Summary
本文详细介绍了使用锚定多路聚合酶链式反应基库制备试剂盒,然后进行下一代测序,以评估临床固体肿瘤样本中的致癌基因融合。介绍了湿凳和数据分析步骤。
Abstract
基因融合经常导致许多不同类型的癌症的致癌表型。此外,癌症患者样本中某些融合的存在通常直接影响诊断、预后和/或治疗选择。因此,基因融合的准确检测已成为许多疾病类型临床管理的重要组成部分。直到最近,临床基因融合检测主要通过使用单基因检测来完成。然而,具有临床意义的基因融合的不断增加,已经产生了同时评估多个基因融合状态的需求。基于下一代测序(NGS)的测试通过以大规模平行方式测序核酸的能力满足了这一需求。多种基于NGS的方法,采用不同的策略,基因靶点富集,现在可用于临床分子诊断,每种方法都有自己的优缺点。本文介绍了使用锚定多路PCR(AMP)为基础的靶点浓缩和库制备,然后NGS来评估临床固体肿瘤标本的基因融合。AMP在基于扩基的扩充方法中独树一帜,因为它识别基因融合,而不管融合伙伴的身份如何。这里详细介绍了湿板凳和数据分析步骤,以确保从临床样本中准确检测基因融合。
Introduction
由于大规模染色体变异(包括缺失、重复、插入、反转和易位),两个或两个以上基因融合到单个转录实体中。通过改变转录控制和/或改变表达基因产物的功能特性,这些融合基因可以赋予癌细胞1的致癌特性。在许多情况下,融合基因通过直接激活细胞增殖和生存途径,被认为是原发性致病的驱动因素。
随着费城染色体和相应的BCR-ABL1融合基因在慢性骨髓性白血病(CML)中的发现,基因融合对癌症患者的临床相关性首先显现出来。小分子抑制剂imatinib mesylate被开发专门针对这种融合基因,并在BCR-ABL1阳性CML患者3中表现出显著的疗效。致癌基因融合的治疗靶向在实体肿瘤中也取得了成功,以抑制ALK和ROS1融合基因在非小细胞肺癌中为主要例子4、5。近日,NTRK抑制剂拉罗替尼被FDA批准为NTRK1/2/3融合阳性实体肿瘤,无论疾病部位6。除了治疗选择,基因融合检测在疾病诊断和预后也起着重要作用。这在各种肉瘤和血液恶性肿瘤亚型中尤为普遍,这些亚类型由特定融合的存在和/或存在,直接通知预后7,8,9,10,11.这些只是癌症患者基因融合检测临床应用的几个例子。
由于在临床决策中起着至关重要的作用,从临床样本中准确检测基因融合至关重要。在临床实验室中应用了许多技术进行融合或染色体重排分析,包括:细胞遗传学技术、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、原位杂交荧光(FISH),免疫组织化学(IHC)和5'/3'表达不平衡分析(除其他外)12,13,14,15 。目前,癌症中可操作基因融合的快速扩大导致需要同时评估多个基因的融合状态。因此,一些一次只能查询一个或几个基因的传统技术正在成为低效的方法,特别是考虑到临床肿瘤样本往往非常有限,不能被分割成几种检测。然而,下一代测序(NGS)是一个分析平台,非常适合多基因检测,基于NGS的检测在临床分子诊断实验室中已经司空见惯。
目前用于融合/重新排列检测的NGS检测在所使用的输入材料、用于库制备和目标扩充的化学成分以及检测中查询的基因数量方面有所不同。NGS检测可以基于从样品中提取的RNA或DNA(或两者)。尽管基于RNA的分析受到临床样本含有高降解RNA的倾向的阻碍,但它规避了对大型且经常重复的内子进行测序的需要,这些子群是基于DNA的聚变测试的目标,但事实证明,这些对NGS来说很困难。数据分析16.基于RNA的NGS测定的目标浓缩策略可以主要分为混合捕获或扩大子介导方法。虽然这两种策略都已成功用于融合检测,但每种策略都比其他17、18具有优势。混合捕获检测通常会导致更复杂的库和减少等位位级落差,而基于安培的检测通常需要较低的输入,导致更少的离目标测序19。然而,传统以扩因为基础的浓缩的主要限制可能是需要对所有已知的聚变伙伴进行引物。这是有问题的,因为许多临床上重要的基因已知与几十个不同的伙伴融合,即使引体设计允许检测所有已知的伙伴,新的融合事件也不会被发现。最近描述的一种称为锚定多路PCR(简称AMP)的技术解决了这一限制20。在 AMP 中,"半功能"NGS 适配器被分割到从输入RNA派生的 cDNA 片段中。目标富集是通过在基因特异性引体和适配器引源之间扩增来实现的。因此,应该检测所有与感兴趣的基因的融合,即使涉及一个新的融合伙伴,也应当检测(见图1)。 本文介绍了 ArcherDx FusionPlex 固体肿瘤试剂盒的使用,这是一种基于 NGS 的检测,采用 AMP 进行靶点浓缩和库制备,用于检测固体肿瘤样本中的致癌基因融合(参见补充表 1完整的基因列表)。湿板协议和数据分析步骤已在临床实验室改进修订 (CLIA) 认证的实验室中经过严格验证。
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Protocol
1. 图书馆编制和排序
- 一般测定注意事项和预测定步骤
- Assay 运行通常由 7 个临床样本和一个阳性对照组成(尽管可以根据需要调整每个库准备运行的样本数)。使用至少包含多个基因融合(即测定靶点)的正对照,这些基因融合已被制造商确认和/或已被正交方法确认。非模板控制 (NTC) 必须作为附加样本包含在每次检测运行中,但仅通过第二链 cDNA 合成和预测序质量控制(前 Seq QC;以确保没有 cDNA 合成)进行。对 NTC 使用样品稀释剂 (10 mM Tris HCl pHH 8.0)。
- 对正式固定石蜡嵌入(FFPE)组织执行总核酸(TNA)提取。
- 使用荧光测定定量TNA的RNA成分。
注:通过限制冷冻解冻周期,在低温(冰块、冰或替代品)保持解冻的核酸,并防止RNase污染(戴手套,使用RNase去污染喷雾剂),防止样品中的RNA降解。
- 随机启动
注:测定所需的输入为200 ng RNA(基于TNA的荧光定量)。如果无法实现 200 ng,可以使用较低的输入。如果样本在定后QC中失败,如果重复输入较高可能会导致可接受的质量控制指标。- 在 10 mM Tris HCl pHH 8.0 中稀释 TNA,以达到所需的RNA浓度。对于每个样品,将20μL的稀释剂转移到随机注油试剂带管(放置在预冷却铝块中),然后通过上下移液6~8次混合。短暂减速,并将整个体积转移到 96 孔 PCR 板,并用 RT 薄膜密封。
- 将板插入热循环器块中,用压缩垫盖住,并合上盖子。在 65°C 孵育 5 分钟(加热盖)。
- 从热循环器上取出板,放在冰上 2 分钟。
- 第一股cDNA合成
- 将随机注油产物的整个体积转移到第一股试剂带管中(放置在预冷却铝块中)。上下移液6~8次混合。短暂旋转,将整个体积转移到 96 孔 PCR 板,并密封使用 RT 薄膜。
- 将板插入热循环器块中,用压缩垫盖住,并合上盖子。运行热循环器程序:25 °C 10 分钟,42 °C 30 分钟,80 °C 20 分钟,4 °C 保持(加热盖)。
- 第二股cDNA合成
- 在一组新的PCR带管中,通过将1μL的第一股产物加入9μL无核酸酶水中,创建第一股产物的1:10稀释。将稀释放在一边,用于前 Seq QC 测定。
- 将21μL的无核酸酶水加入剩余的第一股产物中。将第一股产物的40 μL和无核酸酶水转移到第二股试剂带管(置于预冷却铝块中)。上下移液6~8次混合。向下旋转,将整个体积转移到 96 孔 PCR 板,并密封使用 RT 薄膜。
- 将板插入热循环器块中,用压缩垫盖住,并合上盖子。运行热循环器程序:16 °C 60 分钟,75 °C 20 分钟,4 °C 保持(加热盖)。
注: 这是一个可接受的停止点。板可以储存在-20°C。
- Seq 前质量控制
注:此质量控制 (QC) 测定主要用于验证 NTC 中的无 cDNA 合成。但是,数据也可能在分析故障排除中提供信息。例如,如果样本具有良好的前 Seq QC 值,但检测指标较差(见下文),则它可能表示检测运行中存在问题,因此需要重复。- 运行每个示例和以重复的方式运行 NTC。还包括在SeqQC运行反应NTC,这是无核酸酶水(也运行重复)。对光学 96 孔板的每个适用孔,添加 5 μL 的测定主混合物、1 μL 的 10x VCP 底漆和步骤 1.4.1 中创建的第一股产物的 1:10 稀释的 4 μL。
- 使用 RT 薄膜密封板,向下旋转,并加载到定量 PCR (qPCR) 仪器中。运行程序:前安培:1 周期 95 °C 20 s,安培:35 周期 95 °C 3 s (4.4 °C/s 斜坡速率) = 60 °C 30 s (2.2 °C/s 斜坡速率)。
- 确认测定NTC和反应NTC均无周期阈值(Ct)。
注:如果在测定 NTC 中未观察到 Ct,则在测定中将不再结转。在反应 NTC 中观察 Ct 值需要重复 Seq 前质量控制测定。在测定NTC中观察Ct表明样品在测定前的某个点受到污染,因此需要启动整个测定(所有样品)。适当质量样品的Seq前QC Ct值应低于30(较低的Ct值与更多的产品相关,因此更高质量的RNA)。高于 30 的值不是故障的绝对指标,这些样本应在检测中继续。然而,应仔细审查从这些样本派生的所有数据,特别是在不调用融合的情况下。
- 端端维修和珠子纯化
- 将第二股产品40 μL转移到端部修复试剂带管(置于预冷却铝块中)。通过上下移液混合 6~8 次,向下旋转并放入热循环器块(保持加热盖打开),然后运行热循环器程序:25 °C 30 分钟,保持 4 °C。
- 从 4°C 中取出纯化珠,并允许平衡到室温。构成足够的70%乙醇,以持续整个图书馆准备。涡珠在使用前就已发出,并将 100 μL 移入 U 底板的适当数量的孔中。
注:每运行 8 个样品,需要 20 mL 的 70% 乙醇。 - 将整个卷端维修产品添加到珠子中。上下移管6~8次,在室温下混合孵育5分钟,随后在磁铁上孵育5分钟。
- 去除并丢弃上清液,用30s的孵育进行两次200μL 70%乙醇处理。最后洗涤后去除所有70%乙醇,让空气干燥5分钟。
- 从磁铁中取出并重新悬浮在 22 μL 的 10 mM Tris HCl pH HH 8.0 中。孵化出磁铁3分钟,随后在磁体上孵育2分钟。立即继续连接步骤 1。
- 结扎步骤 1 和珠子纯化
- 将 20 μL 从末端修复珠净板(注意不要干扰珠粒)转移到连接步骤 1 带管(放置在预冷却铝块中)。通过上下移液 6~8 次混合,向下旋转并将整个体积转移到 96 孔 PCR 板中。
- 将板插入热循环器块中,盖上压缩垫和合盖。运行热循环器程序:37 °C 15 分钟,4 °C 保持(加热盖)。
- 从 4°C 中取出纯化珠,并允许平衡到室温。涡珠在使用前就已发出,并将 50 μL 移入 U 底板的适当数量的孔中。
- 将整个结扎步骤 1 产品添加到珠子中。上下移管6~8次,在室温下混合孵育5分钟,随后在磁铁上孵育5分钟。
- 去除并丢弃上清液,用30s的孵育进行两次200μL 70%乙醇处理。最后洗涤后去除所有70%乙醇,让空气干燥5分钟。
- 从磁铁中取出并重新悬浮在 42 μL 的 10 mM Tris HCl pH HH 8.0 中。孵化出磁铁3分钟,随后在磁体上孵育2分钟。立即继续连接步骤 2。
- 结扎步骤 2 和珠子纯化
- 从 4°C 存储中取出分子条形码 (MBC) 适配器带管试剂。MBC 适配器条的正确编号至关重要,因为此时添加了特定于样本的索引。将管水平放置,铰链放在背面,并使用永久标记标记管 1、2、3...从左到右出于排序目的,记录特定于样本的索引也至关重要(必须在序列器工作表中输入它们)。
- 将 40 μL 从结扎步骤 1 珠子净化板(注意不要干扰珠粒)转移到 MBC 适配器带管(放置在预冷却铝块中)。上下移液6~8次混合。
- 向下旋转,并将整个体积转移到结扎步骤 2 试剂带管(也放置在预冷却铝块中)。通过上下移液 6~8 次混合,向下旋转并放置在热循环器块中。关闭加热盖后,运行热循环器程序:22 °C 5 分钟,4 °C 保持。
注:这是一个安全停止点,样品可储存在-20°C。 - 从 4 °C 存储中取出结扎清理珠,并允许平衡到室温。准备 1 mL 新鲜 5 mM NaOH。
- 涡旋结扎清理珠子,并将50μL添加到一组新的PCR带管中。在磁铁上孵育1分钟。1分钟孵育后去除并丢弃上清液。从磁铁中取出带状管,通过上下移液 6~8 次,在 50 μL 的结扎清理缓冲液中重新悬浮。
- 将结扎步骤 2 产品的整个体积转移到结扎清理珠条管中。通过涡旋混合样品,在室温下孵育5分钟。再次,通过涡旋混合样品,并在室温下孵育5分钟。第二次5分钟孵育后,通过涡旋混合样品,短暂旋转,在磁铁上孵育1分钟。
- 清除并丢弃上清液。添加200 μL的结扎清理缓冲液和涡旋,以重新挂起。执行快速旋转,并在磁铁上放置1分钟。再次使用结扎清理缓冲液进行第二次洗涤。
- 使用结扎清理缓冲液进行两次洗涤后,使用超纯水执行相同的洗涤。在超纯水洗涤后,将珠子重新悬浮在 20 μL 的 5 mM NaOH 中,并转移到 96 孔 PCR 板。将板放入带压缩垫的热循环器块中,运行热循环器程序:75 °C 10 分钟,4 °C 保持(加热盖)。
- 样品冷却至 4°C 后,将 PCR 板向下旋转。将板放在磁铁上至少 3 分钟,然后立即转到第一个 PCR。
- 第一 PCR 和珠子纯化
- 从 4°C 存储中取出第一个 PCR 试剂带管,并放入预冷却铝块中。此外,将 GSP1 引物从 -20°C 中去除,并允许与室温平衡。
- 将 2 μL 的 GSP1 引体添加到第一个 PCR 试剂带管的每个井中。将结扎 2 清理产物的 18 μL 转移到第一个 PCR 试剂条管,并通过上下移液 6~8 次进行混合。
- 向下旋转并转移到 96 孔 PCR 板。将板放入带压缩垫的热循环器块中并运行热循环器程序:95 °C 3 分钟,15 圈 95 °C 30 s = 65 °C 5 分钟(100% 斜坡率),72 °C 3 分钟,4 °C 保持(加热盖)。
注:这是一个安全的停止点,样品可以在4°C过夜或-20°C储存,用于长期储存。 - 从 4°C 中取出纯化珠,并允许平衡到室温。涡珠在使用前就已发出,并将 24 μL 移入 U 底板的适当数量的孔中。
- 将第一个PCR产物的20μL转移到24μL的珠子。上下移管6~8次,在室温下混合孵育5分钟,随后在磁体上孵育2分钟。
- 去除并丢弃上清液,用30s的孵育进行两次200μL 70%乙醇处理。最后洗涤后去除所有70%乙醇,让空气干燥2分钟。
- 从磁铁中取出并重新悬挂 24 μL 的 10 mM Tris HCl pHH 8.0 中的磁珠。孵化出磁铁3分钟,随后在磁体上孵育2分钟。立即转到第二个 PCR。
- 第二PCR和珠子纯化
- 从 4°C 中取出第二个 PCR 试剂带管,并放入预冷却铝块中。由于此时添加了特定于样品的索引,因此对第二个 PCR 带管的正确编号至关重要。将管水平放置,铰链放在背面,并使用永久标记标记管 1、2、3...从左到右此外,将 GSP2 底漆从 -20°C 中去除,并允许与室温平衡。
注: 出于排序目的,记录特定于样本的索引也至关重要(必须在序列器工作表中输入它们)。 - 在第二个PCR试剂带管的每个井中加入2μL的GSP2引水剂。将第一个PCR清理产物的18μL转移到第二个PCR试剂带管,通过上下移液6~8次混合。
- 向下旋转并转移到 96 孔 PCR 板。将板放入带压缩垫的热循环器块中并运行热循环器程序:95 °C 3 分钟,18 循环 95 °C 30 s = 65 °C 5 分钟(100% 斜坡率),72 °C 3 分钟,4 °C 保持(加热盖)。
注:这是一个安全的停止点,样品可以在4°C过夜或-20°C储存,用于长期储存。 - 从 4°C 中取出纯化珠,并允许平衡到室温。涡珠在使用前就已发出,并将 24 μL 移入 U 底板的适当数量的孔中。
- 将 20 μL 的第二个 PCR 产物转移到珠子上。上下移管6~8次,在室温下混合孵育5分钟,随后在磁体上孵育2分钟。
- 去除并丢弃上清液,用30s的孵育进行两次200μL 70%乙醇处理。最后洗涤后去除所有70%乙醇,让空气干燥2分钟。
- 从磁铁中取出并重新悬挂 24 μL 的 10 mM Tris HCl pHH 8.0 中的磁珠。孵化出磁铁3分钟,随后在磁体上孵育2分钟。将第二个 PCR 清理产物的 20 μL 转移到新的 96 孔 PCR 板。
注:这是一个安全的停止点,库可以存储在-20°C进行长期存储,或者立即进行库定量。
- 从 4°C 中取出第二个 PCR 试剂带管,并放入预冷却铝块中。由于此时添加了特定于样品的索引,因此对第二个 PCR 带管的正确编号至关重要。将管水平放置,铰链放在背面,并使用永久标记标记管 1、2、3...从左到右此外,将 GSP2 底漆从 -20°C 中去除,并允许与室温平衡。
- 库定量
- 从 -20°C 存储中取出库定量主组合和标准,并允许平衡到室温。
- 使用 10 mM Tris HCl pH 8.0 对所有库(第二个 PCR 产品)执行 1:5 稀释,然后使用 10 mM Tris HCl pH 8.05% 聚山梨酸进行串行稀释 1:199、1:199 和 20:80。最后两个稀释1:200,000和1:1,1,000,000将分别运行在三重奏。
- 在光学 96 孔板的每个孔中加入 6 μL 的主混合,然后加入 4 μL 的适当稀释或标准。向下旋转板并将其加载到 qPCR 仪器上。使用以下循环条件:1 循环 95 °C 5 分钟,35 循环 95 °C 30 s (4.4 °C/s 斜坡速率) = 60 °C 45 s (2.2 °C/s 斜坡速率)。
- 完成库定量并确定库浓度后(通过平均两个测试的稀释,使用 10 mM Tris HCl pH 8.0 将所有库标准化为 2 nM。将每个规范化库的 10 μL 组合成一个 1.5 mL 微型离心管,使库池。
- 库的排序
- 从 -20°C 存储中取出定序试剂盒,并放入去离子 (DI) 水中,至灌装管至少 1 小时。此外,从 4°C 中取出定序器试剂套件,并允许与室温平衡至少 1 小时。可在此排序平台上进行测序的最大库数为 8(其中一个必须是正控制)。
- 将 10 μL 的库池与 10 μL 的 0.2 N NaOH 结合,并在室温下孵育 5 分钟,使变性阿曲龙库 (DAL) 池。5分钟孵育后加入10μL的200mM Tris HCl pHH 7.0,然后是970μL的HT1杂交缓冲液。
- 通过组合 HT1 的 300 μL、20 pM PhiX 的 25 μL 和 DAL 池的 675 μL 来制作最终负载管。涡旋和旋转的负载管。将整个负载管的体积添加到音序器试剂盒的样品井中,并将盒装入运行 2 x 151 bp 读取的定序器中,读取 2 x 8 索引读取。
2. 数据分析
- 排序数据处理和分析
- 从 NGS 仪器下载排序指标。
- 确保排序数据属于以下范围(特定于本示例中使用的套件)。聚类密度(密度 [K/mm2]):945~1600 K;读取通过筛选器的百分比(群集 PF [%]):>90%;质量得分 (% =Q30): >85%;PhiX 对齐(对齐百分比:1.5±6.0%;PhiX 错误率(错误率 [%]):<1.0%;读取传递筛选器(读取 PF [M]):>2200 万。
注: 不符合这些指标的排序运行可能会重复。 - 查看归因于每个样本的读取百分比(即每个特定于样本的索引)。对于 PhiX 峰值值为 ±5% 和 8 个样本排序的典型运行,理想情况下,每个样本应占读取量的大约 11.9%。每个样品的可接受范围为 5-25%。如果任何样本不适合此范围,请重复库定量和排序。
- 将原始序列数据提交到分析算法
注: ArcherDx 分析的 4.1.1.7 版本在此处介绍。在此示例中,分析软件部署为内部服务器上运行的"虚拟机"。要同时分析每个样本,需要一个中央处理单元 (CPU) 和 12 GB 随机存取内存 (RAM)(通常需要 8 个 CPU 和 96 GB RAM 同时处理 8 个样本)。处理通常需要 3~8 小时。- 在分析系统内使用默认分析设置,但 MIN_AVERAGE_UNIQUE_RNA_START_SITES_PER_GSP2_CONTROLS(从 10 更改为 20)和 READ_DEPTH_高检(设置为 0 以防止下采样)除外。
- 要启动分析作业,请单击在用户界面中执行分析,提交作业的名称,然后选择必要的 FASTQ 文件(确保为每个示例选择读取 [R1 和 R2])。
- 选择RNA分析类型的RNA融合,平台的亮片(配对),目标区域的FusionPlex固体肿瘤面板。然后单击提交分析。
- 解说数据解释
- 打开分析系统的用户界面并选择所需的作业。选择正控制样本。确保已检测到所有预期的融合和致致异种,并列在"强证据"选项卡中。
注: 如果在给定的检测运行中未检测到阳性控制中的任何跟踪融合,则它可能表示该运行中存在问题,这需要重复(从测定开始)。 - 单击"读取统计信息"选项卡,检查运行中每个临床样本的读取统计信息。每个样本应至少由 100 万个总片段表示。如果小于 100 万,则重新排序库,并考虑重新量化,以确保初始量准不异常高。
注:质量好的样品一般会显示在目标 % >85%, RNA分子仓应为 >20,000,并包含 >30% 的读取。但是,未能满足这些指标不会自动触发示例失败。 - 根据GSP2 控制值检查平均唯一起始站点。
注:此值是从引物到四个内务管理基因的测序复杂性的度量。此指标是样本中 RNA 质量的关键决定因素(如果预计在样本中表示的基因测序较差,则对检测表达基因融合的能力的信心较低)。此指标的截止值为 20。如果任何样本显示的值小于 20,则如果未发现高置信融合,则必须将样本的结果报告为无信息。此指标的状态也可以在运行的摘要页中确定(状态将列为融合 QC:通过或融合 QC:唯一 RNA GSP2 控制起始站点数量低,具体取决于该值是否大于或小于 20)。如果确定为真实值,仍可报告未通过此质量控制指标的样本中的高置信度融合(见下文)。通常,使用此指标的较高的 QC 分数与较低的 PreSeq Ct 分数相关,如预期的那样(图 2)。
- 打开分析系统的用户界面并选择所需的作业。选择正控制样本。确保已检测到所有预期的融合和致致异种,并列在"强证据"选项卡中。
- 融合呼叫解释
- 在"强证据"选项卡下仔细审查每个所谓的融合(系统调用的大多数强证据融合都是伪性的)。也扫描弱证据融合箱,虽然存在非文物融合在此bin是一个极其罕见的事件。要评估融合的有效性,首先请注意读取 (+/%)和"开始站点"指标。
注: 通常,对所谓的融合的信心会随着这些指标的增加而增加。由少于 5 个起始站点支持且支持引物中读取量少于 10% 的融合应视为高度可疑的伪影。 - 记下"筛选器"列中显示的图标。
注: 其中几个图标会提醒用户工件调用的潜在源。在这些事件中经常出现(主要发现在称为融合的弱证据箱中)是合作伙伴已知参数或按顺序显示彼此相似(表示可能错误启动或错误对齐)的实例。当支持融合的读取包含高错误率,表明与参考基因组的映射不佳,并且这与一个不同的图标相关联时,就会发生另一个常见的工件融合调用源。转录通读事件通过另一个图标标识。这些是常见的,通常被忽略。用户界面中还使用了其他几个图标,但所有图标的完整描述超出了本文的范围。通常无需进一步调查即可忽略的常见工件包括: ADCK4-NUMBL、 SYN2-PPAG、DGKG-ETV5、ETV6-AXL、ETV1-ERG、ETV4-ETV1、FGFR3-PDGFRB、EGFR-NTRK1、RAF1-RET、ALK-TFEB、NOTCH1-RET、RELA-RET、NTRK3-ALK、BRAF-ADAMT8、和FCGR2C-MAST。 - 单击用户界面中的可视化链接,将用户带到基于 Web 的 JBrowse 视图,查看单个融合支持读取的堆堆,从而可视化每个潜在融合的支持读取。确认读取通常无不匹配(尽管预期会有一些噪声),读取的很大比例(理想情况下为 >30 基)与融合伙伴对齐,并且序列紧邻基因之间的断点和引结绑定网站没有插入或删除。确认对齐的序列包括支持融合读取的引出剂的引出结合序列的 3' 部分(如果不包括 3' 部分,则可能表示吸油错误)。
- 如果两个基因的编码序列都涉及融合,请确保3'的伙伴保持在帧内。单击界面中的"翻译"链接(这将给每个参考序列组合提供"真"或"假"状态),并通过检查 中的调用断点来手动确认融合在帧中。基因组浏览器。通过将鼠标悬停在融合原理图中的红点上,可以确定所谓的断点。
注:由于大多数(但不是全部)合法融合的基因组断点发生在电子区域,导致整个外子拼接在一起,因此通常以更高的程度看待融合,其中外向边界构成两个伙伴的断点信心。然而,由于在融合中有许多公开的中外断点的例子,因此在解释融合时不应将之用作绝对标准。 - 对于每次融合,手动确保与断点相邻的序列与每个伙伴的下一个预期连续基础不一致。在基因组浏览器中检查所有可能的连续外场。
注:由于两个基因伙伴之间的同源,人工融合的常见来源是错位或错位,系统并不总是通过上述图标调用。
- 在"强证据"选项卡下仔细审查每个所谓的融合(系统调用的大多数强证据融合都是伪性的)。也扫描弱证据融合箱,虽然存在非文物融合在此bin是一个极其罕见的事件。要评估融合的有效性,首先请注意读取 (+/%)和"开始站点"指标。
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Representative Results
如图3所示,图4和图5是分析用户界面的屏幕截图,展示了肺腺癌样本的结果。在图 3中,示例摘要(上图)显示了所谓的强证据融合,以及 QC 状态(以红色圈)。ADCK4-NUMBL融合(其中列出了 3 个等形)会立即被忽略,因为它是一个持久的转录直读事件(由列表旁边的断开的圆圈图标记录)。图 3的底部是"读取统计信息"页的屏幕截图。信息特别丰富的指标以绿色圈。确定样本的通过/未通过性质的关键质量控制指标以红色突出显示(这是上述摘要中指示通过/失败状态的指标)。如果此值低于 20,则负融合结果将被视为"不信息"。图 4和图 5是融合原理图(上图)的屏幕截图(上图)和 JBrowse 支持两个融合的视图(下图),需要进一步调查。KIF5B-RET融合 (图 4) 演示了大量支持读取、支持融合的引信的高读取百分比以及大量起始站点。此外,融合伙伴(KIF5B)的几个连续外在包含在对齐中,聚变被验证为在帧中,并且支持融合的读取通常没有不匹配。由于这些原因,融合被认为是真实和可报告的。LOC101927681-PDGFRB融合 (图 5) 演示了较低的支持指标。此外,到合作伙伴的读取映射部分相对较短,并且包含较高的错误率,这强烈暗示了不对齐和工件融合调用。最后,包括PDGFRB的电子序列,进一步暗示了一个伪影(大多数,但不是全部,合法融合仅由映射到两个基因的编码区域的序列组成)。由于这些原因,这种融合被视为工件,不可报告。
图 1:AMP 方法的原理表。传统的扩因介导靶浓缩方法受限于所有聚变伙伴都需要引物这一事实。因此,不会检测到新的融合伙伴。在 AMP 中,相反的引种特定于适配器,因此检测到新的伙伴。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:PreSeq QC分数与后测序质量控制之间的相关性。PreSeq Ct 和每个 GSP2 控制值的平均唯一起始站点对于 100 个样本系列进行了相关。通常,如预期的那样,低 PreSeq 分数与较高的 SS/GSP2 值相关(两者都是高质量 RNA 的指标)。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3:示例摘要和读取统计视图。顶部:用户界面中的示例摘要视图,其中列出了强证据融合。底部:用户界面中读取统计信息页的视图。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4:合法融合调用的示例。顶部:用户界面中融合原理图的视图。底部:支持融合的单个读取的 JBrowse 视图。请点击此处查看此图的较大版本。
图 5:工件融合调用的示例。顶部:用户界面中融合原理图的视图。底部:支持融合的单个读取的 JBrowse 视图。请点击此处查看此图的较大版本。
| AKT3 | EWSR1 | 凹槽1 | 普尔克卡 |
| Alk | FGFR1 | 凹槽2 | PRKCB |
| ARHGAP26 | FGFR2 | NRG1 | RAF1 |
| AXL | FGFR3 | NTRK1 | Rela |
| BRAF | FGR | NTRK2 | Ret |
| BRD3 | INSR | NTRK3 | 罗斯1 |
| BRD4 | 马ML2 | NUMBL | RSPO2 |
| Egfr | 桅杆1 | NUTM1 | RSPO3 |
| Erg | 桅杆2 | PDGFRA | 泰尔特 |
| ESR1 | 遇到 | PDGFRB | TFE3 |
| ETV1 | MSMB | PIK3CA | TFEB |
| ETV4 | 麝香 | PKN1 | 塔达 |
| ETV5 | MYB | 帕格 | TMPRSS2 |
| ETV6 | |||
| 该测定包括上述53个基因中各种外源(和一些内子)的基因特异性引源。 | |||
补充表1:在测定中包括基因特异性引源的基因清单(各种外源和内子)。
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Discussion
锚定多路PCR靶富集和库制备,然后下一代测序非常适合在临床肿瘤样本中的多路复用基因融合评估。通过专注于RNA输入而不是基因组DNA,避免了对大型和重复内子进行测序的需要。此外,由于这种方法放大基因融合,无论融合伙伴的身份,新的融合被检测到。这是临床领域的一个关键优势,在文献21、22、23、24中,通过AMP报告的可操作新基因融合已经有许多实例。 25.
由于检测基于RNA,因此在加工过程中保持样品中的RNA质量至关重要。确定哪些样本产生的RNA测序太差,无法信任负核聚变结果也至关重要。这是通过评估从引源到四个内务管理基因的测序数据来实现的。如果这些基因的测序效果不佳,则阴性融合结果将被视为不信息性。此外,鉴于测定中湿板步骤的复杂性和大量,在每次测定运行中加入融合正控制非常重要。通过这样做,通过分析控件中的预期融合事件,受损的测定运行变得明显。
与所有基于放大素的方法一样,AMP 高度依赖于单个引物性能。在评估多个基因的多个外源时,一些引源剂的性能不能像其他基因一样好,因此,用户必须知道由于引种效率低而导致的测定性能不足。此外,基于NGS的检测需要复杂的生物信息数据分析。如果所使用的算法没有经过周到的设计,则很可能出现假阴性和误报结果。用户手动检查分析算法调用的所有基因融合非常重要。
随着在临床肿瘤标本中评估的可操作基因融合的不断增加,像 AMP 这样的多路化检测的使用将继续在临床实验室中使用。该技术的未来应用可能侧重于在单个检测中结合融合和突变评估。无论采用何种分子测定方法,用户必须始终了解测定限制,并应始终建立质量控制指标以指导数据解释。
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Disclosures
D.L.A.从拜耳肿瘤学、基因泰克、艾伯维和布里斯托尔迈尔斯斯奎布公司收取了咨询费。K.D.D 从 ArcherDx 那里获得了赞助的旅行。
Acknowledgments
这项工作得到了科罗拉多大学分子病理学共享资源(国家癌症研究所癌症中心支持赠款No.P30-CA046934)和科罗拉多个性化医学中心。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mM Tris HCl pH 8.0 | IDT | 11-05-01-13 | Used for TNA dilution |
| 1M Tris pH 7.0 | Thermo Fisher | AM9850G | Used in library pooling |
| 25 mL Reagent Reservoir with divider | USA Scientific | 9173-2000 | For use with multi-channel pipetters and large reagent volumes |
| 96-well TemPlate Semi-Skirt 0.1mL PCR plate-natural | USA Scientific | 1402-9700 | Plate used for thermocycler steps |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | Used in purification after several assay steps |
| Agencourt Formapure Kit | Beckman Coulter | A33343 | Used in TNA extraction |
| Archer FusionPlex Solid Tumor kit | ArcherDX | AB0005 | This kit contains most of the reagents necessary to perform library preperation for Illumina sequencing (kits for Ion Torrent sequencing are also available) |
| Cold block, 96-well | Light Labs | A7079 | Used for keeping samples chilled at various steps |
| Ethanol | Decon Labs | DSP-MD.43 | Used for bead washes |
| Library Quantification for Illumina Internal Control Standard | Kapa Biosystems | KK4906 | Used for library quantitation |
| Library Quantification Primers and ROX Low qPCR mix | Kapa Biosystems | KK4973 | Used for library quantitation |
| Library Quantification Standards | Kapa Biosystems | KK4903 | Used for library quantitation |
| Magnet Plate, 96-well (N38 grade) | Alpaqua | A32782 | Used in bead purificiation steps |
| MBC Adapters Set B | ArcherDX | AK0016-48 | Adapters that contain sample-specific indexes to enable multiplex sequencing |
| Micro Centrifuge | USA Scientific | 2641-0016 | Used for spinning down PCR tubes |
| MicroAmp EnduraPlate Optical 96 well Plate | Thermo-Fisher | 4483485 | Used for Pre-Seq QClibrary quantitation |
| Microamp Optical Film Compression Pad | Applied Biosystems | 4312639 | Used for library quantitation |
| Mini Plate Spinner | Labnet | MPS-1000 | Used for collecing liquid at bottom of plate wells |
| MiSeq Reagent Kit v3 (600 cycle) | Illumina | MS-102-3003 | Contains components necessary for a MiSeq sequencing run |
| MiSeqDx System | Illumina | NGS Sequencing Instrument | |
| Model 9700 Thermocycler | Applied Biosystems | Used for several steps during assay | |
| nuclease free water | Ambion | 9938 | Used as general diluent |
| Optical ABI 96-well PCR plate covers | Thermo-Fisher | 4311971 | Used for Pre-Seq QClibrary quantitation |
| PCR Workstation Model 600 | Air Clean Systems | BZ10119636 | Wet-bench assay steps performed in this 'dead air box' |
| Proteinase K | Qiagen | 1019499 | Used in TNA extraction |
| QuantStudio 5 | Applied Biosystems | LSA28139 | qPCR instrument used for PreSeq and library quantitation |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32855 | Use for determing RNA concentration in TNA samples |
| RNase Away | Fisher | 12-402-178 | Used for general RNase decontamination of work areas |
| Seraseq FFPE Tumor Fusion RNA Reference Material v2 | SeraCare | 0710-0129 | Used as the assay positive control |
| Sodium Hydroxide | Fisher | BP359-212 | Used in clean-up steps and for sequencing setup |
| SYBR Green Supermix | Bio Rad | 172-5120 | Component of PreSeq QC Assay |
| TempAssure PCR 8-tube Strips | USA Scientific | 1402-2700 | Used for reagent and sample mixing etc. |
| Template RT PCR film | USA Scientific | 2921-7800 | Used for covering 96-well plates |
| U-Bottom 96-well Microplate | LSP | MP8117-R | Used during bead purification |
References
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