Summary
Presentert her er en protokoll for å utføre tid-og plassbegrensede genet Knock-Out i Axolotl spinal snorer ved å injisere CAS9-gRNA kompleks i ryggmargen sentrale kanalen etterfulgt av electroporation.
Abstract
Axolotl har den unike evnen til å regenerere ryggmargen fullt ut. Dette skyldes i stor grad de ependymal cellene som er igjen som nevrale stamceller (NSCs) gjennom hele livet, som sprer seg for å reformere ependymal røret og differensiere til tapte neurons etter ryggmargsskade. Tyde hvordan disse NSCs beholder pluripotency etter utvikling og spredning på ryggmargsskade for å reformere den eksakte pre-skade struktur kan gi verdifull innsikt i hvordan pattedyr rygg ledninger kan regenerere så vel som potensielle behandlingstilbud. Utføre genet knock-outs i bestemte delsett av NSCs innenfor en begrenset periode vil tillate studier av molekylære mekanismer bak disse regenererende prosesser, uten å bli forvirret av utviklingen perturbing effekter. Beskrevet her er en metode for å utføre gen Knock-Out i Axolotl ryggmargen NSCs bruker CRISPR-Cas9 systemet. Ved å injisere CAS9-gRNA kompleks i ryggmargen sentrale kanalen etterfulgt av electroporation, er målet gener slått ut i NSCs innen bestemte regioner i ryggmargen på en ønsket timepoint, noe som åpner for molekylær studier av ryggmargen NSCs under Regenerering.
Introduction
Ryggmargen i de fleste virveldyr er ikke i stand til å regenerere følgende skade, noe som fører til varig uførhet. Flere salamandere, for eksempel Axolotl, er bemerkelsesverdige unntak. Axolotl kan regenerere en strukturelt identisk ryggmarg og fullstendig gjenopprette rygg mARGs funksjonen. Mye av regenererende evne til Axolotl ryggmargen skyldes ependymal celler. Disse cellene linje den sentrale kanalen, og i motsetning til de i pattedyr, Axolotl ependymal celler forbli som nevrale stamceller (NSCs) post-embryoutvikling. Etter ryggmargsskade (f. eks, fra en hale amputasjon), disse NSCs sprer å regrow ependymal røret og differensiere å erstatte tapte neurons1,2,3. Avdekke hvordan Axolotl ryggmargen NSCs forbli pluripotent og bli aktivert etter skade kan gi verdifull informasjon om utvikling av nye terapeutiske strategier for menneskelige pasienter.
På grunn av fremskritt i CRISPR-Cas9 gen Knock-Out teknikken, utføre knock-outs å dechiffrere gen funksjonen har blitt enklere og har vist seg å ha bred anvendelse i ulike arter, inkludert axolotler4,5, 6 andre priser , 7 andre er , 8. den nylige utgivelsen av full Axolotl Genova og transcriptome nå tillater noen genomisk geometriske steder å være målrettet og for bedre vurdere til off-Target effekter9,10,11,12 , 13 på alle , 14. optimaliserte protokoller er utviklet for knock-out og knock-in i axolotler ved hjelp av CRISPR-Cas9-systemet15. Levering av CRISPR-Cas9 maskiner i form av CAS9 protein-gRNA ribonucleoprotein (RNP) har vist å være mer effektiv enn å bruke Cas9 og gRNA-Encoding plasmider4. Dette skyldes sannsynligvis at RNP er mindre i størrelse enn plasmider vektorer, dens evne til å skape DNA pauser umiddelbart, og beskytte gRNA fra RNA degradering. I tillegg bruker RNPs omgår transkripsjon og oversettelse; Dermed unngår den problemer som promoter styrke og optimal Codon bruk når plasmider elementer er avledet fra en annen art.
Tap av funksjon studier er en av de generelle tilnærminger til å undersøke potensielle funksjoner av gener av interesse. For å studere gen funksjon under regenerering, bør en knock-out ideelt utføres like før en skade for å unngå effekter på utvikling. I tillegg bør Knock-Out være begrenset til både NSCs og regionen regenerering. En knock-out av målet genet i alle NSCs (inkludert de i hjernen, som er tilfellet i grobunn-LoxP systemer), kan produsere effekter som ikke er relatert til regenerering som kan forvirre tolkningen av resultatene. Heldigvis, strukturen i Axolotl ryggmargen gir en unik mulighet for tid-og plass-begrenset Knock-Out i NSCs. Mesteparten av ryggmargen NSCs er i kontakt med sentralkanalen og utgjør det store flertallet av cellene i kontakt med sentralkanalen16,17. Derfor, en injeksjon av CAS9-gRNA kompleks i sentralkanalen, etterfulgt av electroporation, tillater levering til ryggmargen NSCs i en ønsket region på et bestemt tidspunkt4,18,19. Denne protokollen demonstrerer hvordan dette er utført, noe som fører til svært gjennomtrengende Knock-Out i den målrettede ryggmargen NSCs. påfølgende analyse blir deretter utført for å studere virkningene på regenerering og NSC oppførsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk må utføres i samsvar med lokale og nasjonale forskrifter om dyr eksperimentering og med godkjennelse av relevante institusjonelle gjennomgang bord.
1. klargjøre CAS9-gRNA RNP-miksen
- Design og syntetisere gRNAs.
Merk: se andre publikasjoner for å designe og syntetisere gRNAs, inkludert en utelukkende om axolotler15,20,21,22. - Skaff deg CAS9-NLS-protein ved å forberede internt eller kjøpe det kommersielt.
- Forbered CAS9-gRNA Mix ved å blande 5 μg av CAS9-NLS-protein, 4 mikrogram gRNA, 0,9 μL av 10x CAS9 buffer, og fyllvolumet til 10 μL med nuklease-fri H2O. alikvot blandingen og oppbevar ved-80 ° c hvis den ikke brukes umiddelbart.
2. klargjøre agarose plater for electroporation
- Klargjør 200 mL 2% (WT/Vol) agarose oppløsning i 1x DPBS. Oppløses ved å varme løsningen i en mikrobølgeovn og hell den på 10 cm Petri retter til en dybde på ca 10 mm (dyp nok til å dekke hele dyret).
- La platene stivne i romtemperatur. Lagre platene ved 4 ° c hvis de ikke brukes umiddelbart.
- Ved hjelp av kirurgiske skalpeller, kutt agarose platen for å lage en spalte for å holde halen rett, en brønn for montering i kroppen av dyret, og to ekstra brønner for å plassere elektrodene (figur 1E).
- Plasser platen på isen og fyll den opp til randen med iskald 1x DPBS. Bruk samme DPBS-løsning for å lage platene for å sikre konsistent elektrisk conductibility i oppsettet.
3. konfigurering av electroporator
- Konfigurer electroporator. Sett opp poring pulsen til å bestå av en bipolar puls på 70 V, med en varighet på 5 MS, intervall på 50 MS, og ingen spennings forfall. Sett opp overføringen pulsen til å ha fire bipolar pulser på 40 V, med en varighet på 50 MS, intervall på 999 MS, og 10% spennings forfall.
- Koble elektrodene til electroporator og Juster pinsett til 7 mm fra hverandre. Senk elektrodene i et beger med DPBS før og mellom electroporation.
4. klargjøre og laste microinjection glass blodkar
- Utfør en rampe test på en flammende/brun micropipette avtrekker i henhold til produsentens anvisninger for å bestemme varme verdien.
- Trekk sprøyte kar med koniske ender med følgende parametre: Heat = rampe test verdi, pull = 100, Velocity = 100, time = 100.
- Observer nålen under en stereomikroskopet. Ved hjelp av fine tang, bryte kapillær i en vinkel slik at den har en skråstilt tupp. Break i en posisjon hvor den er tynn nok til å målrette den sentrale kanalen, samtidig som sterk nok til å Pierce huden.
Merk: punktet hvor diameteren er på ca 20 μm eller ca 50% av diameteren på ryggmargen er et godt utgangspunkt. Flere prøver kan være nødvendig for å oppnå optimal bryte. - Legg til fast Green FCF-løsning i RNP-blandingen i forholdet 1:30 og Last inn ca. 5 μL injeksjon i kapillær med en Microloader pipette spissen.
- Monter kapillær på den pneumatiske pumpen, med den skjeve spissen vendt nedover.
5. konfigurering av pneumatisk pumpe
- Konfigurer den pneumatiske pumpen. Sett hold til 0,5 pounds per kvadrattomme (PSI), kaste ut til 2 PSI hold, og varighet til gated.
- Test kapillær og pneumatiske pumpe innstillinger ved å dyppe kapillær i en dråpe vann og trykke på fotpedalen for å injisere. Sørg for at injeksjons blandingen kommer ut i en langsom, men jevn strøm.
- Juster Hold trykket hvis injeksjons miksen begynner å lekke spontant eller vann suges opp kapillær. Øke utstøting trykk eller bryte mer av kapillær hvis injeksjon Mix kommer ut for tregt. Reduser utløsings trykket hvis injeksjonen kommer ut for fort.
6. injisere RNP bland inn i ryggmargen
- Bedøve axolotler i 0,03% benzocaine løsning i minst 10 min. Kontroller at dyrene ikke er responsive ved å bla dem opp ned i vannet.
- Plukk opp et dyr med ring tang og legge den på en seng av silisium, med venstre side av dyret vendt opp og halen peker mot høyre. Plasser injeksjonsstedet midt i synsfeltet til stereomikroskopet (figur 1A).
- Juster micromanipulator slik at kapillær kommer inn på 60 ° fra høyre side av synsfeltet (figur 1B).
- Identifiser ryggmargen og sentralkanalen (figur 1C).
Merk: ryggmargen er den rørformede strukturen over notochord. - Sikter på den sentrale kanalen, flytte kapillær fremover for å forsiktig Pierce huden og muskelen i den sentrale kanalen i ryggmargen. Begrens bevegelsen av kapillær til små skritt, som ryggmargen er rett under halen musklene.
- Trykk og hold nede fotpedalen for å injisere blandingen i sentralkanalen. Observer om RNP blandingen sprer seg langs den sentrale kanalen som en blå linje i begge retninger, som viser at kapillær er riktig posisjonert (figur 1D).
- Hvis dette ikke skjer, holder du fotpedalen nede mens du flytter kapillær litt inn og ut til RNP-miksen begynner å gå inn. Hvis kapillær blir tilstoppet av vev, klart det ved å mate ut i vann ved høyere trykk.
- Juster utstøting trykket slik at det er akkurat nok til å føre til at RNP Mix å spre seg i den sentrale kanalen, men ikke så mye at det blåser opp strukturen.
- Fortsett å holde nede fotpedalen slik at injeksjons blandingen sprer seg videre langs den sentrale kanalen, inntil den når terminalen vesicle på slutten av ryggmargen og ventriklene i hjernen.
Merk: Dette kan ta opptil 2 min avhengig av størrelsen på dyret. Det kan være nødvendig å øke trykket etter en tid å føre til at RNP Mix å gå inn i hjernen ventriklene. - Fortsett så snart som mulig for å electroporation etter vellykket injeksjon.
7. electroporation
- Overfør dyret med ring tang på den preparerte agarose electroporation platen (figur 1E) på is. Plasser halen inne i splitten slik at den er klemt av agarose (figur 1F).
- Plasser elektrodene i brønnene på begge sider av halen. Sørg for at hele dyret og elektrodene er dekket av iskald PBS.
- Trykk på fotbryteren for å starte electroporation.
- Når electroporation er ferdig, returner dyret til vannet.
- Fortsett å injisere flere dyr om nødvendig.
- Sjekk at electroporated dyrene er friske etter anestesi slites av og at det er ingen skade gjort til halen.
8. vurdering av Knock-Out effektivitet
- Fest halen på electroporated dyret. Lag tverrsnitt av halen etterfulgt av immunhistokjemiske flekker å vurdere effektiviteten av Knock-Out på protein nivå.
Merk: Hvis en hale amputasjon skal utføres etter electroporation, kan avskåret halen brukes til dette formålet. Dyr electroporated med gRNAs mot Gfp eller Tyrosinase, for eksempel, kan brukes som en negativ kontroll4. - Alternativt kan electroporated ryggmargen trekkes ut og lysert for DNA. Utfør genotyperingteknologi PCR etterfulgt av sanger sekvensering eller neste generasjons sekvensering for å vurdere prosentandelen av redigerte genetiske Loci15.
Merk: den resulterende redigering effektivitet vil undervurdere den faktiske redigering effektivitet for NSCs, på grunn av inkludering av ikke-electroporated celler og neurons som mangler apikale kontakt til den sentrale lumen og dermed vil ikke motta RNP mix.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Injeksjon og electroporation av CAS9-gRNA kompleks mot Sox2 inn i Axolotl ryggmargen Central Canal førte til et massivt tap av Sox2 immunoreactivity i et flertall av ryggmargen NSCs, med GRNA mot Tyrosinase (Tyr) som en kontroll (figur 2 A). B3-tubulin (BEISET med TUJ1) er en markør for neurons og ble ikke uttrykt i NSCs, og SOX2-TUJ1-celler rundt sentralkanalen ble ansett å være celler harboring SOX2 slettinger. Kvantifisering viste Sox2 Knock-Out i et betydelig antall NSCS av CAS9-Sox2-gRNA electroporation (figur 2B), som indikerer at denne metoden førte til effektiv og svært gjennomtrengende genet Knock-Out i ryggmargen NSCs.
Etter samtidig injeksjon og electroporation, blandingen av to CAS9-gRNA komplekser mot Sox2 og Gfp, henholdsvis i transgene axolotler med allestedsnærværende Gfp uttrykk (CAGGS-Gfp), en høy andel av dobbelt Knock-Out NSCs ble observert (figur 2C, D), som indikerer at protokollen kan brukes til å fleksibelt slå ut flere gener.
Figur 1 : Axolotl og electroporation. (A) skjematisk viser INJEKSJON av CAS9-gRNA RNP inn Axolotl ryggmargen sentralkanalen. (B) Micromanipulator satt opp for injeksjon. (C) utsikt gjennom en stereomikroskopet av Axolotl halen, med ryggmargen indikert. (D) se gjennom en stereomikroskopet av Axolotl halen med en injisert ryggmargen. (E) skjematisk av electroporation plate. (F) skjematisk av dyret og elektrodene plassert inne i electroporation plate, klar for electroporation. Vektstenger = 1 mm. Dette tallet er tilpasset fra Albors og Tanaka18. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Representative bank-out-resultater i Axolotl ryggmarg NSCs. (A) ryggmarg injeksjon og ELECTROPORATION av CAS9-Sox2-gRNA (n = 21) FØRTE til tap av Sox2 i de fleste av NSCs på 15 dager etter electroporation (dpE) ved immunhistokjemiske farging. CAS9-Tyr-gRNA (n = 21) fungerte som en negativ kontroll. Skala stolper = 100 μm. (B) kvantifisering viste signifikant reduksjon i SOX2 + NSCs (p < 0,001 av student t-test), telling SOX2-TUJ1-celler rundt sentralkanalen som NSCs harboring en SOX2 sletting. Feil stolper = SD. (C) samtidig injeksjon og electroporation av Sox2-gRNA og GFP-gRNA koplet til CAS9 (n = 6) FØRTE til tap av Sox2 og Gfp i de fleste av NSCs ved immunhistokjemiske farging. CAS9-Tyr-gRNA (n = 6) fungerer som negativ kontroll. Skala stolper = 100 μm. (D) kvantifisering viste at blant alle målrettede NSCs har noen sletting, et flertall (94%) næret dobbel sletting (GFP − SOX2 −), med bare en liten andel (6%) å ha en enkelt sletting (GFP + SOX-eller GFP-SOX2 +). Dette tallet er tilpasset fra fei et al.4. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den beskrevne protokollen gir tid og plass begrenset gen Knock-Out i NSCs i Axolotl ryggmargen. Den gjeldende protokollen tillater spesifikk målretting av NSCs på en definert tid og sted med høy penetrans. Det unngår potensielle uønskede effekter som stammer fra Gen Knock-Out i NSCs i andre regioner som hjernen som oppstår ved bruk av grobunn-LoxP system. Det unngår også utviklingsmessige effekter som stammer fra en vedvarende knock-out, slik at studiet av genet funksjon fokusert på regenerering. I tillegg kan denne protokollen utføres i vill-type dyr, unngå den lange ventetiden som trengs for å generere ytterligere transgene axolotler, som er nødvendig for det grobunn-LoxP systemet. Det tilbyr også allsidigheten til å banke ut flere gener samtidig og er svært gjennomtrengende, slik at eksperimenter skal utføres på F0 dyr. Viktigere, er prosedyren vist å ha noen synlig effekt på halen og ryggmargen regenerering4.
Bruken av CAS9 protein-gRNA RNP komplekser viser også mye høyere effektivitet enn systemer som bruker CAS9 og gRNA-uttrykker plasmider4. Dette skyldes sannsynligvis mindre størrelsen på RNP-komplekset sammenlignet med plasmider, i tillegg til differensial Codon bruk som påvirker uttrykk for det CAS9 proteinet fra plasmider avledet fra pattedyr systemer. I tillegg, siden CAS9 protein-gRNA RNP komplekser kan indusere pauser umiddelbart, skjer Knock-Out raskt. 60%-70% av modifiserte genomisk Loci er observert ved genotyperingteknologi PCR innen 24 h av electroporation (data ikke vist). Det er også en mulighet til å utføre knock-ins ved hjelp av denne strategien ved å co-electroporating en reparasjon mal. En rekke knock-in strategier er tilgjengelige, detaljene og betraktninger som er utenfor omfanget for denne publikasjonen, men de er beskrevet i detalj i en annen publikasjon15.
På den annen side, denne protokollen har noen begrensninger. Farging eller genotyperingteknologi PCR er vanligvis nødvendig for å vurdere omfanget av Knock-Out i hvert forsøksdyr, som kan være arbeidskrevende. Mens genet Knock-Out fra denne metoden er i stor grad begrenset til NSCs rundt den sentrale kanalen, kan det ikke utelukkes at andre celletyper kan også være målrettet, fordi 1) de er også i kontakt med den sentrale kanalen, eller 2) RNP Mix har lekket ut av sentral Etterat kanalen før electroporation. Disse faktorene bør vurderes når tolke resultatene.
gRNA design
Med det i den seneste tid offentliggjort Axolotl Genova og transcriptome, identifisering Axolotl gener og deres sekvenser har bli mange lettere9,10,11,12,13. Detaljert guide inne beregnende gRNAs er blitt beskrevet et annet sted, inkluderer ettall det avtaler ene og alene med axolotler15. Det anbefales å designe og teste minst tre gRNAs for redigering effektivitet på forhånd og for å velge den optimale design for selve eksperimentet. Effektiviteten av gRNA kan testes ved å injisere CAS9-gRNA blanding i fersk lagt Axolotl egg på en celle scenen23. Redigering effektivitet kan deretter vurderes ved å genotyperingteknologi de klekket larver.
Sprøyte vurderinger
Siden injeksjonsstedet i ryggmargen lider av fysisk skade forårsaket av nålen og spredning av RNP Mix til vev utenfor sentralkanalen, er det viktig å utføre injeksjon i posisjoner vekk fra regionen av interesse å bli analysert. For eksempel, hvis en hale amputasjon er utført etter electroporation å studere virkningene av et målrettet gen i ryggmargen regenerering, er det nødvendig å utføre injeksjon der området vil bli fjernet av amputasjon.
Gå inn i sentralkanalen med en sprøyte kapillær er det mest kritiske trinnet i denne protokollen, og nye brukere rådes til å øve før selve eksperimentet. Injeksjon er best utført på mindre dyr (mindre enn 2,5 cm lang) på bakre enden av ryggmargen, der det er enklest å posisjonere kapillær spissen inn i sentralkanalen. Det anbefales å observere den første spredningen av den blå-fargede RNP bland tett. Det er mulighet for at RNP Mix kan injiseres i meningeal plass rundt ryggmargen. En skarp og rask spredning som en linje langs midten av ryggmargen indikerer vellykket injeksjon i sentralkanalen18. Hvis ingenting kommer ut eller spredningen stopper for tidlig, anbefales det å holde fotpedalen trykket mens du flytter kapillær litt inn og ut. Hvis dette mislykkes, kan det være nødvendig å re-posisjon kapillær eller se etter en tett åpning. For RNP blandingen til å spre seg inn i hjernen ventriklene, er det ofte nødvendig å øke utstøting press mot slutten. Å ha hjernen ventriklene fylt opp er ikke nødvendig for electroporation av ryggmargen, men det er den beste indikasjon på at RNP Mix har blitt injisert i sentralkanalen.
Electroporation betraktninger
Det anbefales å optimalisere electroporation parametere på forhånd for å oppnå tilstrekkelig levering av RNP til et flertall av NSCs uten å forårsake omfattende skade på andre vev eller drepe dyret. Denne protokollen er optimalisert for dyr 2,0-2,5 cm lang i størrelse18. En reduksjon i overføring puls spenning til 35 V er sannsynligvis nødvendig når du arbeider med dyr mindre enn dette. På den andre side, større dyrene ville forlange høyere Voltage og/eller flere impuls. I tillegg påvirker avstanden mellom elektrodene effektiviteten. En reduksjon av avstanden til 6 mm kan være nødvendig for større dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker Prof Elly M. Tanaka for hennes kontinuerlige og langsiktige støtte. Dette arbeidet ble støttet av en National Natural Science Foundation i Kina (NSFC) Grant (317716), forskning starter Grants fra Sør-Kina normal University (S82111 og 8S0109), og en Kina postdoktor Science Foundation Grant (2018M633067).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Benzocaine | Sigma-Aldrich | E1501-100G | |
| Benzocaine 0.03 % (wt/vol) | Mix 500 ml of 10× TBS, 500 ml of 400% (wt/vol) Holtfreter’s solution and 30 ml of 10% (wt/vol) benzocaine stock solution. Fill up the volume to 10 L with dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| Benzocaine 10 % (wt/vol) | Mix 50 g of benzocaine in 500 ml of 100% (vol/vol) ethanol. The solution can be stored at room temperature for up to 12 months. | ||
| Borosilicate glass capillaries 1.2 mm O.D., 0.94 mm I.D. | Stutter Instrument | BF120-94-8 | |
| CaCl2·2H2O | Merck | 102382 | |
| CAS9 buffer, 10x | Mix 200 mM HEPES and 1.5 M KCl in RNase-free water. Adjust pH to 7.5. Filter sterilize, aliquot and store at −20 °C for up to 24 months | ||
| CAS9-NLS protein | PNA Bio | CP03 | |
| Cell culture dishes, 10cm | Falcon | 351029 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Scientific Instruments | 11254-20 | |
| Electroporator | Nepa Gene | NEPA21 | |
| BEX | Pulse Generator CUY21EDIT II | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Fast Green FCF Solution, 5x | Dissolve 12.5 mg of Fast Green FCF powder in 10 mL of 1× PBS. | ||
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Stutter Instrument | P-97 | |
| Holtfreter’s solution 400% (wt/vol) | Dissolve 11.125 g of MgSO4·7H2O, 5.36 g of CaCl2·2H2O, 158.4 g of NaCl and 2.875 g of KCl in 10 L of dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| KCl | Merck | 104936 | |
| MgSO4·7H2O | Merck | 105886 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| NaCl | Merck | 106404 | |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV830 | |
| Ring Forceps | Fine Scientific Instruments | 11103-09 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX10 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Tris-buffered saline, 10x | Dissolve 24.2 g of Tris base and 90 g of NaCl in 990 ml of dH2O. Adjust pH to 8.0 by adding 10 ml of 37% (vol/vol) HCl. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| Tweezers w/Variable Gap 2 Round Platinum Plate Electrode, 10mm diameter | Nepa Gene | CUY650P10 |
References
- O'Hara, C. M., Egar, M. W., Chernoff, E. A. G. Reorganization of the ependyma during axolotl spinal cord regeneration: Changes in intermediate filament and fibronectin expression. Developmental Dynamics. 193 (2), 103-115 (1992).
- Mchedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. Reconstitution of the Central Nervous System During Salamander Tail Regeneration from the Implanted Neurospheres. Plant, Soil and Environment. 916 (8), 197-202 (2012).
- Nordlander, R. H., Singer, M. The role of ependyma in regeneration of the spinal cord in the urodele amphibian tail. Journal of Comparative Neurology. 180 (2), 349-373 (1978).
- Fei, J. F., et al. Tissue- and time-directed electroporation of CAS9 protein–gRNA complexes in vivo yields efficient multigene knock-out for studying gene function in regeneration. npj Regenerative Medicine. 1 (1), 16002 (2016).
- Fei, J. F., et al. CRISPR-mediated genomic deletion of Sox2 in the axolotl shows a requirement in spinal cord neural stem cell amplification during tail regeneration. Stem Cell Reports. 3 (3), 444-459 (2014).
- Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease. Development. 141 (10), Cambridge, England. 2165-2171 (2014).
- Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration. eLife. 6, (2017).
- Fei, J. -F., et al. Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 201706855. , (2017).
- Nowoshilow, S., et al. The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators. Nature. 554 (7690), 50-55 (2018).
- Bryant, D. M., et al. A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors. Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).
- Smith, J. J., et al. A chromosome-scale assembly of the axolotl genome. Genome Research. 373548, (2019).
- Smith, J. J., et al. Sal-Site: Integrating new and existing ambystomatid salamander research and informational resources. BMC Genomics. 6, 1-6 (2005).
- Campbell, L. J., et al. et al Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration. Developmental Dynamics. 240 (7), 1826-1840 (2011).
- Stewart, R., et al. Comparative RNA-seq Analysis in the Unsequenced Axolotl: The Oncogene Burst Highlights Early Gene Expression in. the Blastema. PLoS Computational Biology. 9 (3), (2013).
- Fei, J. -F., et al. Application and optimization of CRISPR–Cas9-mediated genome engineering in axolotl (Ambystoma mexicanum). Nature Protocols. 13 (12), 2908-2943 (2018).
- Holder, N., et al. Continuous growth of the motor system in the axolotl. Journal of Comparative Neurology. 303 (4), 534-550 (1991).
- Tazaki, A., Tanaka, E. M., Fei, J. F. Salamander spinal cord regeneration: The ultimate positive control in vertebrate spinal cord regeneration. Developmental Biology. 432 (1), 63-71 (2017).
- Albors, A. R., Tanaka, E. M. High-Efficiency Electroporation of the Spinal Cord in Larval Axolotl. Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. 1290, 115-125 (2015).
- Albors, A. R., et al. et al Planar cell polarity-mediated induction of neural stem cell expansion during axolotl spinal cord regeneration. eLife. 4, 1-29 (2015).
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Graham, D. B., Root, D. E. Resources for the design of CRISPR gene editing experiments. Genome Biology. 16 (1), 260 (2015).
- Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).
