Summary
Doliolider, inklusive arten Dolioletta gegenbauri, är små gelatinösa Marina zooplankton av ekologisk betydelse som finns på produktiva Subkontinentala hyllsystem över hela världen. Svårigheten att kultera dessa känsliga organismer begränsar deras utredning. I denna studie beskriver vi odlingsmetoder för insamling, uppfödning och underhåll av doliolid Dolioletta gegenbauri.
Abstract
Gelatinös Zooplanktons spelar en avgörande roll i havets ekosystem. Det är dock i allmänhet svårt att undersöka deras fysiologi, tillväxt, Fecundity, och trofiska interaktioner främst på grund av metodologiska utmaningar, inklusive förmågan att odla dem. Detta gäller särskilt för doliolid, Dolioletta gegenbauri. D. gegenbauri förekommer vanligen i produktiva subtropiska kontinentalsocklar system över hela världen, ofta vid blomkoncentrationer som kan konsumera en stor del av den dagliga primärproduktionen. I denna studie beskriver vi odlingsmetoder för insamling, uppfödning och underhåll av D. gegenbauri i syfte att genomföra laboratoriebaserade studier. D. gegenbauri och andra doliolid arter kan fångas levande med hjälp av snett dragna koniska 202 μm mesh plankton nät från ett drivande skepp. Kulturer är mest tillförlitligt etablerad när vattentemperaturen är under 21 ° c och startas från omogen gonozooids, mognar phorozooids, och stora sjuksköterskor. Kulturer kan upprätthållas i rundade kultur fartyg på en långsamt roterande plankton hjulet och ihållande på en diet av odlade alger i naturliga havsvatten i många generationer. Förutom förmågan att etablera laboratorie kulturer av D. gegenbaurivisar vi att insamlings villkoret, alg koncentrationen, temperaturen och exponeringen för naturligt betingat havsvatten är avgörande för kulturen etablering, tillväxt, överlevnad och reproduktion av D. gegenbauri.
Introduction
Zooplankton står för den största djur biomassan i havet, är viktiga komponenter i Marina livsmedel duk, och spelar viktiga roller i Ocean biogeokemiska cykler1,2. Zooplankton, även om det består av en enorm mångfald av organismer, kan grovt särskiljas i två kategorier: gelatinös och icke-gelatinös med få mellanliggande taxa3,4. Jämfört med icke-gelatinös zooplankton, gelatinös zooplankton är särskilt svåra att studera på grund av deras komplexa livshistorier5, och deras känsliga vävnader är lätt skadas under avskiljning och hantering. Gelatinös zooplankton arter är därför notoriskt svårt att kulturen i laboratoriet och i allmänhet mindre studerade jämfört med icke-gelatinös arter6.
Bland gelatinösa zooplankton grupper, en riklig och av ekologisk betydelse i världshavs är de Thalivalens. Thalifarer är en klass av pelagiskt manteldjur som inkluderar order Salpida, Pyrosomida och Doliolida7. Doliolida, kollektivt kallas doliolids, är små fat-formade fri-simning pelagiska organismer som kan nå höga överflöd i produktiva Neritic regioner i subtropiska hav. Doliolider är bland de vanligast förekommande av alla zooplankton grupperna4,8. Som suspension matare, doliolids samla matrester från vattnet kolumnen genom att skapa filter strömmar och fånga dem på slem nät9. Taxonomiskt, doliolids klassificeras i stam urochordata10. Ancestral till chordates, och utöver deras ekologiska betydelse som viktiga komponenter i Marina pelagiska system, är Thalidjur av betydelse för att förstå ursprunget till kolonial livshistoria10,11 och utvecklingen av chordates5,7,10,12,13,14.
Doliolids livshistoria är komplex och bidrar till svårigheten att ta fram och upprätthålla dem genom sin livscykel. En översyn av doliolid livscykel och anatomi finns i Godeaux et al.15. Doliolid livscykel, som innebär en obligatorisk alternering mellan sexuella och asexuella livshistoria stadier, presenteras i figur 1. Ägg och sperma produceras av hermafroditer gonozooids, den enda ensamma skede av livscykeln. Gonozooider frigör spermier till vattenpelare och ägg är internt befruktade och frigörs för att utvecklas till larver. Larverna kläcks och förvandlas till oozooider som kan nå 1-2 mm. förutsätta gynnsamma miljöförhållanden och näring, oozooids blir tidiga sjuksköterskor inom 1-2 dagar vid 20 ° c och initiera koloniala stadier av livscykeln. Oozooids asexuellt producera knoppar på deras ventrala stolon. Dessa knoppar lämnar stolon och migrera till dorsala cadophore där de rada upp i tre Parade rader. De centrala dubbla raderna blir phorozooids och de yttre två dubbla raderna blir trofozooider. Den senare ger mat till både sjuksköterskan och phorozooids16,17. Den trophozooids förse sjuksköterskan med näring som hon förlorar alla inre organ. Eftersom överflödet av trofozooider ökar, kan storleken på sjuksköterskan nå 15 mm i laboratoriet. Som phorozooids växa, de alltmer mata in plankton Prey och nå ~ 1,5 mm i storlek innan de släpps som individer17. En enda sjuksköterska kan släppa > 100 phorozooids under sin livslängd18. Efter phorozooids släpps från cadophore, de fortsätter att växa och är den andra koloniala stadiet av livscykeln. När de når ~ 5 mm i storlek, varje phorozooid utvecklar ett kluster av gonozooider på deras ventrala stjälk. Dessa gonozooider kan inmata partiklar när de når ~ 1 mm i längd. Efter gonozooider har nått ~ 2 till 3 mm i storlek de släpps från phorozooid och bli den enda ensamma skede av livscykeln. När de når ~ 6 mm i storlek, gonozooids bli sexuellt mogna17. Gonozooider kan nå 9 mm eller mer i längd. Gonozooider är hermafroditiska, spermier frigörs intermittent medan gödsling av äggen sker internt16,17. När gonozooid är ≥ 6 mm i storlek, det frigör upp till 6 befruktade ägg. Framgångsrik odling kräver att stödja de specifika behoven hos var och en av dessa unika livshistoria stadier.
På grund av den ekologiska och evolutionära betydelsen av Thalidjur, inklusive doliolider, finns det ett behov av odlingsmetoder för att främja förståelsen av organismens unika biologi, fysiologi, ekologi och evolutions historia19 . Doliolids har ett stort löfte som experimentella modellorganismer i utvecklingsbiologi och funktionsgenomik eftersom de är transparenta och sannolikt har effektiviserat genomen hos20,21. Avsaknaden av pålitliga odlingsmetoder hindrar dock deras användbarhet som laboratorie modeller. Även om en handfull laboratorier har publicerat resultat baserade på odlade doliolider, till våra kunskaper odlingsmetoder och detaljerade protokoll har inte tidigare publicerats. Baserat på år av erfarenhet, och försök och fel odlingar odling, syftet med denna studie var att granska erfarenheter och dela protokoll för insamling och odling av doliolider, särskilt arten Dolioletta gegenbauri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av odlingsanläggningar för uppfödning av D. gegenbauri
Obs: allt material och all utrustning som behövs listas i material tabellen.
- Bered 1 M natriumhydroxid (NaOH), 0,06 M kaliumpermanganat (KMnO4) lösning. Lös upp 400 g NaOH i 10 L avjoniserat vatten för att bereda denna lösning. Tillsätt 100 g KMnO4 till NaOH-lösningen och blanda väl.
- Bered en 0,1 M natriumbisulfit (NaHSO3) lösning genom att lösa upp 100 g nahso3 i 10 L avjoniserat vatten och blanda väl.
FÖRSIKTIGHET: dessa reagenser är irriterande som kan orsaka andningsproblem vid inandning. Plats i ett väl ventilerat utrymme som ett draghuv. Undvik hudkontakt. Använd skyddshandskar, skyddskläder, ögonskydd och ansiktsskydd vid hantering. - Före upprättande och uppfödning doliolid kulturer i laboratoriet, rengör och sterilisera kulturen burkar.
- Skölj 1,9 L och 3,8 L kultur burkar minst 3 gånger med avjoniserat vatten. Låt skruvlocken torka, eftersom locken inte ingår i följande rengöringssteg.
- Rengör och sterilisera 1,9-och 3,8 L glas kultur burkar genom att doppa dem i NaOH/KMnO4 lösning. Låt burkarna att suga över natten.
- Ta bort burkarna från NaOH/KMnO4 lösningen och sänk ned burkarna i natriumbisulfit (NaHSO3) lösning. Låt burkarna att suga över natten.
- Ta bort burkarna från NaHSO3 -lösningen och skölj noggrant med avjoniserat vatten. Låt burkarna torka.
- Placera plankton hjulet (figur 2) i ett temperaturkontrollerat utrymme (miljökammare). Temperera temperaturen till 20 ° c. För en mer detaljerad beskrivning av det anpassade plankton hjulet, se kompletterande figur 1.
2. växtplankton kultur
- Få alg kulturer från National Center for Marine alger och Microbiota (NCMA) eller andra källor som ska användas som livsmedel för D. gegenbauri. Blandningar av två flagellatarter inklusive Isochrysis Galbana (ccmp 1323), rhodomonas sp (CCMP 740) och en liten Diatom, thalassiosira weissflogii (CCMP 1051) erhölls från ncma och har använts i tidigare laboratorie studier till bakre doliolids lyckat17.
- Förbered L1 och L1-si tillväxt Media22 som rekommenderas av ncma.
- Följ instruktionerna från leverantören för att initiera de nya alg kulturerna.
- För att bibehålla beståndet kulturer, med rigorösa axenic kultur teknik, överföra 0,5 mL av gamla senescing kultur till 25 mL färsk tillväxt media i sterila 55 mL glas kultur rör varannan vecka.
Obs: det är inte möjligt att lagra levande alg kulturer utan att överföra dem regelbundet. Om kulturer inte kommer att användas under långa perioder, och det inte är möjligt att bibehålla kulturer under den tid som inte används, rekommenderas återanskaffning av dessa vanliga alg kulturer från deras ursprungliga källor (t. ex. NCMA). - Förbered större mängder fytoplankton för utfodring av doliolider i ren 500 mL plast vävnad kultur flaskor som innehåller 200 mL av tillväxt medier.
- Inokulera fytoplankton från axeniska bestånd (4 mL) till 200 mL av tillväxtmedia (1:50 spädning).
- Inkubera vid 20 ° c med en 12:12 h ljus: mörk cykel under kallt vitt ljus belysning på 65-85 μE/m2. Lay kultur kolvar platt för att maximera belysningen. Försiktigt snurra kulturen dagligen.
- Bestäm koncentrationen av celler med hjälp av en partikelräknare eller Mikroskop för att övervaka tillväxten av kulturerna.
Anmärkning: efter 7-10 dagar från Inympning, den infektera kulturer kommer att innehålla ~ 105-106 celler/ml och diatomkulturen kommer att innehålla ~ 104-105 celler/ml. Dessa koncentrationer är tillräckligt för att bibehålla doliolid kulturer. - Initiera nya utfodringsbestånd minst varannan vecka för att ge tillräckligt med algbiomassa för att stödja all kulturverksamhet.
3. insamling av vilda doliolider och havsvatten för kultur
Anm.: en översikt över insamlings-och odlingsmetoder beskrivs i figur 3. I figur 4finns en beskrivning av den specialiserade samlingen plankton net och COD-End.
- Lokalisera doliolids genom att detektera dem med hjälp av antingen plankton nät eller in situ Imaging system23.
Anmärkning: eftersom doliolider sällan förekommer i ytvatten och inte kan upptäckas med fjärranalysteknik, som styrs av nödvändig kunskap om gynnsamma förhållanden för doliolider (se diskussion), måste förekomst av doliolider bestämmas före provtagning. - Samla partikel rika havsvatten före insamling av levande doliolids som förberedelse för att initiera en D. gegenbauri kultur.
- Använd Niskin-flaskor monterade på en CTD-rosett eller likvärdig utrustning för att samla upp vatten från platsen där doliolider finns och från djupet som innehåller de högsta skattningarna av klorofyll en koncentration beräknad med in situ fluorometri.
Anmärkning: klorofyll en koncentration används som indikator på partikelkoncentrationen. På South Atlantic Bight (SAB) Mid-kontinentalsockeln, är under ytan klorofyll en maximal vanligtvis nära botten, men på andra platser, kan det inte vara.
- Använd Niskin-flaskor monterade på en CTD-rosett eller likvärdig utrustning för att samla upp vatten från platsen där doliolider finns och från djupet som innehåller de högsta skattningarna av klorofyll en koncentration beräknad med in situ fluorometri.
- När doliolider är belägna, återhämta oskadade doliolid zooider med hjälp av specialiserade plankton netto och COD-End. Innan du distribuerar nätet, Fyll COD-end med havsvatten.
- Från ett drivande skepp, lägre och höja nätet genom vatten kolumnen upprätthålla en sned bogsering vinkel ~ 15-25 ° och vertikal driftsättning och hämtning hastighet inte överstiger 15 m/min.
- När nätet är ombord, försiktigt överföra och dela upp innehållet i torsk-änden till 3, 5-gallon (~ 20 L) plast hinkar vardera innehåller ~ 10 L yta havsvatten som samlats in från platsen.
Anmärkning: nya plast skopor bör konditioneras genom tillsats av havsvatten dagar innan levande doliolid samling. Målet är att minska läckage av kemikalier från plast. Om havsvatten inte finns tillgängligt, Använd renat (t. ex. Milli Q) eller kranvatten som är fritt från giftiga föroreningar för att villkora skoporna. - Isolera doliolid zooider från andra plankton.
- I små partier (~ 2 L) överföring blandade Planktons från nätet Tow innehållet (nu i 20 L plast skopor) till en 2 L glasbägare.
- Med hjälp av en bredbar glaspipett (8 mm ID x 38 cm längd), försiktigt sifon och överför aktivt simning doliolid zooider från bägaren till ren glas kultur burkar innehållande partikel rikt havsvatten som samlats in med Niskin-flaskor från där doliolider Belägna.
- Släpp försiktigt doliolid zooids under ytan av havsvattnet.
Anmärkning: samla in gonozooider, phorozooider som innehåller fastsatta gonozooider och sjuksköterska stadier som innehåller bifogade trofozooider (figur 1).
- Efter tillsats av doliolider, tillsätt Rhodomonas SP. kultur till en slutlig koncentration av ~ 5 x 103 – 104 celler/ml (~ 50 ml av en kultur som innehåller ~ 5 x 104 – 1 x 105 celler/ml i en 3,8 L burk). Detta för att avgöra om dolioliderna aktivt utfodring. När doliolids mata in rhodomonas SP., deras mag-tarmkanalen kommer att visas röd färg. Ta bort zooider som inte verkar vara utfodring.
- För att förhindra att doliolider fastnar vid luft-vatten-gränssnittet, Undvik headspace i kulturen burkar genom att helt fylla burkarna med ofiltrerat partikel-rika havsvatten och placera en bit plastfolie över burken öppningen (89 mm bred).
- Undvik att skapa luftbubblor som också kan skada djuren. Skruva försiktigt locket på burken och vänd försiktigt burken för att avgöra om bubblor är närvarande. Om det finns bubblor, ta bort dem.
- Efter burkar fylls, torka av överflödigt vatten från utsidan av burken.
- Montera varje burk på plankton hjulet (figur 2) genom att placera burken på de vertikala metallstänger täckt med gummislangar, och mellan en rostfri slangklämma.
- Se till att bak i burken är vadderade mot gummi slangen. Dra åt slangklämman runt burken genom att justera skruven.
- Kontrollera att burken inte rör sig när den är ordentligt fastsatt på plats. Låt burkarna rotera vid 0,3 RPM för att hålla dolioliderna i suspensionen.
FÖRSIKTIGHET: det är viktigt att inte överdra burken för att förhindra att burken sprickbildning.
- På fartyget, underhålla kultur fartygen på plankton hjulet vid 20 ° c i svagt ljus tills de kan överföras till laboratorie kultur anläggningen.
- När du återvänder till laboratoriet, överför burkar som innehåller doliolider till den förberedda kultur anläggningen. Montera burkar på plankton hjulet (se steg 3,8) och låt burkarna fortsätta att rotera vid 0,3 RPM.
Anmärkning: all uppfödning av doliolider i denna studie utfördes vid 20 ° c.
4. underhålla D. gegenbauri kulturer
- Från fartyget till labbet, låta djuren att vänja sig i den ursprungliga burkar till laboratorieförhållanden i 3 dagar.
- Under acklimatisering perioden, Använd en bred bar glaspipett att utbyta 10% av vattnet med ofiltrerat partikel-rika havsvatten från samlingsplatsen varje dag i 3 dagar.
- Håll flera hoppkräftor i burken men ta bort alla andra zooplankton, stora fekal pellets, och stora aggregerade partiklar som kan täppa till doliolid s FILTRERINGSAPPARAT (slem netto). Om kulturen består av tidiga sjuksköterskor, Behåll en stor gonozooid (≥ 6 mm) i burken.
Notera: det är inte viktigt vilka hoppkräftor arter ingår i kulturen, men i detta experiment, de vanligast förekommande arter som finns där dolioliderna fångades användes.
- Efter den acklimatisering perioden, överföra dos zooider och hoppkräftor från den ursprungliga burken till en renodling burk som innehåller 80% glasfiberfilter (GF/F) filtrerat havsvatten och 20% av havsvattnet från den ursprungliga burken. Förbered filtrerat havsvatten genom filtrering av havsvatten genom en GF/F med en nominell porstorlek på 0,7 μm filterpapper.
- Bibehålla den nya kulturen genom att utbyta 10% av vattnet med GF/F filtrerat havsvatten var 3 dagar och genom att ta bort aggregat och fekal pellets. Varje vecka, överför djuren till en ny burk enligt beskrivningen i steg 4,2.
- Foder doliolider genom att bibehålla fytoplankton koncentrationer i odlings bur kar mellan 40-95 μg C/L.
Obs: dessa koncentrationer härmar miljöförhållanden som är kända för att stödja Bloom villkor för D. gegenbauri17. Blandningen av alg arter varierar beroende på livsskede och antalet zooider i varje burk. Under tidiga levnadsstadier, tillsätt 1:1 blandning (med kolhalt) av cryptomonad alger (Isochrysis Galbana och rhodomonas SP.) endast. Större bytesdjur kan lätt täppa till utfodringsapparaten av små sjuksköterskor och utveckla trofozooider. Tillsätt diatomen Thalassiosira weissflogii till alg blandningen, även vid lika kolhalt, vid utfodring av större sjuksköterskor, phorozooider och gonozooider.- Övervaka alg koncentrationer före och efter utfodring för att vägleda beslutet om hur ofta och hur mycket alger att lägga till i kulturerna. Använd en partikelräknare för att bestämma alg koncentrationen, eftersom alg koncentrationen i odlings burkarna är relativt utspädd.
- Ta bort tillräckligt zooider för att bibehålla alg koncentrationer av 40 – 95 μgC/L så att de återstående dolioliderna kommer att ha tillräckligt med mat att växa.
Obs: den svåraste livsskede att upprätthålla framgångsrikt under laboratorieförhållanden är att utveckla larver och oozooid (tidig sjuksköterska). Under denna fas av kulturen, hålla en stor gonozooid (≥ 6 mm) Förutom flera hoppkräftor i burken med att utveckla larver och oozooids (~ 20 per 3,8 L burk). - Överför minst 4 sjuksköterskor till en ny odlings burk när minst 8 trofozooider är synliga på sjuksköterskans cadophore (figur 1b).
Obs: Trofozooider kommer att fördubblas i antal var 1 – 2 dagar vid 20 ° c. Trofozooider är tillräckligt stora för att vara synlig för blotta ögat.- Ta bort två av sjuksköterskorna när sjuksköterskor utveckla 20 trophozooids.
- Ta bort en sjuksköterska när sjuksköterskorna utvecklar > 30 trophozooids på sina cadophores. Låt den kvarvarande sjuksköterskan utveckla phorozooider på sin cadophore.
- Ta bort sjuksköterskan när sköterskan släpper upp till 30 phorozooids.
- Minska antalet djur i burken när phorozooids når 3 mm i storlek.
- Ta bort alla utom fyra phorozooids när phorozooids blir större (> 5 mm) och har utvecklat gonozooid kluster.
- Minska kulturen till två phorozooids när antalet gonozooids kluster öka i storlek och börja foder.
- Ta bort phorozooids när phorozooids släppa upp till 30 gonozooider.
- Minska antalet gonozooider från 30 zooider till 2 per burk. Låt befruktade ägg släppas ut i burken.
- Ta bort en gonozooid lämnar en enda gonozooid i burken när oozooids utvecklas.
Obs: kasserade sjuksköterskor, phorozooider, och gonozooider kan användas för att utsäde ytterligare kulturer och att genomföra ytterligare experiment.
- Ta bort en gonozooid lämnar en enda gonozooid i burken när oozooids utvecklas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter de beskrivna förfarandena för insamling och odling av doliolid, d. gegenbauri som beskrivs i figur 3, är det möjligt att bibehålla en kultur av d. gegenbauri under hela dess komplexa livshistoria (figur 1) och upprätthålla den i många generationer. Även om odling av D. gegenbauri beskrivs här, bör dessa förfaranden också vara relevanta för odling av andra doliolid-arter.
Att fånga friska och oskadade doliolid zooider kräver tillämpning av specialiserade nät och bogsering förfaranden (figur 4). Som ömtåliga djur utan hårda strukturer, bör försiktighet iakttas för att minimera förfaranden som kan resultera i någon fysisk skada. Dessa faktorer kan innefatta turbulens, tryck och interaktioner med ytor inklusive nät, luft och luftbubblor. Trots sin känsliga natur kan dock oskadade doliolid zooider samlas in med ett koniskt plankton nät med en öppningsdiameter på 1:5 och utrustad med en relativt stor viktad icke-filtrerande torsk ände. Rutinmässigt har vi använt en 202 μm mesh 2,5 m (längd) plankton netto med en 0,5 m öppning monterad i en vridbar sele och utrustad med en 4 L vägd icke-filtrering COD-End (figur 4). Även om effekten av plankton maskstorlek på fångst av odlingsbara D. gegenbauri zooids har inte systematiskt undersökts, teoretiskt, kan användningen av ett nät med en större maskstorlek resultera i ytterligare förbättring som större maskstorlek skulle minska det tryck fält som genereras vid bogsering. Alternativt, större maskstorlek kommer att resultera i större vattenflöde genom nätet, potentiellt skadliga doliolid zooids. Bogserings hastigheter och netto vinkel bör optimeras för att minimera bogsering tid och skador under insamling. Enligt vår erfarenhet har vi funnit att tillräckligt skonsam bogsering villkor kan uppnås genom att bogsera nätet snett i en vinkel på 15-25 ° från ett drivande fartyg med vertikal driftsättning och hämtning hastigheter inte överstiger 15 m/min. För att orientera nätet i riktning mot vattenflödet monteras plankton nätet i en vridbar sele. Det är vanligtvis så att fördelningen av doliolider i vatten kolumnen inte är slumpmässig och i allmänhet störst i regionen med de högsta partikel belastningarna24. Därför ska vatten spalten underifrån under ytan klorofyll maximalt till ytan tas prov. I den grunda SAB Mid-kontinentalsockeln (20-45 m) samplas vatten spalten från ~ 1 m över botten till ytan.
När friska zooider har samlats in, är det viktigt att bibehålla dem på ett sätt som minimerar exponering för ytor. För att minimera möten med ytor hålls doliolider i rundade burkar fyllda med havsvatten och ramlade försiktigt på ett långsamt roterande plankton hjul (figur 2).
Även om det är teoretiskt möjligt att starta en kultur med zooider av varje livsskede, utforskning av framgångar och misslyckanden på att etablera nya kulturer D. gegenbauri från 6 försök mellan 2015-2018 i södra Atlanten Bight tyder på att framgång uppnås oftast när zooider samlas in från vatten som är < 21 ° c, och när andra livsstadier än stora mogna gonozooider utnyttjas för att starta en ny kultur (tabell 1 och tabell 2). I praktiken är det till hjälp, eller åtminstone inte skadligt, att inkludera flera livsstadier av doliolid zooids vid initiering av en ny kultur.
Framgång i att upprätthålla en kultur av D. gegenbauri, som har beskrivits för andra pelagiska artikel om arter20, är beroende av att ge tillräcklig, men inte överdriven, mat och mat mångfald som krävs för att stödja varje livsskede. Eftersom diet krav varierar under hela livscykeln, måste mängden alger som tillhandahålls vid varje utfodringstid varieras för att bibehålla livsmedelskoncentrationer på önskade målnivåer (40 – 95 μg C/L) (tabell 3). Koncentrationer över eller under dessa nivåer kan resultera i ökad dödlighet (G.A. Paffenhöfer pers. comm.). Även om den naturliga kosten för D. gegenbauri förblir dåligt förstått6, kulturer kan upprätthållas genom att leverera relativt enkla blandningar av odlade alger och använda förfaranden som gör det möjligt för olika mikrobiella samhällen att etablera i kulturen. Att öka den potentiella mångfalden av bytes fältet uppnås genom att behålla en bråkdel av partikel lastat vatten från äldre kulturer och införandet av ett litet antal levande kopepoder och stora doliolider vid varje vatten förändring eller överföring. Förmodligen, dessa organismer process alger och detritusfosfor material och tjänar till att diversifiera partikelstorlek och kvalitet spektrum tillgängliga för doliolid Nutrition, men ytterligare studier krävs för att bekräfta denna hypotes.
Tillgängligheten av doliolid kulturer ger möjlighet att undersöka, under kontrollerade experimentella förhållanden, många viktiga aspekter av doliolid biologi, fysiologi, ekologi, och molekylärbiologi. Till exempel, även om doliolids är riklig i många regioner i kust oceanen och är stora plankton betare25, uppgifter om graden av utfodring och tillväxt är fortfarande knappa26. Använda kulturer av D. gegenbauri, en inriktning på kulturbaserad forskning har varit att kvantifiera utfodring och tillväxttakt som svar på kritiska miljöparametrar inklusive temperatur och livsmedelskoncentrationer26. Resultat från dessa studier har visat att clearance är likartad vid koncentrationer från 20 till 60 μg C/L och minskar när livsmedelskoncentrationerna ökar (figur 5a). Clearance ökar proportionellt över temperaturområden som stöder D. gegenbauri tillväxt (Figur 5b). Tillväxttakten (k) varierar mellan 0,1 – 0,7/dag som en funktion av temperatur och livsmedels tillgänglighet (figur 6). Dessa studier, förutom att ge praktisk information för odling, har gjort det möjligt att fastställa kvantitativa relationer mellan doliolid utfodring och tillväxttakt som en funktion av miljöparametrar och ge kritisk insikt i den biologi och ekologi doliolids krävs för att inkludera denna viktiga zooplankton grupp i modellering ramverk27.
Figur 1: livscykeln för D. gegenbauri vid 20 ° c.
Livscykel ritningen (1A) har modifierats efter Walters et al. 20186 och omritats med tillstånd. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: plankton hjul som används för att odla D. gegenbauri. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Schematisk översikt över D. gegenbauri insamling och odling strategi.
Insamling till sjöss (a), överföring från koncentrerade skopor till små glasbägare i små partier (B), isolering av doliolid zooider till odling av burkar innehållande partikel rikt havsvatten (C), underhåll på plankton hjulet under hela livscykeln (D, E). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: plankton netto och utbyggnad.
Distribution (överst till vänster), hämtning (överst till höger) och schematiskt net-och COD-slut (nederst). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: clearance av Algal för D. gegenbauri gonozooids.
A) förhållandetmellan (a) medelvärde (± e) clearance (ml/zooid/dag) kontra fytoplankton koncentration (μg C/L) för tre storlekar av D. gegenbauri gonozooider. Varje punkt representerar 4 – 11 observationer. B) medelvärde (± e) clearance (ml/zooid/dag) jämfört med temperatur (° c) i tre storlekar av D. gegenbauri gonozooids. Varje punkt representerar 4 – 12 observationer. Gonozooids storlekar är 2,5 mm (
), 4,5 mm (
), och 6,5 mm (
). Siffrorna har återtagits med tillstånd26. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Diagram 6: tillväxttakten för D. gegenbauri gonozooid.
Förhållandet mellan (a) medelvärde (± e) tillväxttakt (k) kontra fytoplankton koncentration (μg C/L) för tre storlekar av Dolioletta gegenbauri gonozooider. Varje punkt representerar 4 – 11 observationer. B) Genomsnittlig (± e) tillväxttakt (k) jämfört med temperatur (° c) för tre storlekar av Dolioletta gegenbauri gonozooider. Varje punkt representerar 4 – 12 observationer. Gonozooids storlekar är 2,5 mm (), 4,5 mm (), och 6,5 mm (). Figurerar har re-Drawn med tillåtelse från Gibson och Paffenhöfer26. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Tabell 1. Oceanografiska förhållanden och Doliolidöverflöd | |||||||||||
| Ytan | Botten | Ytan | Botten | Ytan | Botten | Doliolid överflöd | |||||
| Datum | Cruise ID | Latitud (N) | Longitud (W) | Djup (m) | Temperatur (⁰ C) | Temperatur (⁰ C) | Salthalt (PSU) | Salthalt (PSU) | CHLA (μg/L) | CHLA (μg/L) | zooider/m3 |
| 20/05/2015 | SAV-15-10 | 31,1889 | 80,1527 | 41,30 | 25,26 | 22,43 | 33,58 | 36,96 | Na | 0,20 | Na |
| 04/08/2015 | SAV-15-19 | 29,5687 | 80,3269 | 40,00 | 26,40 | 21,75 | 36,26 | 36,32 | 1,04 | 1,35 | 218 |
| 02/12/2015 | SAV-15-31 | 31,1674 | 80,1249 | 40,80 | 23,24 | 22,60 | 35,91 | 35,81 | 1,06 | 1,70 | 13 |
| 02/02/2017 | SAV-17-03 | 31,2139 | 80,1823 | 41,00 | 18,72 | 18,84 | 36,00 | 36,12 | 0,83 | 1,50 | 3 |
| 07/11/2017 | SAV-17-23 | 31,2144 | 80,1822 | 42,00 | 24,19 | 23,85 | 36,00 | 36,04 | 0,63 | 1,30 | 254 |
| 01/02/2018 | SAV-18-02 | 31,1835 | 80,1466 | 43,00 | 16,85 | 16,45 | 36,50 | 36,48 | 0,56 | 0,89 | Na |
| NA: data är inte tillgängliga | |||||||||||
Tabell 1: oceanografiska förhållanden och doliolidöverflöd på södra Atlantens Bight Mid-kontinentalsockeln vid den tidpunkt och plats där D. gegenbauri zooids samlades in och används för att initiera nya kulturer.
| Tabell 2. Utfall av D. gegenbauri-Kulturförsök | ||||
| Datum | Cruise ID | Zooider samlas in | Resultatet | Kommentarer |
| 20/05/2015 | SAV-15-10 | Könsmogna stora (6-7 mm) gonozooider | Misslyckades | Alla gonozooider hade dött efter 4 dagar. Oozooid och tidiga sjuksköterska livsskeden producerades men misslyckades med att frodas. |
| 04/08/2015 | SAV-15-19 | Könsmogna stora (8-10 mm) gonozooider | Misslyckades | Gonozooider dog kort efter samlingen. Oozooids och tidiga sjuksköterskor producerades men misslyckades med att frodas. |
| 02/12/2015 | SAV-15-31 | Blandad samling inklusive sen sjuksköterska (4-5 mm) med bifogade trofozooider, könsmogna stora (6 mm) gonozooider och oozooider (2 mm) | Framgångsrika | Odlade för 4 hela generationer, ytterligare gonozooider och sjuksköterskor som samlats in i januari och mars 2016 lades till kulturen. Laboratoriet evakuerades i 4 dagar under orkanen Matthew i oktober 2016 och kulturen överlevde inte. |
| 02/02/2017 | SAV-17-03 | Blandad samling inklusive gonozooider (1,5-5 mm) och stora phorozooider (6 mm) med bifogade gonozooid-kluster | Framgångsrika | Odlade för 4 hela generationer, ytterligare gonozooider samlades i april 2017 lades till kulturen. Uppsagd kultur i september 2017 i förväg av orkanen Irma. |
| 07/11/2017 | SAV-17-23 | Gonozooider (3-6 mm) | Misslyckades | Stora gonozooid dog efter 1 dag. Den omogen gonozooid överlevde i kulturen i 14 dagar. Ägg släpptes av båda gonozooids. Oozooids producerades men misslyckades med att utvecklas till sjuksköterska stadier. Kulturen misslyckades efter 1 månad. |
| 01/02/2018 | SAV-18-02 | Stor (6-7 mm) sen sjuksköterska utan trofozooider | Framgångsrika | I kulturen producerade sjuksköterskan trofozooider. Kulturen upprätthölls i 3 generationer och avslutades i slutet av juni 2018 då experiment ingicks. |
Tabell 2: resultat av försök att etablera laboratorie kulturer av D. gegenbauri som samlats in från South Atlantic Bight Mid-Continental shelf.
| Mer från dolioletta gegenbauri | zooid antal per | zooid antal per | |||
| livsskede | 3,9 L burk | 1,9 L burk | Auktor | Rhodomonas SP. | Mer från thalassiosira weissflogii |
| oozooid | 20 | 10 | Inkluderar | Inkluderar | INKLUDERAR INTE |
| tidig sjuksköterska | 20 | 10 | Inkluderar | Inkluderar | INKLUDERAR INTE |
| sen sjuksköterska med 8 trofozooider | 4 | 2 | Inkluderar | Inkluderar | Inkluderar |
| sen sjuksköterska med 20 trophozooids | 2 | 1 | Inkluderar | Inkluderar | Inkluderar |
| sen sjuksköterska med 30 trofozooider | 1 | 1 | Inkluderar | Inkluderar | Inkluderar |
| phorozooid (1 till 3 mm) | 30 | 15 | Inkluderar | Inkluderar | Inkluderar |
| phorozooid gonozooid Cluster (> 5 mm) | 2 | 1 | Inkluderar | Inkluderar | Inkluderar |
| gonozooid (1 till 3 mm) | 30 | 15 | Inkluderar | Inkluderar | Inkluderar |
| gonozooid (> 5 mm) | 2 | 1 | Inkluderar | Inkluderar | Inkluderar |
| Målkoncentrationer av alger bör bibehållas mellan 40-95 μg C/L med lika blandningar (med kolhalt) av varje alg-art | |||||
Tabell 3: mål kulturförhållanden för varje D. gegenbauri Livscykelfas.
Kompletterande figur 1: detaljerad beskrivning av det anpassade plankton hjulet. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kapaciteten att odla doliolider har etablerats under de senaste decennierna och har använts för att stödja forskning inom flera områden. Experimentella studier i våra laboratorier har stött offentliggörandet av minst 15 vetenskapliga studier inriktade på utfodring och tillväxt18,26, reproduktion18,28, diet6, 29, fysiologi30, ekologi31och ekologisk modellering27 av doliolider.
Även om kulturen av dessa ömtåliga djur är för närvarande arbetsintensiva och tidskrävande, är odling av doliolids genomförbart och, om den genomförs av den bredare gemenskapen kommer att främja utvecklingen av förståelsen av denna ekologiskt och evolutionärt viktig grupp av djur. Syftet med denna studie var att beskriva aktuella metoder för att samla in, fostra och underhålla D. gegenbauri i kulturen för att genomföra laboratoriebaserade studier.
Inrättandet av en doliolid kultur kräver insamling av friska och oskadade djur och, när fångas, skonsam behandling, lämplig näring och djurhållning. Doliolider, särskilt arten D. gegenbauri, förekommer circumglobalt på subtropiska kontinentalhyllor men överflöd kan vara mycket varierande. Till exempel, i en nyligen studie inriktad på mitten hylla regionen av SAB, även om överflöd varierade dramatiskt från < 1/m3 till > 20000/m3, doliolids var närvarande under hela året6. På grund av den höga variationen av doliolider i tid och rum och den relativa svårigheten med provtagning av kontinentalsocklar, är tillförlitlig kunskap om doliolid samhällsdynamik där studier bedrivs en viktig förutsättning för en lyckad etablering av kulturen.
När doliolid zooids har legat och fångats, kan det vara svårt att avgöra om djuren har skadats. Djur kan tyckas vara oskadade och uppvisar aktiv simning och flykt beteenden, men även den minsta skadan kan resultera i deras misslyckande att frodas. En egenskap som är särskilt relevant för hälso bedömningen av fångade doliolid zooider är deras förmåga att föda. Utfodringsaktiviteten kan bedömas genom att enbart ge pigmenterade alger till nyfångade djur. Om ett djur utfodras, kommer tarmen att bli färgad inom en kort tidsperiod. Enligt vår erfarenhet har vi funnit att tillsätta en liten mängd av de röda pigmenterade alger, Rhodomonas SP., snabbt ger information om utfodring aktivitet. Om utfodring inte observeras är det högst osannolikt att en kultur kan etableras.
Vaksamhet och god djurhållning är avgörande för att etablera och upprätthålla doliolids under hela deras komplexa livscykel. Kanske den mest problematiska skede är utvecklingen av en livskraftig sjuksköterska från larv skede och produktion (Sprouting) av utfodring trofoozoids. I detta skede av livet, spekulerar vi att livsmedels kraven, med avseende på kvantitet, kvalitet och partikelstorlek är mest begränsad. Till vår kännedom har det inte förekommit några tidigare studier som har undersökt utfodring aktivitet av D. gegenbauri larver och oozooids. Till exempel, även om utveckla gonozooids och phorozooids kan inta partiklar över ett brett spektrum av storlekar, kapaciteten hos larver, oozooids, och små sjuksköterskor är sannolikt mer begränsad. I praktiken finner vi att en lyckad odling i dessa livsskeden kan åstadkommas genom att man utelämnar kiselalger från mat blandningen alger, genom att bibehålla livsmedelskoncentrationer på måttliga nivåer, genom att utföra täta utfodringar vid lägre koncentrationer, genom att bibehålla en enda större gonozooid och några hoppkräftor med kulturen, och genom att manuellt ta bort stora aggregat av detritus.
Även om vi har behållit kulturer av D. gegenbauri för flera generationer som härrör från en enda samling, när det är möjligt vi rutinmässigt komplettera befintliga kulturer med nyinsamlade djur för att öka genetisk mångfald och robusthet av kulturen. En potentiell risk för denna praxis är införandet av parasiter eller sjukdomar i kulturen, men till vår kännedom har vi aldrig stött på detta problem. Även om det har förekommit få rapporter om parasiter av doliolider32, utan tvekan, de existerar. Intressant, i en nyligen studie som jämförde kosten för odlade d. gegenbauri gonozooids utsätts för naturliga vatten med fält-fångade d. gegenbauri gonozooids, presumtiva Apicomplexa parasiter upptäcktes i den vilda populationen som var frånvarande i de odlade djuren6.
En befintlig begränsning av den beskrivna kulturen tekniken är begränsningen av zooid produktionsvolym. Särskilt på grund av att de beskrivna teknikerna involverar odling i förseglade burkar vid låga densiteter på ett roterande plankton hjul, är det oklart om detta tillvägagångssätt kan skalas upp eller att arbetsflödet skulle vara mottagligt för automatisering. Större skala odlingssystem, men för en annan delikat liten gelatinös Marina djurplankton arter, den larvacean oikopleura dioica, har beskrivits20,33,34, vilket tyder på att det kan möjligt att utforma liknande system för doliolider i framtiden. Men den komplexa livshistoria D. gegenbauri jämfört med den enklare livshistoria O. dioica kommer att förbli en betydande utmaning för storskalig odling.
Sammanfattningsvis, efter de protokoll som beskrivs här, kan D. gegenbauri tillförlitligt odlas under kontrollerade laboratorieförhållanden under hela sin komplexa livshistoria. Denna kapacitet gör arten mottagliga för en mängd kontrollerade experimentella studier, och kanske att utveckla doliolids som en ny djurmodell i utvecklingsbiologi och evolution. Begränsningar av produktions skalan måste dock övervinnas innan detta mål kan uppnås.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att deklarera.
Acknowledgments
Vi är tacksamma mot de många personer som har bidragit med ackumulerad kunskap till detta projekt genom åren, inklusive G.-A. Paffenhöfer och D. Deibel som ursprungligen framkallade dessa protokoll. M. Köster och L. Lamboley har också bidragit väsentligt till utvecklingen av dessa förfaranden. López-Figueroa och Á.E. Rodríguez-Santiago genererade uppskattningarna av det doliolid-överflöd som anges i tabell 1. Denna studie stöddes delvis av US National Science Foundation Awards OCE 082599, 1031263 till MEF, samarbetsprojekt OCE 1459293 och OCE 14595010 till MEF och DMG och, National Oceanic and Atmospheric administration Award NA16SEC4810007 to DMG. Vi är tacksamma för hårt arbetande och professionell besättning av R/V Savannah. Lee Ann DeLeo förberedde figurerna, Charles Y. Robertson korrekturläste manuskriptet och James (Jimmy) Williams tillverkade plankton hjulet
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Algal culture tubes (55 mL sterile disposable glass culture tubes) | Any | NA | For algal cultures |
| Autoclave | Any | NA | For sterilizing equipment and seawater for algal cultures |
| Beakers (2 L glass) | Any | NA | For sorting diluted plankton net tow contents |
| Buckets (5 gallon, ~20L) | Any | NA | For diluting contents of planton net tow - should be seawater conditioned before first use |
| Carboys (20 L) | Any | NA | For storing seawater |
| Doliolid glass culturing jar (1.9 L narrow mouth glass jar with cap) | Qorpak | GLC-01882 | Container for culture |
| Doliolid glass culturing jar (3.8 L narrow mouth glass jar with cap) | Qorpak | GLC-01858 | Container for culture |
| Environmental Chamber (Temperature controlled enviromental chamber) | Any | NA | To accommodate plankton wheel and culture maintenance |
| Filtration apparatus for 47 mm filters | Any | NA | For filtering seawater for cultures |
| Glass microfiber filters, 47 mm | Whatman | 1825-047 | For filtering seawater for cultures |
| Glass pipette (borosillicate glass pipette (glass tubing), OD 10mm, ID 8 mm, wall thickness 1mm) | Science Company | NC-10894 | Custom cut and edges polished |
| Hose clamps, stainless steel, #104 (178 mm) | Any | NA | For holding culturing jars to the plankton wheel |
| Isochrysis galbana strain CCMP1323 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP1323 | For feeding doliolid cultures |
| L1 Media Kit, 50 L | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | MKL150L | For culturing algae |
| Lamp (Fluorescent table lamp with an adjustable arm) | Any | NA | For illuminating doliolids in the jars and beakers |
| Lighted temperature controlled incubator | Any | NA | For algal cultures |
| Micropipettes and sterile tips (0-20 µl, 20-200 µl, 200-1000 µl) | Any | NA | For algal cultures |
| Plankton Net (202 µm 0.5 m, 5:1 length) with cod end ring and 4 L aquarium cod-end | Sea-Gear Corporation | 90-50x5-200-4A/BB | For collecting living doliolids (see Figure 4) |
| Plankton Wheel | NA | NA | Custom built (see Figure 2) |
| Plastic wrap | Any | NA | To cover inside of lid of doliolid culture jars |
| Potassium Permanganate | Fisher Scientific | P279-500 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Rhodomonas sp. strain CCMP740 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP740 | For feeding doliolid cultures |
| Rubber Tubing | NA | NA | For holding culturing jars to the plankton wheel (can be made from tygon tubing) |
| Sodium Bisulfite | Fisher Scientific | S654-500 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-212 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Sterile serological pipettes (1 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL) | Any | NA | For algal cultures |
| Thalassiosira weissflogii strain CCMP1051 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP1051 | For feeding doliolid cultures |
| Tissue culture flasks (250 mL) | Any | NA | For algal cultures |
References
- Banse, K. Zooplankton – Pivotal role in the control of ocean production. Ices Journal of Marine Science. 52 (3-4), 265-277 (1995).
- Wilson, S. E., Ruhl, H. A., Smith, K. L. Zooplankton fecal pellet flux in the abyssal northeast Pacific: A 15 year time-series study. Limnology and Oceanography. 58 (3), 881-892 (2013).
- Bode, A., Álvarez-Ossorio, M. T., Miranda, A., Ruiz-Villarreal, M. Shifts between gelatinous and crustacean plankton in a coastal upwelling region. Ices Journal of Marine Science. 70 (5), 934-942 (2013).
- Kiorboe, T.
- Holland, L. Z.
- Walters, T. L., et al. Diet and trophic interactions of a circumglobally significant gelatinous marine zooplankter, Dolioletta gegenbauri (Uljanin, 1884). Molecular Ecology. , Special Issue: Species Interactions, Ecological Networks and Community Dynamics (2018).
- Piette, J., Lemaire, P. Thaliaceans, the neglected pelagic relatives of ascidians: a developmental and evolutionay enigma. Quarterly Review of Biology. 90 (2), 117-145 (2015).
- Acuña, J. L.
- Alldredge, A. L., Madin, L. P. Pelagic tunicates – unique herivores in the marine plankton. Bioscience. 32 (8), 655-663 (1982).
- Wada, H. Evolutionary history of free-swimming and sessile lifestyles in urochordates as deduced from 18S rDNA molecular phylogeny. Molecular Biology and Evolution. 15 (9), 1189-1194 (1998).
- Zeng, L. Y., Jacobs, M. W., Swalla, B. J. Coloniality has evolved once in stolidobranch ascidians. Integrative and Comparative Biology. 46 (3), 255-268 (2006).
- Delsuc, F., Brinkmann, H., Chourrout, D., Philippe, H. Tunicates and not cephalochordates are the closest living relatives of vertebrates. Nature. 439 (7079), 965-968 (2006).
- Garstang, W. The morphology of the Tunicata, and its bearing on the phylogeny of the chordata. Quarterly Journal of Microscopical Science. 72 (285), 51-187 (1929).
- Govindarajan, A. F., Bucklin, A., Madin, L. P.
- Godeaux, D., Bone, Q., Braconnot, J. C. The Biology of Pelagic Tunicates. Bone, Q. , Oxford University Press. 1-24 (1998).
- Deibel, D., Lowen, B. A review of the life cycles and life-history adaptations of pelagic tunicates to environmental conditions). Ices Journal of Marine Science. 69 (3), 358369 (2012).
- Paffenhöfer, G., Köster, M. From one to many: on the life cycle of Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 33 (7), 1139-1145 (2011).
- Paffenhöfer, G. A., Gibson, D. M. Determination of generation time and asexual fecundity of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 21 (6), 1183-1189 (1999).
- Conley, K. R., Lombard, F., Sutherland, K. R. Mammoth grazers on the ocean's minuteness: a review of selective feeding using mucous meshes. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 285 (1878), (2018).
- Bouquet, J. M., et al. Culture optimization for the emergent zooplanktonic model organism Oikopleura dioica. Journal of Plankton Research. 31 (4), 359370 (2009).
- Denoeud, F., et al. Plasticity of Animal Genome Architecture Unmasked by Rapid Evolution of a Pelagic Tunicate. Science. 330 (6009), 1381-1385 (2010).
- Harrison, P. J., Waters, R. E., Taylor, F. J. R. A broad-spectrum artificial seawater medium for coastal and open ocean phytoplankton. Journal of Phycology. 16 (1), 2835 (1980).
- Ohman, M. D., et al. Zooglider: An autonomous vehicle for optical and acoustic sensing of zooplankton. Limnology and Oceanography-Methods. 17 (1), 69-86 (2019).
- Takahashi, K., et al. In situ observations of a doliolid bloom in a warm water filament using a video plankton recorder: Bloom development, fate, and effect on biogeochemical cycles and planktonic food webs. Limnology and Oceanography. 60 (5), 1763-1780 (2015).
- Deibel, D. The biology of pelagic tunicates. Bone, Q. , Oxford University Press. 171-186 (1998).
- Gibson, D. M., Paffenhöfer, G. A. Feeding and growth rates of the doliolid, Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 22 (8), 1485-1500 (2000).
- Haskell, A., Hofmann, E., Paffenhöfer, G., Verity, P. Modeling the effects of doliolids on the plankton community structure of the southeastern US continental shelf. Journal of Plankton Research. 21 (9), 1725-1752 (1999).
- Gibson, D. M., Paffenhöffer, G. A. Asexual reproduction of the doliolid, Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 24 (7), 703-712 (2002).
- Frischer, M. E., et al. Reliability of qPCR for quantitative gut content estimation in the circumglobally abundant pelagic tunicate Dolioletta gegenbauri (Tunicata, Thaliacea). Food Webs. 1, 7 (2014).
- Köster, M., Paffenhöfer, G., Baker, C., Williams, J. Oxygen consumption of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 32 (2), 171-180 (2010).
- Paffenhöfer, G. A hypothesis on the fate of blooms of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 35 (4), 919-924 (2013).
- Takahashi, K., et al. Sapphirinid copepods as predators of doliolids: Their role in doliolid mortality and sinking flux. Limnology and Oceanography. 58 (6), 1972-1984 (2013).
- Martí-Solans, J., et al. Oikopleura dioica Culturing Made Easy: A Low-Cost Facility for an Emerging Animal Model in EvoDevo. Genesis. 53 (1), 183-193 (2015).
- Nishida, H. Development of the appendicularian Oikopleura dioica: Culture, genome, and cell lineages. Development Growth & Differentiation. 50, S239-S256 (2008).
