Detecção de fusão gênica oncogênica usando a reação em cadeia de polimerase multiplex ancorada seguida por sequenciamento da próxima geração

Resumo

Este artigo detalha o uso de um kit de preparação de biblioteca com base em reação em cadeia do polymerase multiplex seguido de sequenciamento de próxima geração para avaliar as fusões de genes oncogênicos em amostras de tumores sólidos clínicos. As etapas de análise de dados e de bancada úmida são descritas.

Resumo

As fusões do gene contribuem freqüentemente ao phenotype oncogênico de muitos tipos diferentes de cancro. Adicionalmente, a presença de certas fusões em amostras de pacientes oncológicos muitas vezes influencia diretamente o diagnóstico, o prognóstico e/ou a seleção da terapia. Em conseqüência, a deteção exata de fusões do gene transformou-se um componente crítico da gerência clínica para muitos tipos da doença. Até recentemente, a deteção clínica da fusão do gene foi realizada predominante com o uso de ensaios do único-gene. No entanto, a lista cada vez maior de fusões de genes com significância clínica criou uma necessidade de avaliar o status de fusão de múltiplos gene simultaneamente. Os testes baseados em sequenciamento da próxima geração (NGS) atenderam a essa demanda através da capacidade de sequenciar o ácido nucleico de forma massivamente paralela. Várias abordagens baseadas em NGS que empregam diferentes estratégias para o enriquecimento de alvos de genes estão agora disponíveis para uso em diagnósticos moleculares clínicos, cada um com seus próprios pontos fortes e fracos. Este artigo descreve o uso do enriquecimento do alvo do multiplex da PCR (ampère)-baseado ancorado e da preparação da biblioteca seguidos por NGS para avaliar para fusões do gene em espécimes contínuos clínicos do tumor. O AMP é único entre abordagens de enriquecimento baseadas em amplicon, pois identifica fusões genéticas, independentemente da identidade do parceiro de fusão. Detalhado aqui estão as etapas da análise do molhado-banco e de dados que asseguram a deteção exata da fusão de gene das amostras clínicas.

Introdução

A fusão de dois ou mais genes em uma única entidade transcricional pode ocorrer como o resultado de variações cromossomáticas da grande escala que incluem deleções, duplicações, inserções, Inversions, e translocations. Por meio do controle transcricional alterado e/ou das propriedades funcionais alteradas do produto genético expresso, esses genes de fusão podem conferir propriedades oncogênicas a células cancerosas¹. Em muitos casos, os genes da fusão são sabidos para actuar como excitadores oncogênico preliminares ativando diretamente a proliferação celular e as vias de sobrevivência.

A relevância clínica de fusões do gene para pacientes de cancro tornou-se primeiramente aparente com a descoberta do cromossoma de Philadelphfia e do gene correspondente da fusão BCR-ABL1 na leucemia Myelogenous crônica (CML)². O mesylate pequeno do imatinib do inibidor da molécula foi desenvolvido para alvejar especificamente este gene da fusão e demonstrou a eficácia notável em pacientes BCR-ABL1-positivos de CML³. A segmentação terapêutica de fusões genéticas oncogênicas também tem sido bem-sucedida em tumores sólidos, com inibição de genes de fusão ALK e ROS1 em câncer de pulmão de células não pequenas servindo como exemplos primários^4,5. Recentemente, o inibidor de NTRK larotrectinib foi aprovado pela FDA para tumores sólidos NTRK1/2/3 Fusion-positive, independentemente do local da doença⁶. Além da seleção da terapia, a deteção da fusão de gene igualmente tem papéis no diagnóstico e no prognóstico da doença. Isto é particularmente prevalente em vários sarcoma e subtipos de malignidade hematológica que são diagnosticticamente definidos pela presença de fusões específicas e/ou para que a presença de uma fusão informa diretamente o prognóstico^{7,8 , 9} anos de ^{, 10} de ^{, 11}. These são mas alguns dos exemplos da aplicação clínica da deteção da fusão genética para pacientes de cancro.

Devido ao papel crítico na tomada de decisão clínica, a deteção exata da fusão de gene das amostras clínicas é da importância vital. As técnicas numerosas foram aplicadas em laboratórios clínicos para a fusão ou a análise cromossomática do rearranjo que incluem: Técnicas citogénicas, reacção em cadeia reversa da polimerase da transcrição (RT-PCR), hibridação in situ da fluorescência (peixes), imunohistoquímica (IHC) e análise de desequilíbrio de expressão 5 '/3 ' (entre outros)^12,13,14,15. Presentemente, a lista ràpida de expansão de fusões de gene acionáveis no cancro conduziu à necessidade de avaliar simultaneamente o status da fusão de genes múltiplos. Conseqüentemente, algumas técnicas tradicionais que só podem consultar um ou alguns genes de cada vez estão se tornando abordagens ineficientes, especialmente quando se considera que as amostras de tumores clínicos são muitas vezes muito finitas e não são amáveis para serem divididas entre vários ensaios. O sequenciamento da próxima geração (NGS), no entanto, é uma plataforma de análise que é bem adequada para testes de múltiplos genes, e os ensaios baseados em NGS tornaram-se comuns em laboratórios clínicos de diagnóstico molecular.

Os ensaios de NGS usados atualmente para a detecção de fusão/rearranjo variam em relação ao material de entrada utilizado, às químicas empregadas para preparação da biblioteca e ao enriquecimento alvo, e ao número de genes consultados dentro de um ensaio. Os ensaios de NGS podem ser baseados em RNA ou DNA (ou ambos) extraídos da amostra. Embora a análise RNA-baseada seja dificultada pela tendência de amostras clínicas para conter o RNA altamente degradado, contorna a necessidade de sequenciar os íntrons grandes e frequentemente repetitivos que são os alvos do teste DNA-baseado da fusão mas provaram ser difíceis para NGS análise de dados¹⁶. Estratégias de enriquecimento alvo para ensaios de NGS baseados em RNA podem ser amplamente divididas em abordagens de captura híbrida ou mediadas por amplicon. Embora ambas as estratégias tenham sido utilizadas com sucesso para a detecção de fusão, cada uma delas contém vantagens sobre os outros^17,18. Os ensaios de captura híbrida geralmente resultam em bibliotecas mais complexas e reduziram o abandono alélico, enquanto os ensaios baseados em amplicon geralmente exigem uma entrada mais baixa e resultam em menos seqüenciamento fora do alvo¹⁹. No entanto, talvez a principal limitação do enriquecimento tradicional baseado em amplicon seja a necessidade de primers para todos os parceiros de fusão conhecidos. Isto é problemático, uma vez que muitos genes clinicamente importantes são conhecidos por fundir-se com dezenas de parceiros diferentes, e mesmo se o design da cartilha permitiu a detecção de todos os parceiros conhecidos, novos eventos de fusão permaneceria sem ser detectado. Uma técnica recentemente descrita denominada PCR multiplex ancorada (ou AMP para abreviação) aborda essa limitação²⁰. No AMP, um adaptador NGS ' semifuncional ' é ligado a fragmentos de cDNA que são derivados do RNA de entrada. O enriquecimento do alvo é conseguido pela amplificação entre primers específicos do gene e uma primeira demão ao adaptador. Como resultado, todas as fusões de genes de interesse, mesmo que um novo parceiro de fusão esteja envolvida, devem ser detectadas (ver Figura 1). Este artigo descreve o uso do kit ArcherDx FusionPlex Solid tumor, um ensaio baseado em NGS que emprega AMP para o enriquecimento alvo e preparação da biblioteca, para a detecção de fusões de genes oncogênicos em amostras de tumores sólidos (ver tabela complementar 1 para lista completa de genes). O protocolo de bancada úmida e as etapas de análise de dados foram rigorosamente validadas em um laboratório com certificação de alterações clínicas de melhoramento laboratorial (CLIA).

Protocolo

1. preparação e sequenciamento de bibliotecas

1. Considerações gerais sobre o ensaio e etapas de pré-ensaio
   1. As funcionamentos do ensaio consistem tipicamente em sete amostras clínicas e em um controle positivo (embora o número de amostras por a execução da preparação da biblioteca possa ser ajustado como necessário). Use um controle positivo que contenha pelo menos diversas fusões genéticas (que os alvos do ensaio) que foram confirmados por um fabricante e/ou tenham sido confirmados por uma metodologia ortogonal. Um controle não-modelo (NTC) deve ser incluído como uma amostra adicional em cada ensaio executado, mas só é realizado através de síntese de cDNA segunda vertente e pré-sequenciamento controle de qualidade (pre-Seq QC; para garantir nenhuma síntese de cDNA). Use diluente de amostra (10 mM Tris HCl pH 8,0) para o NTC.
   2. Realize a extração do ácido nucleico total (TNA) do tecido de parafina-encaixado formalin-fixado (FFPE).
   3. Quantificar o componente RNA da TNA usando um ensaio fluorométrico.
      Nota: impeça a degradação do RNA nas amostras limitando ciclos freeze-thaw, mantendo o ácido nucleico descongelado na baixa temperatura (bloco, gelo, ou alternativa refrigerados), e impedindo a contaminação do RNase (luvas desgastando, usando um pulverizador do decontaminador de RNase).
2. Priming aleatório
   Nota: a entrada desejada para o ensaio é de 200 ng RNA (baseado na quantificação fluorométrica do TNA). As entradas mais baixas podem ser usadas se 200 ng não pode ser conseguido. Se a amostra falha pós-sequenciamento QC, repetindo com entrada mais alta pode resultar em métricas aceitáveis de QC.
   1. Diluir TNA em 10 mM Tris HCl pH 8,0 para atingir a concentração de RNA desejada. Para cada amostra, transfira 20 μL da diluição para os tubos de tira de reagente de escorva aleatória (colocados no bloco de alumínio pré-refrigerado) e misture pipetando para cima e para baixo 6 − 8 vezes. Gire momentaneamente para baixo e transfira o volume inteiro a uma placa do PCR do poço 96 e sele-o com película do RT.
   2. Introduza a placa no bloco do termociclador, cubra com almofada de compressão, e feche a tampa. Incubar a 65 ° c durante 5 min (tampa aquecida).
   3. Remova a placa do termociclador e coloc no gelo por 2 minutos.
3. Síntese do cDNA da primeira vertente
   1. Transfira todo o volume do produto de escorvamento aleatório para os primeiros tubos de tira de reagente da vertente (colocados no bloco de alumínio pré-refrigerado). Misturar pipetando para cima e para baixo 6 − 8 vezes. Gire momentaneamente para baixo, transfira o volume inteiro a uma placa do PCR do poço 96 e sele-o com película do RT.
   2. Introduza a placa no bloco do termociclador, cubra com almofada de compressão, e feche a tampa. Programa do termociclador do funcionamento: 25 ° c 10 minutos, 42 ° c 30 minutos, 80 ° c 20 minutos, preensão de 4 ° c (tampa aquecida).
4. Síntese do cDNA da segunda vertente
   1. Em um novo conjunto de tubos de tiras de PCR, crie uma diluição 1:10 do primeiro produto da vertente adicionando 1 μL de produto da primeira vertente a 9 μL de água livre de nuclease. Defina a diluição de lado para ser utilizada no ensaio pre-Seq QC.
   2. Adicionar 21 μL de água livre de nuclease ao produto remanescente da primeira vertente. Transferir 40 μL do primeiro produto da vertente e da água nuclease livre para o tubo de tira de reagente da segunda vertente (colocado no bloco de alumínio pré-refrigerado). Misturar pipetando para cima e para baixo 6 − 8 vezes. Gire para baixo, transfira o volume inteiro a uma placa do PCR do poço 96 e sele-o com película do RT.
   3. Introduza a placa no bloco do termociclador, cubra com almofada de compressão, e feche a tampa. Programa do termociclador do funcionamento: 16 ° c 60 minuto, 75 ° c 20 minutos, preensão de 4 ° c (tampa heated).
      Nota: Este é um ponto de paragem aceitável. A placa pode ser armazenada a-20 ° c.
5. Pre-Seq QC
   Nota: Este ensaio de controle de qualidade (QC) é usado principalmente para verificação de nenhuma síntese de cDNA do NTC. No entanto, os dados também podem ser informativos na solução de problemas de ensaio. Por exemplo, se uma amostra tem um bom valor pre-Seq QC mas as métricas de ensaio pobres (veja abaixo), então pode ser uma indicação de um problema na execução do ensaio, necessitando de uma repetição.
   1. Execute cada amostra e o NTC em duplicado. Também incluem no pre-Seq QC executar uma reação NTC, que é nuclease água livre (também executado em duplicado). Para cada poço aplicável de uma placa óptica 96 bem adicionar 5 μL da mistura mestre de ensaio, 1 μL de primer VCP 10x, e 4 μL da diluição 1:10 do primeiro produto vertente que foi criado no passo 1.4.1.
   2. Sele a placa com película do RT, gire para baixo, e carregue-a em um instrumento quantitativo do PCR (qPCR). Executar o programa: pre-amp: 1 ciclo 95 ° c 20 s, amp: 35 ciclos 95 ° c 3 s (4,4 ° c/s taxa de rampa) − 60 ° c 30 s (2,2 ° c/s taxa de rampa).
   3. Confirme a falta de um valor do limiar do ciclo (CT) para o NTC do ensaio e a reação NTC.
      Nota: se não houver TC observada no ensaio NTC, este não será mais transportado para o ensaio. A observação de um valor do CT na reação NTC necessita uma repetição do ensaio pre-Seq do QC. A observação de um CT no ensaio NTC sugere a contaminação da amostra em algum ponto prévio no ensaio, exigindo assim que o ensaio inteiro (todas as amostras) seja começado sobre. O valor de pre-Seq QC CT para uma amostra de qualidade adequada deve ser inferior a 30 (valores de CT inferiores correlacionam com mais produto e, portanto, maior qualidade de RNA). Valores acima de 30 não são indicadores absolutos de falha e essas amostras devem ser continuadas no ensaio. Entretanto, todos os dados derivados de tais amostras devem ser revistos com cuidado, particular nos casos para que nenhuma fusão é chamada.
6. Reparo da extremidade e purificação do grânulo
   1. Transferir 40 μL do segundo produto da vertente para o tubo de tira do reagente de reparação final (colocado no bloco de alumínio pré-refrigerado). Misture com pipetagem para cima e para baixo 6 − 8 vezes, gire para baixo e coloque em bloco termociclocador (mantendo a tampa aquecida aberta) e execute o programa termociclador: 25 ° c 30 min, 4 ° c Hold.
   2. Retire os grânulos de purificação de 4 ° c e deixe equilibrar a temperatura ambiente. Compo o suficiente 70% etanol para durar ao longo de toda a preparação da biblioteca. O Vortex Perla bem antes do uso e o Pipet 100 μL no número apropriado de poços de uma placa do U-fundo.
      Nota: para cada 8 amostras que são executadas, serão necessários 20 mL de etanol a 70%.
   3. Adicione o volume inteiro do produto final do reparo aos grânulos. Pipet acima e para baixo 6 − 8 vezes para misturar e incubar na temperatura ambiente por 5 minutos, seguido por uma incubação de 5 minutos no ímã.
   4. Remover e descartar o sobrenadante e realizar 2 200 μL 70% lavagens de etanol com 30-s incubações. Após a lavagem final remover todos os 70% etanol e deixe secar ao ar por 5 min.
   5. Retire do íman e Resuspenda os grânulos em 22 μL de 10 mM de Tris HCl pH 8,0. Incubar o íman durante 3 min seguido de uma incubação de 2 min no íman. Proceder imediatamente ao passo de ligadura 1.
7. Etapa 1 da ligadura e purificação do grânulo
   1. Transfira 20 μL da placa da purificação do grânulo do reparo da extremidade (que toma o cuidado para não perturbar a pelota do grânulo) nos tubos de tira da etapa 1 da ligadura (coloc no bloco de alumínio pre-refrigerado). Misture pipetando para cima e para baixo 6 − 8 vezes, gire para baixo e transfira o volume inteiro em uma placa do PCR do poço 96.
   2. Introduza a placa no bloco do termociclador, cubra com almofada de compressão e feche a tampa. Execute o programa do termociclador: 37 ° c 15 minutos, preensão de 4 ° c (tampa aquecida).
   3. Retire os grânulos de purificação de 4 ° c e deixe equilibrar a temperatura ambiente. O Vortex Perla bem antes do uso e o Pipet 50 μL no número apropriado de poços de uma placa do U-fundo.
   4. Adicionar todo o volume de ligadura passo 1 produto para as contas. Pipet acima e para baixo 6 − 8 vezes para misturar e incubar na temperatura ambiente por 5 minutos, seguido por uma incubação de 5 minutos no ímã.
   5. Remover e descartar o sobrenadante e realizar 2 200 μL 70% lavagens de etanol com 30-s incubações. Após a lavagem final remover todos os 70% etanol e deixe secar ao ar por 5 min.
   6. Retire do íman e Resuspenda os grânulos em 42 μL de 10 mM de Tris HCl pH 8,0. Incubar o íman durante 3 min seguido de uma incubação de 2 min no íman. Proceder imediatamente ao passo 2 da ligadura.
8. Etapa 2 da ligadura e purificação do grânulo
   1. Remova os reagentes do tubo de tira do adaptador de código de barras molecular (MBC) do armazenamento de 4 ° c. A numeração adequada da faixa do adaptador MBC é extremamente importante, pois os índices específicos de amostra são adicionados neste momento. Posicione os tubos horizontalmente com as dobradiças para trás e use um marcador permanente para rotular os tubos 1, 2, 3... da esquerda para a direita. Também é crítico para registrar os índices específicos de amostra para fins de sequenciamento (eles devem ser inseridos na planilha seqüenciador).
   2. Transferir 40 μL da placa de purificação do talão da etapa 1 da ligadura (tomando cuidado para não perturbar a pelota do grânulo) para os tubos de tira do adaptador MBC (colocados no bloco de alumínio pré-refrigerado). Misturar pipetando para cima e para baixo 6 − 8 vezes.
   3. Gire para baixo e transfira o volume inteiro aos tubos de tira do reagente da etapa 2 da ligadura (igualmente coloc no bloco de alumínio pre-refrigerado). Misture pipetando para cima e para baixo 6 − 8 vezes, gire para baixo e coloque no bloco termociclocador. Com a tampa aquecida fora funcione o programa do termociclador: 22 ° c 5 minutos, preensão de 4 ° c.
      Nota: Este é um ponto de paragem seguro e as amostras podem ser armazenadas a-20 ° c.
   4. Remova as contas de limpeza de ligadura do armazenamento de 4 ° c e deixe equilibrar a temperatura ambiente. Prepare 1 mL de NaOH fresco de 5 mM.
   5. Vortex as contas de limpeza de ligadura e adicione 50 μL a um novo conjunto de tubos de tiras de PCR. Incubar no íman durante 1 min. Após o 1-min incubação remover e descartar sobrenadante. Remova os tubos de tira do ímã e Resuspenda em 50 μL do tampão da limpeza da ligadura introduzindo com pipetas acima e para baixo 6 − 8 vezes.
   6. Transfira o volume inteiro do produto da etapa 2 da ligadura nos tubos da tira do grânulo da limpeza da ligadura. Misture as amostras por vortexing e incubar à temperatura ambiente durante 5 min. Novamente, misture amostras por vortexing e incubar à temperatura ambiente por mais 5 min. Após a segunda incubação de 5 min, misture as amostras por vortexing, gire para baixo brevemente e incubar no ímã por 1 minuto.
   7. Remova e descarte o sobrenadante. Adicione 200 μL de tampão de limpeza de ligadura e Vortex para resuspender. Realize uma rotação rápida e coloque no íman durante 1 min. realize uma segunda lavagem com o tampão de limpeza de ligadura novamente.
   8. Depois que as duas lavagens com o tampão da limpeza da ligadura executam uma lavagem idêntica usando a água ultrapura. Após a lavagem de água ultrapura, re-suspender os grânulos em 20 μL de NaOH de 5 mM e transferir para uma placa de PCR 96 bem. Coloc a placa no bloco do termociclador com uma almofada de compressão e funcione o programa do termociclador: 75 ° c 10 minutos, preensão de 4 ° c (tampa aquecida).
   9. Gire para baixo a placa do PCR uma vez que as amostras esfriaram a 4 ° c. Coloque a placa no íman durante pelo menos 3 min e proceda imediatamente à primeira PCR.
9. Primeiro PCR e purificação do grânulo
   1. Retire os primeiros tubos de reagente de PCR de 4 ° c armazenamento e coloque em um bloco de alumínio pré-refrigerado. Além disso, retire os primers GSP1 de-20 ° c e deixe equilibrar a temperatura ambiente.
   2. Adicionar 2 μL dos primers GSP1 a cada poço dos primeiros tubos de reagente de PCR. Transfira 18 μL do produto de limpeza da ligadura 2 para os primeiros tubos de tira de reagente PCR e misture com pipetagem para cima e para baixo 6 − 8 vezes.
   3. Gire para baixo e transfira a uma placa do PCR do poço 96. Coloc a placa no bloco do termociclador com uma almofada de compressão e funcione o programa do termociclador: 95 ° c 3 minuto, 15 ciclos 95 ° c 30 s − 65 ° c 5 minuto (taxa da rampa 100%), 72 ° c 3 minuto, preensão de 4 ° c (tampa aquecida).
      Nota: Este é um ponto de paragem seguro e as amostras podem ser armazenadas a 4 ° c durante a noite ou a-20 ° c para armazenamento a longo prazo.
   4. Retire os grânulos de purificação de 4 ° c e deixe equilibrar a temperatura ambiente. O Vortex Perla bem antes do uso e o Pipet 24 μL no número apropriado de poços de uma placa do U-fundo.
   5. Transfira 20 μL do primeiro produto de PCR para os 24 μL de grânulos. Pipet acima e para baixo 6 − 8 vezes para misturar e incubar na temperatura ambiente por 5 minutos, seguido por uma incubação de 2 minutos no ímã.
   6. Remover e descartar o sobrenadante e realizar 2 200 μL 70% lavagens de etanol com 30-s incubações. Após a lavagem final remover todos os 70% etanol e deixe secar ao ar por 2 min.
   7. Retire do íman e Resuspenda os grânulos em 24 μL de 10 mM de Tris HCl pH 8,0. Incubar o íman durante 3 min seguido de uma incubação de 2 min no íman. Prossiga imediatamente para a segunda PCR.
10. Segundo PCR e purificação do grânulo
    1. Remova os tubos de tira do reagente do segundo PCR de 4 ° c e coloc em um bloco de alumínio pre-refrigerado. A numeração apropriada dos segundos tubos da tira do PCR é crìtica importante porque os índices amostra-específicos são adicionados neste momento. Posicione os tubos horizontalmente com as dobradiças para trás e use um marcador permanente para rotular os tubos 1, 2, 3... da esquerda para a direita. Além disso, retire os primers GSP2 de-20 ° c e deixe equilibrar a temperatura ambiente.
       Observação: também é crítico para registrar os índices específicos de amostra para fins de sequenciamento (eles devem ser inseridos na planilha seqüenciador).
    2. Adicionar 2 μL dos primers GSP2 a cada poço dos segundos tubos de reagente de PCR. Transfira 18 μL do primeiro produto da limpeza do PCR aos segundos tubos de tira do reagente do PCR e misture pipetando acima e para baixo 6 − 8 vezes.
    3. Gire para baixo e transfira a uma placa do PCR do poço 96. Coloc a placa no bloco do termociclador com uma almofada de compressão e funcione o programa do termociclador: 95 ° c 3 minutos, 18 ciclos 95 ° c 30 s − 65 ° c 5 minuto (taxa da rampa 100%), 72 ° c 3 minuto, preensão de 4 ° c (tampa aquecida).
       Nota: Este é um ponto de paragem seguro e as amostras podem ser armazenadas a 4 ° c durante a noite ou a-20 ° c para armazenamento a longo prazo.
    4. Retire os grânulos de purificação de 4 ° c e deixe equilibrar a temperatura ambiente. O Vortex Perla bem antes do uso e o Pipet 24 μL no número apropriado de poços de uma placa do U-fundo.
    5. Transfira 20 μL do segundo produto do PCR aos grânulos. Pipet acima e para baixo 6 − 8 vezes para misturar e incubar na temperatura ambiente por 5 minutos, seguido por uma incubação de 2 minutos no ímã.
    6. Remover e descartar o sobrenadante e realizar 2 200 μL 70% lavagens de etanol com 30-s incubações. Após a lavagem final remover todos os 70% etanol e deixe secar ao ar por 2 min.
    7. Retire do íman e Resuspenda os grânulos em 24 μL de 10 mM de Tris HCl pH 8,0. Incubar o íman durante 3 min seguido de uma incubação de 2 min no íman. Transfira 20 μL do segundo produto da limpeza do PCR a uma placa nova do PCR de 96 poços.
       Nota: Este é um ponto de parada seguro e as bibliotecas podem ser armazenadas em-20 ° c para o armazenamento a longo prazo ou proceder imediatamente à quantificação da biblioteca.
11. Quantificação da biblioteca
    1. Remova a mistura mestre de quantificação da biblioteca e os padrões do armazenamento de-20 ° c e deixe-o equilibrar à temperatura ambiente.
    2. Executar 1:5 diluição de todas as bibliotecas (segundo produto PCR) usando 10 mM Tris HCl pH 8,0 seguido por uma diluição serial de 1:199, 1:199 e 20:80 usando 10 mM Tris HCl pH 8,0 0, 5% Polissorbato. As duas diluições finais de 1:200000 e 1:1000000, respectivamente, serão executadas em triplicado.
    3. Adicione 6 μL de mistura mestra a cada poço de uma placa óptica 96 bem seguida de 4 μL de diluição ou padrão apropriado. Gire para baixo a placa e carregue-a no instrumento de qPCR. Utilize as seguintes condições de ciclismo: 1 ciclo 95 ° c 5 min, 35 ciclos 95 ° c 30 s (4,4 ° c/s taxa de rampa) − 60 ° c 45 s (2,2 ° c/s taxa de rampa).
    4. Depois que a quantificação da biblioteca é completa e as concentrações da biblioteca são determinadas (com a média de ambas as diluições testadas), normalizar todas as bibliotecas a 2 nanômetro usando o pH 8,0 de 10 milímetros Tris HCl. Faça o pool da biblioteca combinando 10 μL de cada biblioteca normalizada em um micro tubo de centrifugação de 1,5 mL.
12. Sequenciamento de bibliotecas
    1. Remova o cartucho de reagente do sequenciador de-20 ° c de armazenamento e coloque em água deionizada (DI) até a linha de enchimento por pelo menos 1 h. Além disso, remova o kit de reagentes do sequenciador de 4 ° c e deixe equilibrar a temperatura ambiente durante pelo menos 1 h. O número máximo de bibliotecas que podem ser seqüenciadas nesta plataforma de sequenciamento é 8 (um dos quais deve ser o controle positivo).
    2. Faça o pool de biblioteca de amplicon (DAL) desnaturado combinando 10 μL do pool de biblioteca com 10 μL de NaOH 0,2 N e incubar por 5 minutos na temperatura ambiente. Após a incubação de 5 min, adicione 10 μL de 200 mM de Tris HCl pH 7,0, seguido de 970 μL de tampão de hibridação HT1.
    3. Faça o tubo de carga final combinando 300 μL de HT1 μL de 20 pM PhiX e 675 μL do pool DAL. Vortex e gire para baixo o tubo de carga. Adicionar todo o volume do tubo de carga para o poço de amostra do cartucho de reagente Sequencer e cartucho de carga para o sequenciador executando 2 x 151 BP lê com 2 x 8 leituras de índice.

2. análise de dados

1. Tratamento e análise de dados de sequenciamento
   1. Baixe métricas de sequenciamento do instrumento NGS.
   2. Assegure-se de que os dados de sequenciamento se enquadra nos intervalos abaixo (específicos para o kit usado neste exemplo). Densidade do aglomerado (densidade [K/mm²]): 945 – 1600 k; % de leituras passando filtro (clusters PF [%]): > 90%; escores de qualidade (% ≥ p30): > 85%; Alinhamento de PhiX (alinhado%): 1.5 − 6.0%; Taxa de erro de PhiX (taxa de erro [%]): < 1,0%; lê o filtro de passagem (lê PF [M]): > 22 milhões.
      Observação: seqüenciamento execuções não atender a essas métricas estão sujeitas a repetição.
   3. Revise o% de leituras atribuídas a cada amostra (ou seja, cada índice específico da amostra). Para uma corrida típica em que o pico PhiX-in foi de ~ 5% e 8 amostras foram sequenciadas, cada amostra deve idealmente respondem por aproximadamente 11,9% das leituras. O intervalo aceitável para cada amostra é de 5 − 25%. Se quaisquer amostras não couberam dentro deste intervalo, repita a quantificação e sequenciamento da biblioteca.
2. Envio de dados brutos de sequência para o algoritmo de análise
   Nota: a versão 4.1.1.7 da análise ArcherDx é descrita aqui. Neste exemplo, o software de análise é implantado como uma ' máquina virtual ' executada em um servidor interno. Uma unidade de processamento central (CPU) e 12 GB de memória de acesso aleatório (RAM) são necessárias para cada amostra a ser analisada simultaneamente (normalmente 8 amostras são processadas simultaneamente exigindo 8 CPU e 96 GB de RAM). O processamento toma tipicamente 3 − 8 h.
   1. Use as configurações de análise padrão dentro do sistema de análise, com exceção de MIN_AVERAGE_UNIQUE_RNA_START_SITES_PER_GSP2_CONTROLS (isso é alterado de 10 para 20) e READ_DEPTH_NORMALIZATION (isso é definido como 0 para evitar a amostragem).
   2. Para iniciar um trabalho de análise, clique em executar análise na interface do usuário, envie um nome para o trabalho e, em seguida, selecione os arquivos fastq necessários (garantindo que ambas as leituras [R1 e R2] sejam selecionadas para cada amostra).
   3. Selecione a fusão do RNA para tipos da análise do RNA, Illumina (emparelhado) para a plataforma, e o painel contínuo do tumor de fusionplex para a região do alvo. Em seguida, clique em submeter análise.
3. Interpretação dos dados do ensaio
   1. Abra a interface do usuário do sistema de análise e selecione o trabalho desejado. Selecione a amostra de controle positivo. Certifique-se de que todas as fusões esperadas e isoformas oncogênicas foram detectadas e listadas na guia evidência forte .
      Nota: se qualquer uma das fusões controladas no controle positivo não for detectada para uma determinada execução do ensaio, pode ser uma indicação de um problema nessa execução, o que requer uma repetição (do início do ensaio).
   2. Examine as estatísticas de leitura para cada amostra clínica na execução clicando na guia ler estatísticas . Cada amostra deve ser representada por pelo menos 1 milhão fragmentos totais. Se menos de 1 milhão, re-Sequence a biblioteca com considerações para o re-quantificação para assegurar-se de que a quantificação inicial não fosse aberrantemente elevada.
      Nota: as amostras da boa qualidade exibirão geralmente no alvo% > 85%, e os escaninhos MOLECULARS do RNA devem ser > 20000 e compreendem > 30% das leituras. No entanto, a falha ao atender a essas métricas não aciona automaticamente a falha de exemplo.
   3. Inspecione a média de sites de início exclusivo por GSP2 valor de controle .
      Nota: este valor é uma medida de sequenciamento de complexidade de primers para quatro genes de limpeza. Esta métrica é um determinante crítico da qualidade do RNA na amostra (se o sequenciamento de genes esperados para ser expresso na amostra é pobre, então a confiança na capacidade de detectar uma fusão genética expressa é baixa). O corte para esta métrica é 20. Se qualquer exemplo exibe um valor menor que 20, em seguida, os resultados para o exemplo devem ser relatados como não informativo se nenhuma fusão de alta confiança for encontrada. O status dessa métrica também pode ser determinado na página de resumo da execução (o status será listado como Fusion QC: Pass ou Fusion QC: número de sites de início de controle de RNA GSP2 exclusivo baixo dependendo se o valor é maior ou menor que 20). Uma fusão elevada da confiança em uma amostra que não passe esta métrica do QC pode ainda ser relatada se é determinada ser real (veja abaixo). Geralmente, maiores escores de CQ utilizando essa métrica correlacionam-se com escores inferiores de PreSeq CT, como esperado (Figura 2).
4. Interpretação de chamadas de fusão
   1. Examine cuidadosamente cada fusão chamada a guia de evidências fortes (a maioria das fusões de evidências fortes chamadas pelo sistema são artifactuais). Também Escaneie o escaninho fraco da fusão da evidência, embora a presença de uma fusão não-Artifactual neste escaninho seja um evento extremamente raro. Para avaliar a validade de uma fusão, primeiro anote as leituras (#/%) e iniciar métricas de sites .
      Nota: geralmente, a confiança em uma fusão chamada aumenta a maior essas métricas são. As fusões que são suportadas por menos de 5 locais do começo e por menos de 10% das leituras da primeira demão de apoio devem ser consideradas como altamente suspeitas como sendo Artifactual.
   2. Anote os ícones exibidos na coluna filtros .
      Nota: diversos destes ícones alertam o usuário de uma fonte potencial de uma chamada vesícula. Freqüente entre estes (e encontrado primeiramente no escaninho fraco das evidências de fusões chamadas) são os exemplos onde os sócios são de conhecidos ou mostram a semelhança entre si na seqüência (indicando o alinhamento mal provável ou incorreto do mis-priming). Uma outra fonte comum de ligações vesícula da fusão ocorre quando as leituras que apoiam a fusão contêm uma taxa de erro elevada que seja indicativa do mapeamento pobre ao genoma da referência, e esta é associada com um ícone distinto. Os eventos de readthrough de transcriptional são identificados através de um outro ícone. Estes são comuns e geralmente são ignorados. Vários outros ícones também são usados na interface do usuário, mas uma descrição completa de todos está além do escopo deste artigo. Artefatos comuns que geralmente podem ser ignorados sem mais investigações incluem: ADCK4-NUMBL, SYN2-PPARG, DGKG-ETV5, ETV6-Axl, ETV1-ERG, ETV4-ETV1, FGFR3-PDGFRB, EGFR-NTRK1, RAF1-RET, ALK-TFEB, NOTCH1-RET, rela-RET, NTRK3-ALK, BRAF-ADAMTS8, e FCGR2C-Mast.
   3. Visualize as leituras de suporte para cada fusão potencial clicando no link Visualizar na interface do usuário, que leva o usuário a uma exibição jbrowse baseada na Web de pileups de leituras de suporte de fusão individuais. Confirme que as leituras são geralmente livres da má combinação (embora algum ruído deva ser esperado), que uma proporção significativa (idealmente > 30 bases) das leituras alinha ao sócio da fusão, e que as seqüências imediatamente adjacentes ao ponto de interrupção entre os genes e os sítios de encadernação de primer estão livres de inserções ou eliminações. Confirme que a sequência alinhada inclui a porção 3 ' das sequências de encadernação de primer para primers que suportam as leituras de fusão (se 3 ' porções não estão incluídas, pode ser uma indicação de mis-escorva).
   4. Se as sequências de codificação de ambos os genes estiverem envolvidas na fusão, assegure-se de que o parceiro 3 ' permaneça no quadro. Estale sobre a ligação da tradução na relação (que dará um status verdadeiro ou falso para cada combinação da seqüência de referência) e igualmente confirma manualmente que o Fusion está no quadro com a inspeção dos pontos de interrupção chamados em um navegador do genoma. Os pontos de interrupção chamados podem ser determinados por pairando o mouse sobre os pontos vermelhos no esquema de fusão.
      Nota: uma vez que a maioria (mas não todos) pontos de interrupção genômica para fusões legítimas ocorrem em regiões intrônicas e resultam em splicing em conjunto de exons inteiros, fusões em que os limites de exon compreendem os pontos de interrupção para ambos os parceiros são geralmente vistos com um grau maior de confiança. No entanto, uma vez que existem muitos exemplos publicados de pontos de interrupção mid-exonic em fusões, isso não deve ser usado como critérios absolutos na interpretação de uma fusão.
   5. Para cada fusão, certifique-se manualmente de que as sequências adjacentes ao ponto de interrupção não sejam homologosas para as próximas bases contíguas esperadas para cada parceiro. Inspecione todos os exons contíguos possíveis em um navegador do genoma.
      Nota: uma fonte comum da fusão vesícula é desalinhamento ou mis-escorva devido à homologia entre dois sócios do gene, e este não é chamado sempre pelo sistema através dos ícones descritos acima.

Resultados

Mostrado na Figura 3, figura 4 e Figura 5 são capturas de tela da interface de usuário de análise demonstrando resultados de uma amostra de adenocarcinoma de pulmão. Na Figura 3, o resumo da amostra é mostrado (superior) que lista as fusões de evidência fortes chamadas, bem como o status de QC (circulado em vermelho). A fusão de ADCK4-numbl (de que 3 isoformas é alistada) é ignorada imediatamen...

Discussão

O enriquecimento de alvo baseado em PCR multiplex e a preparação da biblioteca seguidos por sequenciamento de próxima geração são adequados para a avaliação de fusão genética multiplexada em amostras de tumores clínicos. Focalizando na entrada do RNA um pouco do que o ADN genomic, a necessidade de sequenciar íntrons grandes e repetitivos é evitada. Adicionalmente, desde que esta aproximação amplifica fusões do gene não obstante a identidade do sócio da fusão, as fusões novas são detectadas. Esta é uma vantagem crítica no...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
10 mM Tris HCl pH 8.0	IDT	11-05-01-13	Usado para diluição TNA
1M Tris pH 7.0	Thermo Fisher	AM9850G	Usado em pool de biblioteca
Reservatório de reagente de 25 mL com divisor	USA Scientific	9173-2000	Para uso com pipetadores multicanal e grandes volumes de reagentes
Semi-saia TemPlate de 96 poços 0.1mL PCR plate-natural	USA Scientific	1402-9700	Placa usada para etapas de termociclador
Agencourt AMPure XP Beads	Beckman Coulter	A63881	Usado na purificação após várias etapas de ensaio
Agencourt Formapure Kit	Beckman Coulter	A33343	Usado na extração TNA
Archer FusionPlex Solid Tumor kit	ArcherDX	AB0005	Este kit contém a maioria dos reagentes necessários para realizar a preparação da biblioteca para sequenciamento Illumina (kits para sequenciamento Ion Torrent também estão disponíveis)
Bloco frio, 96 poços	Light Labs	A7079	Usado para manter amostras resfriadas em várias etapas
Etanol	Decon Labs	DSP-MD.43	Usado para lavagens de esferas
Quantificação de biblioteca para Illumina Padrão de Controle Interno	Kapa Biosystems	KK4906	Usado para quantificação de bibliotecas
Biblioteca Quantificação Primers e ROX Baixa mistura de qPCR	Kapa Biosystems	KK4973	Usado para quantificação de bibliotecas
Padrões de quantificação de bibliotecas	Kapa Biosystems	KK4903	Usado para quantificação de bibliotecas
Placa magnética, 96 poços (grau N38)	Alpaqua	A32782	Usado em etapas de purificação de esferas
Conjunto de adaptadores MBC B	ArcherDX	AK0016-48	Adaptadores que contêm índices específicos de amostra para permitir o sequenciamento multiplex
Micro Centrifuge	USA Scientific	2641-0016	Usado para girar tubos de PCR
MicroAmp EnduraPlate Placa óptica de 96 poços	Thermo-Fisher	4483485	Usado para quantificação de biblioteca QClibrary Microamp
Almofada de compressão de filme óptico	Applied Biosystems	4312639	Usado para quantificação de biblioteca
Mini Plate Spinner		Labnet MPS-1000	Usado para coletar líquido no fundo de poços de placas
Kit de Reagentes MiSeq v3 (600 ciclos)	Illumina	MS-102-3003	Contém componentes necessários para uma execução de sequenciamento MiSeq
Sistema MiSeqDx	Illumina		NGS Sequencing
Instrument Modelo 9700 Thermocycler	Applied Biosystems		Usado para várias etapas durante ensaio
de água livre de nuclease	Ambion	9938	Usado como diluente geral
ABI óptico Tampas de placa de PCR de 96 poços	Thermo-Fisher	4311971	Usado para quantificação de QClibrary Pre-Seq
Estação de trabalho de PCR Modelo 600	Sistemas de limpeza de ar	BZ10119636	Etapas de ensaio de bancada úmida realizadas nesta 'caixa de ar morto'Proteinase
K	Qiagen	1019499	Usado na extração da TNA
QuantStudio 5	Applied Biosystems	LSA28139	instrumento qPCR usado para quantificação de PreSeq e biblioteca
Kit de ensaio Qubit RNA HS	Life Technologies	Q32855	Uso para determinar a concentração de RNA em amostras de TNA
RNase Away	Fisher	12-402-178	Usado para descontaminação geral de RNase de áreas de trabalho
Seraseq FFPE Material de referência de RNA de fusão tumoral v2	SeraCare	0710-0129	Usado como ensaio de controle positivo
Hidróxido de Sódio		Fisher BP359-212	Usado em etapas de limpeza e para configuração de sequenciamento
SYBR Green Supermix	Bio Rad	172-5120	Componente do Ensaio de QC PreSeq
TempAssure PCR 8-tube Strips	USA Scientific	1402-2700	Usado para mistura de reagentes e amostras, etc.
Modelo RT PCR filme	EUA Scientific	2921-7800	Usado para cobrir placas de 96 poços
U-Bottom 96-well Microplate	LSP	MP8117-R	Usado durante a purificação do grânulo