Purificação de preparações de vesículas extracelulares de alto rendimento longe do vírus

Resumo

Este protocolo isola vesículas extracelulares (EVs) longe de virions com alta eficiência e rendimento através da incorporação de precipitação EV, ultracentlee gradiente de densidade, e captura de partículas para permitir um fluxo de trabalho simplificado e uma redução de partida requisitos de volume, resultando em preparações reprodutíveis para uso em todas as pesquisas EV.

Resumo

Um dos obstáculos principais no campo da pesquisa extracelular do vesícula (EV) é hoje a habilidade de conseguir preparações purified do EV em um ajuste viral da infecção. O método apresentado destina-se a isolar EVs longe de virions (ou seja, HIV-1), permitindo uma maior eficiência e rendimento em comparação com os métodos convencionais de ultracentilugação. Nosso protocolo contém três etapas: precipitação de EV, separação de gradiente de densidade e captura de partículas. Os ensaios a jusante (i.e., Western blot e PCR) podem ser executados diretamente após a captura de partículas. Este método é vantajoso sobre outros métodos do isolamento (isto é, ultracentlee) porque permite o uso de volumes começando mínimos. Além disso, é mais amigável do que métodos alternativos do isolamento de EV que exigem etapas múltiplas do ultracentlee. Entretanto, o método apresentado é limitado em seu espaço de ensaios funcionais do EV porque é difícil eluir EVS intactos de nossas partículas. Além disso, este método é adaptado para um ajuste estritamente baseado em pesquisa e não seria comercialmente viável.

Introdução

Pesquisa centrada em torno de vesículas extracelulares (EVs), especificamente exosomas, um tipo de EV variando 30-120 nm e caracterizada pela presença de três marcadores de tetraspanina CD81, CD9 e CD63, tem sido largamente moldado pelo desenvolvimento de métodos para isolar e purificar as vesículas de interesse. A capacidade de dissecar mecanismos multifacetados tem sido dificultada devido a técnicas complexas e demoradas que geram amostras compostas por uma população heterogênea de vesículas geradas através de diferentes vias com uma ampla gama de conteúdos, tamanhos e Densidades. Embora esta seja uma questão para quase todas as pesquisas EV, é de particular importâ....

Protocolo

1. filtração e precipitação de vesículas extracelulares (EVs)

1. Para preparar o sobrenadante de cultura de células infectadas ou transfectadas (i.e., linhas celulares e/ou células primárias), cultura aproximadamente 10 mL de células de log tardio por 5 dias a 37 ° c e 5% CO₂ em meio de cultura apropriado (i.e., RPMI ou DMEM com 10% de bovinos fetais soro [FBS]).
   Nota: Todos os reagentes do meio de cultura devem estar livres de EVs, podendo ser comprados (ver tabela de materiais) ou preparados em casa por pré-ultracentlee de soro a 100.000 x g por 90 min. Este protocolo foi bem-sucedido para várias linhas....

Resultados

Precipitação de PEG aumenta o rendimento de EV
Nossa abordagem de combinação para o isolamento de EV é significativamente mais eficiente em termos de recuperação de EV em comparação com a ultracentlee tradicional, como evidente pela redução de 90% no volume de material de partida necessário. Ultracentlee, o padrão ouro atual no isolamento EV, requer aproximadamente 100 mL de sobrenadante de cultura para produzir uma preparação adequada de EV para ensaios a jusante, enq.......

Discussão

O método esboçado permite o rendimento aumentado de EV e a separação de vírus de EVs usando uma aproximação da combinação ao isolamento. Quantidades relativamente grandes de material de partida (ou seja, sobrenadante celular) podem ser filtradas antes do isolamento de EV por precipitação, separação de DG e enriquecimento de nanopartículas, resultando em um volume final de ~ 30 μL, permitindo o uso imediato em uma variedade de ensaios a jusante. O uso do enriquecimento de nanopartículas é essencial, uma vez que, em compar.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
CEM CD4+ Cells	NIH AIDS Reagent Program	117	CEM
DPBS sem Ca e Mg (1x)	Quality Biological	114-057-101
ExoMAX Opti-Enhancer	Systems Biosciences	EXOMAX24A-1	PEG reagente de precipitação
FBS Depletado de Exossomo Thermo	Fisher Scientific	A2720801
Fetal Bovine Serum	Pico de Soro	PS-FB3
Soro HIV-1 infectado com células U937	de reagentes da AIDS NIH	165	U1
Filtro de Seringa Nalgene 0.2 µ m SFCA	Thermo Scientific	723-2520
Nanotrap (NT80)	Ceres Nanosciences	CN1030	Reactive Red 120 core
Nanotrap (NT82)	Ceres Nanosciences	CN2010	Cibacron Blue F3GA core
Optima XE-980 Ultracentrifuge	Beckman Coulter	A94471
OptiPrep Gradiente de Densidade Médio	Sigma-Aldrich	D1556-250mL	Rotor
de caçamba oscilante de	Ti Beckman Coulter	331362
tubo ultratransparente, 14 mm x 89 mm	Beckman Coulter	344059

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