | الناجحه | في ثقافة أنتج الممرضة [تروبهوزويدس]. تم الحفاظ على الثقافة لمدة 3 أجيال وتم إنهاؤها في نهاية يونيو 2018 عند الانتهاء من التجارب. |
الجدول 2: نتائج محاولات إنشاء ثقافات مختبرية دال - جيغينبوري التي جُمعت من الجرف القاري في جنوب المحيط الأطلسي.
| دوليوليتا غيغينبوري | عدد zooid لكل | عدد zooid لكل | |||
| مرحلة الحياة | 3.9 لتر جرة | 1.9 لتر جرة | Isochrysis galbana | رودوسوناس سب. | ثالاسوسيرا فايسفلوجي |
| محمد الدوسري | 20 | 10 | تشمل | تشمل | لا تشمل |
| ممرضة في وقت مبكر | 20 | 10 | تشمل | تشمل | لا تشمل |
| ممرضة في وقت متأخر مع 8 trophozooids | 4 | 2 | تشمل | تشمل | تشمل |
| ممرضة في وقت متأخر مع 20 trophozooids | 2 | 1 | تشمل | تشمل | تشمل |
| ممرضة في وقت متأخر مع 30 trophozooids | 1 | 1 | تشمل | تشمل | تشمل |
| فوروزويد (1 إلى 3 مم) | 30 | 15 | تشمل | تشمل | تشمل |
| الكتلة الغنوزويد phorozooid (> 5 مم) | 2 | 1 | تشمل | تشمل | تشمل |
| غونوزويد (1 إلى 3 مم) | 30 | 15 | تشمل | تشمل | تشمل |
| غونوزويد (> 5 ملم) | 2 | 1 | تشمل | تشمل | تشمل |
| ينبغي الحفاظ على التركيزات المستهدفة للطحالب بين 40-95 ميكروغرام من الغرام من اللتر مع مخاليط متساوية (حسب محتوى الكربون) لكل نوع من أنواع الطحالب | |||||
الجدول 3: الظروف الثقافية المستهدفة لكل منها D. مرحلة دورة حياة gegenbauri.
الشكل التكميلي 1: وصف مفصل لعجلة العوالق المخصصة. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد أنشئت القدرة على تربية الدوليوليدات على مدى العقود العديدة الماضية واستخدمت لدعم البحوث في عدة مجالات. وقد دعمت الدراسات التجريبية في مختبراتنا نشر ما لا يقل عن 15 دراسة علمية تركز على التغذية والنمو18،26، الاستنساخ18،28، النظام الغذائي6، 29، علم وظائف الأعضاء30، علم البيئة31، والنمذجة الإيكولوجية27 من doliolids.
على الرغم من أن ثقافة هذه الحيوانات الحساسة هي حاليا كثيفة العمالة وتستغرق وقتا طويلا، وزراعة doliolids ممكن، وإذا تم القيام به من قبل المجتمع الأوسع سوف تعزز النهوض بفهم هذا الإيكولوجيا و مجموعة هامة من الحيوانات التطور. وكان الهدف من هذه الدراسة هو وصف النهج الحالية لجمع وتربية والحفاظ على D. gegenbauri في الثقافة لغرض إجراء دراسات مختبرية.
يتطلب إنشاء ثقافة الدوليوليد جمع الحيوانات السليمة وغير التالفة، وبمجرد التقاطها، العلاج اللطيف، والتغذية المناسبة، وتربية. Doliolids، وعلى وجه التحديد الأنواع D. gegenbauri، يحدث على الصعيد العالمي على الرفوف القارية شبه الاستوائية ولكن وفرة يمكن أن تكون متغيرة للغاية. على سبيل المثال، في دراسة حديثة ركزت على منطقة منتصف الجرف من SAB، على الرغم من أن وفرة تختلف بشكل كبير من <1/m3 إلى > 20،000/m3،كانت doliolids موجودة على مدار السنة6. بسبب التباين الكبير في الدوليوليدات في المكان والزمان والصعوبة النسبية التي ينطوي عليها أخذ عينات من بيئات هامش الجرف القاري، فإن المعرفة الموثوقة بالديناميات المجتمعية الدوليوليدة حيث تجري الدراسات أمر مهم شرط مسبق لنجاح تأسيس الثقافة.
وبمجرد العياز الدوليوليد تم تحديد هاوليد والقبض عليها، قد يكون من الصعب تحديد ما إذا كانت الحيوانات قد تضررت. قد تبدو الحيوانات غير تالفة وتظهر سلوكيات السباحة والهروب النشطة، ولكن حتى أصغر إصابة يمكن أن تؤدي إلى فشلها في الازدهار. إحدى الخصائص التي لها صلة خاصة بالتقييم الصحي للزوى الدوليوليد الملتقطة هي قدرتها على الإطعام. يمكن تقييم نشاط التغذية ببساطة عن طريق توفير الطحالب المصطبغة للالحيوانات التي يتم التقاطها حديثا. إذا كان الحيوان يتغذى، فإن الأمعاء تصبح ملونة في غضون فترة قصيرة من الزمن. في تجربتنا، وجدنا أن إضافة كمية صغيرة من الطحالب الحمراء المصطبغة، Rhodomonas sp.، يوفر بسرعة معلومات حول نشاط التغذية. وإذا لم يتم ملاحظة التغذية، فمن المستبعد جداً أن يمكن إنشاء ثقافة.
اليقظة وتربية جيدة أمر انّها حاسمة لإنشاء والحفاظ على doliolids طوال دورة حياتهم المعقدة. ولعل المرحلة الأكثر إشكالية هي تطوير ممرضة قابلة للحياة من مرحلة اليرقات وإنتاج (تنبت) من التروبوزويدس التغذية. في هذه المرحلة من الحياة، ونحن نتكهن بأن الاحتياجات الغذائية، فيما يتعلق بالكمية، والجودة، وحجم الجسيمات محدودة للغاية. على حد علمنا، لم تكن هناك دراسات سابقة التي حققت في نشاط التغذية من اليرقات D. gegenbauri وoozooids. على سبيل المثال، على الرغم من أن الغونوزويد اتّهمون على الجبين وphorozooids قادرون على تناول الجسيمات على نطاق واسع من الأحجام، فإن قدرة اليرقات والأوزويد والممرضات الصغيرات من المرجح أن تكون محدودة أكثر. في الممارسة العملية، نجد أن الزراعة الناجحة في هذه المراحل من الحياة يمكن أن تتحقق عن طريق حذف الدياتومات من خليط غذاء الطحالب، عن طريق الحفاظ على تركيزات الغذاء عند مستويات معتدلة، عن طريق إجراء التغذية المتكررة بتركيزات أقل، عن طريق الحفاظ على واحد أكبر gonozooid وكوببودس قليلة مع الثقافة، وعن طريق إزالة يدويا المجاميع الكبيرة من المخلفات.
على الرغم من أننا حافظنا على ثقافات D. gegenbauri لعدة أجيال ناشئة من مجموعة واحدة، عندما يكون ذلك ممكنا نحن عادة استكمال الثقافات القائمة مع الحيوانات التي تم جمعها حديثا لزيادة التنوع الجيني والمتانة من الثقافة. ومن الخطورة المحتملة لهذه الممارسة إدخال الطفيليات أو الأمراض في الثقافة، ولكن على حد علمنا، لم نواجه هذه المشكلة. على الرغم من أن هناك تقارير قليلة من الطفيليات من doliolids32، مما لا شك فيه ، فهي موجودة. ومن المثير للاهتمام، في دراسة حديثة مقارنة النظام الغذائي للمثقف D. gegenbauri الغونوزويدس المعرضة للمياه الطبيعية مع الغونوزويد D. gegenbauri اشتعلت في الميدان، تم الكشف عن الطفيليات Apicomplexa المفترضة في السكان البرية التي كانت غائبة في الحيوانات المثقفة6.
وهناك قيد موجود على تكنولوجيا الثقافة الموصوفة هو الحد من حجم الإنتاج الحيواني. ولا سيما لأن التقنيات الموصوفة تنطوي على زراعة في الجرار المختومة في كثافات منخفضة على عجلة العوالق الدوارة، فمن غير الواضح ما إذا كان يمكن توسيع نطاق هذا النهج أو أن تدفق العمل سيكون قابلا للأتمتة. أنظمة زراعة على نطاق أوسع، ومع ذلك، لأنواع أخرى حساسة صغيرة حساسة من العوالق الحيوانية البحرية الجيلاتينية، وقد وصفت اليرقات Oikopleura dioica،20،33،34، مما يشير إلى أنه قد يكون من الممكن تصميم أنظمة مماثلة للdoliolids في المستقبل. ومع ذلك، فإن تاريخ الحياة المعقدة من D. gegenbauri بالمقارنة مع تاريخ الحياة أبسط من O. dioica ستظل تحديا كبيرا للزراعة على نطاق واسع.
في الختام، بعد البروتوكولات الموصوفة هنا، D. gegenbauri يمكن زراعتها بشكل موثوق في ظل ظروف المختبر الخاضعة للرقابة طوال تاريخ حياته المعقدة. هذه القدرة تجعل الأنواع قابلة لمجموعة متنوعة من الدراسات التجريبية الخاضعة للرقابة، وربما لتطوير doliolids كنموذج حيواني جديد في البيولوجيا التنموية والتطور. غير أنه سيلزم التغلب على أوجه القصور في حجم الإنتاج قبل تحقيق هذا الهدف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يعلنونه.
Acknowledgments
ونحن ممتنون للعديد من الأشخاص الذين ساهموا بالمعرفة المتراكمة في هذا المشروع على مر السنين بما في ذلك G.-A. Paffenhöfer وD. Deibel الذين وضعوا أصلا هذه البروتوكولات. كما ساهم السيد كوستر وإل لامبولي مساهمة كبيرة في تطوير هذه الإجراءات. ونتج عن كل من ن. ب. لوبيز - فيغيروا وأي إ. رودريغيز - سانتياغو تقديرات وفرة الدوليوليد الواردة في الجدول 1. وقد حظيت هذه الدراسة بدعم جزئي من جوائز المؤسسة الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة OCE 082599 و1031263 إلى MEF، والمشاريع التعاونية OCE 1459293 وOCE 14595010 إلى الوزارة وشركة DMG، وجائزة الإدارة الوطنية لدراسة المحيطات والغلاف الجوي NA16SEC4810007 إلى DMG. ونحن ممتنون للطاقم الكادح والمهنية من السافانا R / V. لي آن ديليو أعدت الأرقام، تشارلز ي. روبرتسون التدقيق المخطوطة، وجيمس (جيمي) وليامز تصنيع عجلة العوالق
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Algal culture tubes (55 mL sterile disposable glass culture tubes) | Any | NA | For algal cultures |
| Autoclave | Any | NA | For sterilizing equipment and seawater for algal cultures |
| Beakers (2 L glass) | Any | NA | For sorting diluted plankton net tow contents |
| Buckets (5 gallon, ~20L) | Any | NA | For diluting contents of planton net tow - should be seawater conditioned before first use |
| Carboys (20 L) | Any | NA | For storing seawater |
| Doliolid glass culturing jar (1.9 L narrow mouth glass jar with cap) | Qorpak | GLC-01882 | Container for culture |
| Doliolid glass culturing jar (3.8 L narrow mouth glass jar with cap) | Qorpak | GLC-01858 | Container for culture |
| Environmental Chamber (Temperature controlled enviromental chamber) | Any | NA | To accommodate plankton wheel and culture maintenance |
| Filtration apparatus for 47 mm filters | Any | NA | For filtering seawater for cultures |
| Glass microfiber filters, 47 mm | Whatman | 1825-047 | For filtering seawater for cultures |
| Glass pipette (borosillicate glass pipette (glass tubing), OD 10mm, ID 8 mm, wall thickness 1mm) | Science Company | NC-10894 | Custom cut and edges polished |
| Hose clamps, stainless steel, #104 (178 mm) | Any | NA | For holding culturing jars to the plankton wheel |
| Isochrysis galbana strain CCMP1323 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP1323 | For feeding doliolid cultures |
| L1 Media Kit, 50 L | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | MKL150L | For culturing algae |
| Lamp (Fluorescent table lamp with an adjustable arm) | Any | NA | For illuminating doliolids in the jars and beakers |
| Lighted temperature controlled incubator | Any | NA | For algal cultures |
| Micropipettes and sterile tips (0-20 µl, 20-200 µl, 200-1000 µl) | Any | NA | For algal cultures |
| Plankton Net (202 µm 0.5 m, 5:1 length) with cod end ring and 4 L aquarium cod-end | Sea-Gear Corporation | 90-50x5-200-4A/BB | For collecting living doliolids (see Figure 4) |
| Plankton Wheel | NA | NA | Custom built (see Figure 2) |
| Plastic wrap | Any | NA | To cover inside of lid of doliolid culture jars |
| Potassium Permanganate | Fisher Scientific | P279-500 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Rhodomonas sp. strain CCMP740 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP740 | For feeding doliolid cultures |
| Rubber Tubing | NA | NA | For holding culturing jars to the plankton wheel (can be made from tygon tubing) |
| Sodium Bisulfite | Fisher Scientific | S654-500 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-212 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Sterile serological pipettes (1 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL) | Any | NA | For algal cultures |
| Thalassiosira weissflogii strain CCMP1051 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP1051 | For feeding doliolid cultures |
| Tissue culture flasks (250 mL) | Any | NA | For algal cultures |
References
- Banse, K. Zooplankton – Pivotal role in the control of ocean production. Ices Journal of Marine Science. 52 (3-4), 265-277 (1995).
- Wilson, S. E., Ruhl, H. A., Smith, K. L. Zooplankton fecal pellet flux in the abyssal northeast Pacific: A 15 year time-series study. Limnology and Oceanography. 58 (3), 881-892 (2013).
- Bode, A., Álvarez-Ossorio, M. T., Miranda, A., Ruiz-Villarreal, M. Shifts between gelatinous and crustacean plankton in a coastal upwelling region. Ices Journal of Marine Science. 70 (5), 934-942 (2013).
- Kiorboe, T.
- Holland, L. Z.
- Walters, T. L., et al. Diet and trophic interactions of a circumglobally significant gelatinous marine zooplankter, Dolioletta gegenbauri (Uljanin, 1884). Molecular Ecology. , Special Issue: Species Interactions, Ecological Networks and Community Dynamics (2018).
- Piette, J., Lemaire, P. Thaliaceans, the neglected pelagic relatives of ascidians: a developmental and evolutionay enigma. Quarterly Review of Biology. 90 (2), 117-145 (2015).
- Acuña, J. L.
- Alldredge, A. L., Madin, L. P. Pelagic tunicates – unique herivores in the marine plankton. Bioscience. 32 (8), 655-663 (1982).
- Wada, H. Evolutionary history of free-swimming and sessile lifestyles in urochordates as deduced from 18S rDNA molecular phylogeny. Molecular Biology and Evolution. 15 (9), 1189-1194 (1998).
- Zeng, L. Y., Jacobs, M. W., Swalla, B. J. Coloniality has evolved once in stolidobranch ascidians. Integrative and Comparative Biology. 46 (3), 255-268 (2006).
- Delsuc, F., Brinkmann, H., Chourrout, D., Philippe, H. Tunicates and not cephalochordates are the closest living relatives of vertebrates. Nature. 439 (7079), 965-968 (2006).
- Garstang, W. The morphology of the Tunicata, and its bearing on the phylogeny of the chordata. Quarterly Journal of Microscopical Science. 72 (285), 51-187 (1929).
- Govindarajan, A. F., Bucklin, A., Madin, L. P.
- Godeaux, D., Bone, Q., Braconnot, J. C. The Biology of Pelagic Tunicates. Bone, Q. , Oxford University Press. 1-24 (1998).
- Deibel, D., Lowen, B. A review of the life cycles and life-history adaptations of pelagic tunicates to environmental conditions). Ices Journal of Marine Science. 69 (3), 358369 (2012).
- Paffenhöfer, G., Köster, M. From one to many: on the life cycle of Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 33 (7), 1139-1145 (2011).
- Paffenhöfer, G. A., Gibson, D. M. Determination of generation time and asexual fecundity of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 21 (6), 1183-1189 (1999).
- Conley, K. R., Lombard, F., Sutherland, K. R. Mammoth grazers on the ocean's minuteness: a review of selective feeding using mucous meshes. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 285 (1878), (2018).
- Bouquet, J. M., et al. Culture optimization for the emergent zooplanktonic model organism Oikopleura dioica. Journal of Plankton Research. 31 (4), 359370 (2009).
- Denoeud, F., et al. Plasticity of Animal Genome Architecture Unmasked by Rapid Evolution of a Pelagic Tunicate. Science. 330 (6009), 1381-1385 (2010).
- Harrison, P. J., Waters, R. E., Taylor, F. J. R. A broad-spectrum artificial seawater medium for coastal and open ocean phytoplankton. Journal of Phycology. 16 (1), 2835 (1980).
- Ohman, M. D., et al. Zooglider: An autonomous vehicle for optical and acoustic sensing of zooplankton. Limnology and Oceanography-Methods. 17 (1), 69-86 (2019).
- Takahashi, K., et al. In situ observations of a doliolid bloom in a warm water filament using a video plankton recorder: Bloom development, fate, and effect on biogeochemical cycles and planktonic food webs. Limnology and Oceanography. 60 (5), 1763-1780 (2015).
- Deibel, D. The biology of pelagic tunicates. Bone, Q. , Oxford University Press. 171-186 (1998).
- Gibson, D. M., Paffenhöfer, G. A. Feeding and growth rates of the doliolid, Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 22 (8), 1485-1500 (2000).
- Haskell, A., Hofmann, E., Paffenhöfer, G., Verity, P. Modeling the effects of doliolids on the plankton community structure of the southeastern US continental shelf. Journal of Plankton Research. 21 (9), 1725-1752 (1999).
- Gibson, D. M., Paffenhöffer, G. A. Asexual reproduction of the doliolid, Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 24 (7), 703-712 (2002).
- Frischer, M. E., et al. Reliability of qPCR for quantitative gut content estimation in the circumglobally abundant pelagic tunicate Dolioletta gegenbauri (Tunicata, Thaliacea). Food Webs. 1, 7 (2014).
- Köster, M., Paffenhöfer, G., Baker, C., Williams, J. Oxygen consumption of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 32 (2), 171-180 (2010).
- Paffenhöfer, G. A hypothesis on the fate of blooms of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 35 (4), 919-924 (2013).
- Takahashi, K., et al. Sapphirinid copepods as predators of doliolids: Their role in doliolid mortality and sinking flux. Limnology and Oceanography. 58 (6), 1972-1984 (2013).
- Martí-Solans, J., et al. Oikopleura dioica Culturing Made Easy: A Low-Cost Facility for an Emerging Animal Model in EvoDevo. Genesis. 53 (1), 183-193 (2015).
- Nishida, H. Development of the appendicularian Oikopleura dioica: Culture, genome, and cell lineages. Development Growth & Differentiation. 50, S239-S256 (2008).
