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Summary

Este protocolo isola vesículas extracelulares (EVs) longe de virions com alta eficiência e rendimento através da incorporação de precipitação EV, ultracentlee gradiente de densidade, e captura de partículas para permitir um fluxo de trabalho simplificado e uma redução de partida requisitos de volume, resultando em preparações reprodutíveis para uso em todas as pesquisas EV.

Abstract

Um dos obstáculos principais no campo da pesquisa extracelular do vesícula (EV) é hoje a habilidade de conseguir preparações purified do EV em um ajuste viral da infecção. O método apresentado destina-se a isolar EVs longe de virions (ou seja, HIV-1), permitindo uma maior eficiência e rendimento em comparação com os métodos convencionais de ultracentilugação. Nosso protocolo contém três etapas: precipitação de EV, separação de gradiente de densidade e captura de partículas. Os ensaios a jusante (i.e., Western blot e PCR) podem ser executados diretamente após a captura de partículas. Este método é vantajoso sobre outros métodos do isolamento (isto é, ultracentlee) porque permite o uso de volumes começando mínimos. Além disso, é mais amigável do que métodos alternativos do isolamento de EV que exigem etapas múltiplas do ultracentlee. Entretanto, o método apresentado é limitado em seu espaço de ensaios funcionais do EV porque é difícil eluir EVS intactos de nossas partículas. Além disso, este método é adaptado para um ajuste estritamente baseado em pesquisa e não seria comercialmente viável.

Introduction

Pesquisa centrada em torno de vesículas extracelulares (EVs), especificamente exosomas, um tipo de EV variando 30-120 nm e caracterizada pela presença de três marcadores de tetraspanina CD81, CD9 e CD63, tem sido largamente moldado pelo desenvolvimento de métodos para isolar e purificar as vesículas de interesse. A capacidade de dissecar mecanismos multifacetados tem sido dificultada devido a técnicas complexas e demoradas que geram amostras compostas por uma população heterogênea de vesículas geradas através de diferentes vias com uma ampla gama de conteúdos, tamanhos e Densidades. Embora esta seja uma questão para quase todas as pesquisas EV, é de particular importância ao estudar EVs no contexto da infecção viral, como virions e vírus-como partículas (VLPs) pode ser semelhante em diâmetro para as vesículas de interesse. Por exemplo, o tipo 1 do vírus de imunodeficiência humana (HIV-1) é aproximadamente 100 nanômetro no diâmetro, que é aproximadamente o mesmo tamanho que muitos tipos de EVs. Por esse motivo, projetamos um novo fluxo de trabalho de isolamento de EV para abordar esses problemas.

O padrão ouro atual de isolamento EV é ultracentlee. Esta técnica faz uso das várias densidades da vesícula, o que permite que as vesículas sejam separadas por centrifugação com sedimentação diferencial de partículas de maior densidade versus partículas de menor densidade em cada etapa ^1,2. Várias etapas de centrifugação de baixa velocidade são necessárias para remover células intactas (300-400 x g por 10 min), detritos celulares (~ 2.000 x g por 10 min) e corpos apoptóticos/grandes vesículas (~ 10.000 x g por 10 min). Estas purificações iniciais são seguidas por ultracentlee de alta velocidade (100000-200000 x g para 1.5-2 h) aos EVS do sedimento. As etapas da lavagem são executadas para assegurar mais a pureza do EV, entretanto, isto conduz à redução do número de EVS isolados, assim abaixando o rendimento total ^3,4. O utilitário deste método é ainda mais limitado pela exigência de um grande número de células (aproximadamente 1 x 10⁸) e um grande volume amostral (≫ 100 ml) para alcançar resultados adequados.

Para abordar as crescentes preocupações, a precipitação de vesículas com polímeros hidrofílicos tornou-se uma técnica útil nos últimos anos. O polietileno glicol (PEG), ou outros reagentes relacionados da precipitação, permite que o usuário puxe para baixo as vesículas, os vírus, e os agregados da proteína ou do proteína-RNA dentro de uma amostra simplesmente incubando a amostra com o reagente da escolha, seguido por um único de baixa velocidade centrifugação^1,2,5. Nós temos relatado previamente que o uso do PEG ou de métodos relacionados para precipentar EVs em comparação com os resultados tradicionais do ultracentlee em um rendimento significativamente mais elevado⁶. Esta estratégia é rápida, fácil, não requer equipamentos caros adicionais, é prontamente escalável, e retém a estrutura EV. No entanto, devido à natureza promíscuo deste método, as amostras resultantes contêm uma variedade de produtos, incluindo proteínas livres, complexos proteicos, uma gama de EVs, e virions, assim, exigindo mais purificação para obter a população desejada^{1 ,2,7,8}.

Para superar a heterogeneidade de EVs obtidos de vários métodos da precipitação, o ultracentlee do inclinação da densidade (DG) é utilizado para separar melhor partículas baseadas em sua densidade. Este método é realizado usando um gradiente Stepwise usando um meio de gradiente de densidade, como iodixanol ou sacarose, que permite a separação de EVs de proteínas, complexos proteicos, e vírus ou vírus-como partículas (VLPs). É importante notar que, embora já tenha sido pensado que a DG permitiu a separação mais precisa das subpopulações de EV, sabe-se agora que os tamanhos e densidades de várias vesículas podem se sobrepor. Por exemplo, os exosomas são conhecidos por terem densidades de flotação de 1,08-1,22 g/mL⁹, enquanto as vesículas isoladas do GOLGI (copi⁺ ou clathrin⁺) têm densidades de 1,05-1,12 g/ml e as do retículo endoplasmático (copii⁺ ) sedimento em 1,18-1,25 g/ml^1,2,3,4,9. Adicionalmente, se um deseja comparar frações exosomal de encontro às frações que contêm partículas virais, esta pode tornar-se mais difícil depender em cima da densidade do vírus do interesse-há uns vírus à excepção do HIV-1 que equilibram provável ao mesmo densidades como frações positivas exosomáticas².

Finalmente, o enriquecimento de EV Preps para visualização a jusante e ensaios funcionais é vital para a pesquisa EV. O uso de nanopartículas enriquecedora de EV, especificamente, partículas de hidrogel multifuncionais que variam 700-800 nm de diâmetro, são um passo crítico na obtenção de Preps concentrados de EV. Possuem uma isca aromática da afinidade elevada que encapsulado por um escudo de peneiramento exterior poroso para promover o selectivity. As nanopartículas utilizadas neste estudo incluem duas preparações distintas com diferentes iscas de núcleo (vermelho reactivo 120 NT80; e cibacron Blue F3GA NT82) que demonstraram aumentar a captação de EVS de vários reagentes e biofluídos (ver a tabela de materiais )^{6,10,11,12,13,14,15}. As partículas oferecem o enriquecimento fácil dos EVS dos materiais começando numerosos que incluem frações do iodixanol, sobrenadante da cultura de pilha, assim como biofluídos pacientes tais como o plasma, o soro, os líquidos espinais cerebrais (CSF), e a urina^6,13 .

O método aqui apresentado melhora a eficiência das técnicas atuais de purificação de EV, combinando várias tecnologias; Precipitação EV, ultracentlee gradiente de densidade, e captura de partículas, para agilizar o fluxo de trabalho, reduzir os requisitos da amostra, e aumentar o rendimento para obter uma amostra EV mais homogênea para uso em todas as pesquisas EV. Este método é particularmente útil na investigação de EVs e seu conteúdo durante a infecção viral, pois inclui um passo de filtração de 0,22 μm para excluir vesículas grandes, indesejadas e VLPs e separação da população total de EV com base na densidade para efetivamente isolar EVs de virions.

Protocol

1. filtração e precipitação de vesículas extracelulares (EVs) Para preparar o sobrenadante de cultura de células infectadas ou transfectadas (i.e., linhas celulares e/ou células primárias), cultura aproximadamente 10 mL de células de log tardio por 5 dias a 37 ° c e 5% CO2 em meio de cultura apropriado (i.e., RPMI ou DMEM com 10% de bovinos fetais soro [FBS]).Nota: Todos os reagentes do meio de cultura devem estar livres de EVs, podendo ser comprados (ver tabela de materiais) ou preparados em casa por pré-ultracentlee de soro a 100.000 x g por 90 min. Este protocolo foi bem-sucedido para várias linhas celulares comumente usadas, incluindo: CEM, Jurkat, 293T, U937 (linhas não infectadas), U1, J 1.1, ACH2, HUT102, MT-2 (linhas infectadas pelo HIV-1 e HTLV-1), células múltiplas transfectadas e células mielóides e T primárias (ambas infectados e não infectados); no entanto, esse protocolo pode ser usado para qualquer tipo de célula, incluindo aqueles que exigem mídia especializada ou condições de cultura. Densidade de células pode precisar ser otimizado para diferentes tipos de células. Recomenda-se que a maior densidade seja usada com morte celular mínima após 5 dias. Centrifugue a cultura em 3.000 x g por 5 min às pilhas da pelota e rejeite o pellet. Filtre o sobrenadante de cultura usando um filtro estéril de 0,22 μm e colete o filtrado em um tubo limpo. Adicione o volume igual do reagente da precipitação do PEG (relação 1:1) ao sobrenadante filtrado. Inverta o tubo diversas vezes para assegurar uma mistura homogênea.Nota: Não vortex. Incubar a mistura a 4 ° c durante a noite (O/N). Centrifugue a mistura em 1.500 x g por 30 minutos na temperatura ambiente (RT) para produzir um pellet HETEROGÊNEO de EV.Nota: EV pellet deve aparecer branco ou off-White na cor. Descarte o sobrenadante de cultura empobrecido EV. Ressuscitem o sedimento EV em 150 – 300 μL de soro fisiológico com tampão de fosfato 1x sem cálcio e magnésio (PBS) e mantenha-se no gelo. 2. construção de um gradiente de densidade Misture o meio de gradiente de densidade iodixanol com 1X PBS para criar 11 frações de densidade de 1 mL diferentes de 6 a 18% de iodixanol em incrementos de 1,2% em tubos de microcentrífuga separados, como mostrado na Figura 1a. Vórtice cada tubo para misturar. Frações da densidade da camada em um tubo de balanço pre-limpado e seco da cubeta do ultracentlee que começa com fração #18 e terminando com a fração #6 como indicado na Figura 1b.Nota: Todos os tubos devem ser higienizados utilizando um spray de alvejante a 10% seguido de enxaguar 3x com água desionizada e uma lavagem final de água desionizada estéril antes do carregamento das frações de gradiente. Adicione a pelota ressuscitada do EV (300 μL) à parte superior do inclinação mergulhado no tubo do ultracentlee. Ultracentlee em 100, 00 x g em 4 ° c para 90 min. Retire cuidadosamente as frações de 1 mL do tubo ultracentlee e transfira cada fração para novos tubos de microcentrífuga. 3. enriquecimento das frações EV uusando nanopartículas Crie uma pasta de nanopartículas de 30% usando volumes iguais de NT80, NT82 e 1X PBS.Nota: A mistura deve ser vórtice antes de usar para garantir a homogeneidade. Adicionar 30 μL da pasta a cada tubo de microcentrífuga contendo as frações de densidade e pipetar/invertê-los várias vezes para misturar. Gire os tubos de microcentrífuga de fração de densidade contendo nanopartículas EV enriquecedora O/N a 4 ° c a aproximadamente 20 rpm. Centrífuga tubos de microcentrífuga de fração de densidade em 20.000 x g por 5 min em RT. Descarte o líquido e lave o pellet EV duas vezes com 1X PBS.Nota: As pelotas da nanopartícula podem ser congeladas em-20 ° c ou ser usadas imediatamente para vários ensaios a jusante (isto é, PCR, borrão ocidental, espectrometria maciça, e outros ensaios). 4. preparação recomendada da pelota da nanopartícula para ensaios a jusante Para isolamento de RNA Ressuscitou o pellet em 50 μL de água desionizada autoclavada tratada com 0, 1% de pirocarbonato de dietilo (DEPC) filtrado através de um filtro de 0,2 μm e isole o RNA de acordo com o protocolo do fabricante do kit. Para eletroforese em gel Suspender o pellet diretamente em 15 μL de tampão de Laemmli. Amostra de calor 3x a 95 ° c por 3 min. Vortex suavemente e gire para baixo entre cada ciclo de calor. Centrifugue a amostra para 15 s em 20.000 x g e carregue todo o material eluída diretamente no gel.Nota: para melhores resultados, limitar a quantidade de partículas carregadas sobre o gel e executar o gel em 100 V para garantir que todas as partículas restantes estão contidos para os poços. Para a digestão de tripsina Ressuscitação da pelota em 20 μL de ureia antes da alquilação e tripsinização da amostra. As nanopartículas podem ser peletizadas por uma centrifugação de 14.000 x g em RT por 10 min. a amostra contendo o peptídeo tripsinizadas pode ser transferida para um tubo de coleta limpo.

Representative Results

Precipitação de PEG aumenta o rendimento de EVNossa abordagem de combinação para o isolamento de EV é significativamente mais eficiente em termos de recuperação de EV em comparação com a ultracentlee tradicional, como evidente pela redução de 90% no volume de material de partida necessário. Ultracentlee, o padrão ouro atual no isolamento EV, requer aproximadamente 100 mL de sobrenadante de cultura para produzir uma preparação adequada de EV para ensaios…

Discussion

O método esboçado permite o rendimento aumentado de EV e a separação de vírus de EVs usando uma aproximação da combinação ao isolamento. Quantidades relativamente grandes de material de partida (ou seja, sobrenadante celular) podem ser filtradas antes do isolamento de EV por precipitação, separação de DG e enriquecimento de nanopartículas, resultando em um volume final de ~ 30 μL, permitindo o uso imediato em uma variedade de ensaios a jusante. O uso do enriquecimento de nanopartículas é essencial, uma v…

Materials

CEM CD4<sup>+</sup> Cells	NIH AIDS Reagent Program	117	CEM
DPBS without Ca and Mg (1x)	Quality Biological	114-057-101
ExoMAX Opti-Enhancer	Systems Biosciences	EXOMAX24A-1	PEG precipitation reagent
Exosome-Depleted FBS	Thermo Fisher Scientific	A2720801
Fetal Bovine Serum	Peak Serum	PS-FB3	Serum
HIV-1 infected U937 Cells	NIH AIDS Reagent Program	165	U1
Nalgene Syringe Filter 0.2 &micro;m SFCA	Thermo Scientific	723-2520
Nanotrap (NT80)	Ceres Nanosciences	CN1030	Reactive Red 120 core
Nanotrap (NT82)	Ceres Nanosciences	CN2010	Cibacron Blue F3GA core
Optima XE-980 Ultracentrifuge	Beckman Coulter	A94471
OptiPrep Density Gradient Medium	Sigma-Aldrich	D1556-250mL	Iodixanol
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor	Beckman Coulter	331362
Ultra-Clear Tube, 14 mm x 89 mm	Beckman Coulter	344059