Summary
GPCR-β-vanger-interacties zijn een opkomende veld in GPCR-geneesmiddelen ontdekking. Nauwkeurige, nauwkeurige en eenvoudig te stellen methoden zijn nodig om dergelijke interacties in levende systemen te monitoren. We vertonen een structurele complementatie test om de interacties van GPCR-β-de-vanger in real-time levende cellen te monitoren, en deze kan worden uitgebreid naar elke GPCR.
Abstract
Interacties tussen G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCRs) en β-vanger zijn vitale processen met fysiologische implicaties van groot belang. Momenteel is de karakterisering van nieuwe geneesmiddelen naar hun interacties met β-vanger en andere cytosolische eiwitten zeer waardevol op het gebied van GPCR-geneesmiddelen ontdekking, met name tijdens de studie van GPCR-bevooroordeeld agonisme. Hier tonen we de toepassing van een nieuwe structurele complementatie test om nauwkeurig de receptor-β-vanger in interacties in real time levende systemen te bewaken. Deze methode is eenvoudig, nauwkeurig en kan gemakkelijk worden uitgebreid naar elke GPCR van belang en ook heeft het voordeel dat het overkomt onspecifieke interacties als gevolg van de aanwezigheid van een lage expressie promotor aanwezig zijn in elk vector systeem. Deze structurele complementatie test biedt belangrijke kenmerken die een nauwkeurige en nauwkeurige controle van receptor-β-vanger interacties mogelijk maken, waardoor het geschikt is in de studie van bevooroordeeld agonisme van elk GPCR-systeem en GPCR c-Terminus ' fosforylering codes ' geschreven door verschillende GPCR-kinases (GRKs) en post-translationele modificaties van afvallen die het receptor-β-afradercomplex stabiliseren of destabiliseren.
Introduction
Gpcrs vertegenwoordigen het doel van bijna 35% van de huidige drugs in de markt1,2 en een duidelijk begrip van hun farmacologie is cruciaal in de ontwikkeling van nieuwe therapeutische geneesmiddelen3. Een van de belangrijkste aspecten bij de ontdekking van GPCR-geneesmiddelen, in het bijzonder tijdens de ontwikkeling van partijdige agonisten, is de karakterisering van roman liganden naar receptor-β-dein interacties4 -en β-dein interacties met andere cytosolische eiwitten, zoals Als clathrin5.
Er is gedocumenteerd dat de afhankelijke signalering van β-vanger een belangrijke rol speelt bij neurologische aandoeningen zoals bipolaire stoornis, ernstige depressie en schizofrenie6 en ook ernstige bijwerkingen in sommige medicijnen zoals morfine7.
De huidige methoden die worden gebruikt om deze interacties te bewaken, vertegenwoordigen meestal niet de werkelijke endogene niveaus van de eiwitten in studie, in sommige gevallen vertonen ze een zwak signaal, fotobleaching en afhankelijk van de GPCR kan het technisch lastig zijn om8in te stellen. Deze roman Structural complementatie test maakt gebruik van lage expressie Promoter vectoren om endogene fysiologische niveaus na te bootsen en biedt een hoge gevoeligheid in vergelijking met de huidige methoden9. Met behulp van deze aanpak, was het mogelijk om te karakteriseren Galanin receptor-β-arrestin1/2 en ook β-arrestin2-clathrin interacties10. Deze methodologie kan op grote schaal worden gebruikt voor elke GPCR van bijzonder belang waar β-vanger een belangrijke fysiologische functie speelt of de signalering relevant is bij sommige ziekten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ontwerp strategie voor primer
- Ontwerp primers om genen van belang te introduceren in pBiT 1.1-C [TK/LgBiT], pBiT 2.1-C [TK/SmBiT], pBiT 1.1-N [TK/LgBiT] en pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] vectoren.
- Selecteer ten minste één van deze drie locaties als een van de twee unieke beperkings enzymen die nodig zijn voor richtings klonen vanwege de aanwezigheid van een in-frame stop codon die de multicloning-site verdeelt zoals weergegeven in Figuur 111.
- Neem de nucleotide sequentie op in de primers zoals weergegeven in tabel 1 om de linker residuen te coderen zoals weergegeven in rood in tabel 211.
- Voor pBiT 1.1-C [TK/LgBiT] en pBiT 2.1-C [TK/SmBiT] vectoren, zorg ervoor dat de 5 ́ primer een ATG codon en een krachtige Kozak consensussequentie (GCCGCCACC) bevat.
- Voor pBiT 1.1-N [TK/LgBiT] en pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] vectoren, zorg ervoor dat de 3 ́ primer een stop codon bevat.
Notes: elke vector bevat de HSV-TK-promotor om niet-specifieke associatie te minimaliseren en experimentele artefacten te verminderen, ook elke vector heeft een expressie cassette voor ampicillaire resistentie bij bacteriën.
2. PCR
- Instellen en uitvoeren van PCR-reacties om te versterken het insert DNA van het gen van belang met behulp van de primers ontworpen uit stap 1. Het is belangrijk om een high-fidelity DNA-polymerase te gebruiken om mutaties te minimaliseren.
- Gebruik exact de volgende volgorde om 50 μL PCR-reactie te bereiden. Voeg 35,5 μL gedistilleerd water, 5 μL 10 x polymerase buffer, 5 μL dNTP-mengsel (2,5 mM per stuk), 1 μL plasmide sjabloon (200 ng/μL), 1,25 μL voorwaartse en omgekeerde primers (10 μM) en 1 μL High-Fidelity polymerase (5 U/μL) toe.
- Met behulp van een Thermocycler het volgende DNA-versterkings programma instellen.
- Denature bij 95 °C gedurende 5 min.
- Herhaal 25 keer de volgende thermische cyclus: 95 °C gedurende 30 s, 60 °C gedurende 1 minuut, 72 °C gedurende 2 minuten per 1 KBP om te worden versterkt.
- Voer een laatste verlenging uit bij 72 °C gedurende 10 minuten.
- Houd de monsters bij 4 °C binnen de Thermocycler.
Opmerking: het wordt ten zeerste aanbevolen om een high-fidelity polymerase te gebruiken om puntmutaties te minimaliseren, vooral die zich voordoen tijdens de versterking van lange sequenties. Naarmate de ampliconlengte voor temp langer wordt, neemt de mate van nauwkeurigheid bij de replicatie van het DNA af. Voor de PCR-reactie, kies de gloeien temperatuur op basis van de smelttemperatuur van de regio waar de oligos direct hybridiseren met de DNA-template en niet met alle volgorde van de primer.
- PCR-product zuivering
- Isoleer het PCR-product uit de rest van de PCR-reactie met behulp van een Kit van een fabrikant van voorkeur12. Het PCR-product is nu klaar voor een beperking van de spijsvertering.
3. DNA-spijsvertering
- Voor de PCR-product bereiding wordt 50 μL van de digestie reactie als volgt bereid.
- Voeg met een tube van 1,5 mL 12 μL gedistilleerd water toe.
- Voeg 5 μL 10x buffer toe met de beste compatibiliteit met beide restrictie enzymen.
- Vanaf stap 2,4 Voeg 30 μL PCR-product toe
- Voeg ten slotte 1,5 μL van elk restrictie-enzym toe.
- Meng kort door Vortex en inincuberen bij 37,5 °C 's nachts.
- Voor de ontvanger plasmide spijsvertering bereiden 50 μL van de spijsvertering reactie als volgt:
- Voeg met een tube van 1,5 mL 23 μL gedistilleerd water toe.
- Voeg 5 μL 10x buffer toe met de beste compatibiliteit met beide restrictie enzymen.
- Voeg 15 μL van het recipiënte plasmide (200 ng/μL) toe.
- Voeg 1,5 μL van elk restrictie-enzym toe.
- Meng kort door Vortex en inincuberen bij 37,5 °C 's nachts.
Opmerking: het is belangrijk om 3 μg van het recipiënte plasmide te gebruiken om voldoende materiaal te verkrijgen na de reiniging van de DNA-agarose gel. Het is ook relevant om DNA-digestons 's nachts te laten met behulp van beide enzymen om een hoge kloon efficiëntie te verkrijgen.
4. reiniging en klonen van DNA-agarose gel
- Bereid een 1% agarose gel voor het uitvoeren van de verteerde DNA plasmide en inserts en doorgaan met het snijden van de bijbehorende bands. Zodra de corresponderende vector en insert bands zijn purified12, bepaal de DNA-concentratie met behulp van een spectrofotometer.
- Voer DNA-ligatie uit om de wisselplaat aan de ontvangende plasmide te smelten.
- Bereid ligatie reacties van ongeveer 100 ng totaal DNA inclusief 50 ng plasmide vector.
- Instellen van de ontvanger plasmide-insert ratio van ongeveer 1:3; het kan worden berekend met behulp van een vector-insert Calculator13.
- Negatieve controles parallel instellen. Bijvoorbeeld, een ligatie van het recipiënte plasmide DNA zonder enige toevoeging geeft informatie over hoeveel achtergrond van onverteerde of zelfdragende recipiënte plasmide aanwezig is.
5. transformatie van klonen
- Plaats een buis van DH5α bevoegde cellen uit de vriezer bij-80 °C en breng het onmiddellijk over op ijs gedurende 20 minuten.
- Neem na die tijd 55 μL van DH5α bevoegde cellen en voeg 4 μL ligatie reactie toe en meng door de buis te flikken en op ijs te bewaren voor 45 min.
- Plaats de buis in een waterbad eerder opgewarmd op 42 ° c voor precies 48 s en onmiddellijk krijgen de buizen terug op ijs voor nog eens 3 min.
- Voeg 600 μL Luria Bouillon (LB) medium eerder opgewarmd bij 37,5 °C en incuberen met 1 uur schudden bij 200 rpm.
- Breng 200 μL over in een agar-plaat met ampicilinin 100 μg/mL en verdeel zachtjes over het oppervlak met de vloeistof meestal geabsorbeerd.
- Incuberen de platen 's nachts om de kolonies volgende ochtend te zien. De ontvangende plasmide op de insert Plate moet significant meer kolonies hebben dan de ontvangende plasmide alleen plaat.
6. isolatie van het afgewerkte plasmide
- Kies 3-10 individuele bacteriële kolonies en breng in 1 mL LB medium dat ampicilinebevattende (100 μg/mL) bevat en inincuberen gedurende 6 uur.
- Neem 200 μL bacteriële suspensie en breng over naar 5 ml lb-medium dat dezelfde concentratie ampicilinegehalte bevat als in stap 6,1, en incubeer 's nachts bij 37,5 °c met schudden bij 200 rpm.
- Gebruik een miniprep DNA Kit zuivering, uitvoeren miniprep DNA-zuiveringen met behulp van 5 mL LB geteeld 's nachts volgens de instructies van de fabrikant14.
- Om succesvolle ligaties te identificeren, stelt u PCR-reacties op dezelfde manier in als in sectie 2 met behulp van het DNA dat is verkregen uit stap 6,3 als een sjabloon met dezelfde primers als in punt 2 tijdens de eerste PCR. Positieve klonen zullen PCR-producten produceren met de overeenkomstige grootte.
- Na grote prep DNA zuivering van de positieve klonen, voeren een diagnostische beperking vertering van 500 ng van gezuiverd DNA met de enzymen gebruikt tijdens de kloon stap en voer de verteerde producten op een 1% agarose gel. Er moeten twee bands zijn: één van de grootte van de vector en één van de grootte van de nieuwe insert.
- Controleer de construct volgorde door sequentiëren met behulp van de volgende primers: Forward 5 '-aaggtgacgcgtgtggcctcgaac-3 ' en reverse 5 '-gcatttttttcactgcattctagtt-3 '.
Opmerking: wanneer DNA wordt gerepliceerd met behulp van PCR, is er altijd de mogelijkheid van fouten tijdens de versterking zelfs bij het gebruik van een high-fidelity polymerase, daarom is het zeer belangrijk om de volgorde van de laatste constructies.
7. transfectie en eiwit expressie
- In een eerder poly-L-lysine-gecoate witte 96 goed plaat, voer celseeding één dag vóór transfectie op 2,5 x 104 cellen per goed met behulp van dulbecco's gemodificeerde eagle's medium aangevuld met 10% foetaal runderserum, 100 U/ml Penicillaire G, en 100 μg/ mL streptomycine.
- Gebruik alleen de 60 binnenste putjes om het potentieel voor thermische hellingen over de plaat en de randeffecten van verdamping te minimaliseren. Voeg 200 μL steriel gedestilleerd water toe aan de 36 buiten putten en 150 μL in de ruimten tussen putjes en inincuberen gedurende een nacht bij 37,5 °C en 5% van CO2.
- De volgende ochtend voeren transfectie met behulp van 100 ng van totaal DNA (50 ng elke construct).
- Stel vier verschillende plasmide combinaties (receptor: β-vanger) in volgens Figuur 2b.
- Gebruik voor elke plasmide combinatie 20 μL gemodificeerde Eagle's minimale essentiële Media gebufferd met HEPES met 0,3 μL lipidische transfectiereagens per put.
- Voeg 20 μL lipidische transfectiereagens-DNA-mengsel toe aan elk goed en meng de plaat in cirkels gedurende 10 sec.
- Verander vers medium na 6 uur incubatie bij 37,5 °C en 5% CO2.
- Incuberen de plaat voor 24 uur bij 37,5 °C en 5% CO2.
8. monitoring receptor-β-arrestin1/2 interacties in HEK293 cellen
- Aspirate medium en voeg 100 μL gemodificeerde Eagle's minimale essentiële Media gebufferd met HEPES aan elk goed en laat de plaat stabiliseren bij RT voor 10 min.
- Bereid het furimazine substraat door 1 volume van 100x substraat te combineren met 19 volumes van LCS verdunnings buffer (een 20-voudige verdunning)11, waardoor een 5x voorraad wordt gemaakt om te mengen met celkweekmedium.
- Voeg 25 μL 5x furimazine toe aan elk goed en meng in kringen zachtjes gedurende 10 sec.
- Meet de luminescentie gedurende 10 minuten voor signaal stabilisatie bij RT.
Opmerking: door het gebruik van dit basislijn signaal om de respons van elk goed te normaliseren, zal het bijdragen aan het verminderen van variabiliteit veroorzaakt door verschillen in het aantal cellen per put, ook verschillen in Transfectie-efficiëntie, enz. Eenmaal berekend, gemiddelde de genormaliseerde reactie van repliceren putten voor een bepaalde medicamenteuze behandeling. - Bereid 13,5 x ligand-oplossing in gemodificeerde Eagle's minimale essentiële Media gebufferd met HEPES.
- Voor experimenten bij kamertemperatuur met 10 μL 13,5 x ligand toevoeging, voeg de verbindingen met behulp van injectoren of een multichannel pipet en meng de plaat met de hand of met behulp van een rondschudder (20 s bij 200 rpm).
- Voor experimenten met 37,5 °C met 10 μL 13,5 x ligand toevoeging, gebruik injectoren om verbindingen te doseren en meng met behulp van het instrument orbitale Shaker. In het geval van het niet gebruiken van injectoren, verwijder de plaat van de luminometer, voeg de liganden en meng de plaat met de hand of met behulp van een rondschudder (20 s bij 200 rpm).
Opmerking: gebruik injectoren en een shaker binnen het detectie-instrument om temperatuurschommelingen bij het verwijderen van de plaat van de luminometer te minimaliseren. Voor deze test kunnen standaard lichtmeters worden gebruikt. Gebruik een integratie tijd van 0,25 – 2 sec.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van de hier gepresenteerde procedure werden de interacties tussen een prototypische GPCR en twee β-vanger-isovormen gemonitord. Glucagon zoals Peptide Receptor (GLP-1R) constructies werden gemaakt met behulp van primers met NheI en EcoRI enzym restrictie sites en gekloond in de vectoren pBiT 1.1-C [TK/LgBiT] en pBiT 2.1-C [TK/SmBiT] terwijl in het geval van β-vanger, twee extra vectoren werden gebruikte pBiT 1.1-N [TK/LgBiT] en pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] met behulp van enzym beperkings sites BgIII en EcoRI in het geval van β-arrestin2 en NheI en XhoI in het geval van β-arrestin1. HEK293 cellen werden met 50 ng van GLP-1R-LgBiT/SmBiT en 50 ng van β-vanger gelabeld met LgBiT of SmBiT op de N-of C-Terminal. Vier verschillende plasmide combinaties werden gescreend (Figuur 3) en degene met het hoogste lichtgevend signaal werd gekozen voor verdere experimenten (Figuur 4). Om de EC50-waarden voor elke β-vanger te bepalen, werden dosis Responsie curves uitgevoerd met 10 μM, 1 μM, 100 nM, 10 nM en 1 nM GLP-1 ligand-concentratie (figuur 4c). Dosisrespons curven werden verkregen uit de maximale respons van elke concentratie uit de kinetische studies (Figuur 4a, 4b).
Figuur 1. Nucleotide sequenties van de multicloning sites van de vectoren gebruikt in het ontwerp van GLP-1R-β-arrestin1/2 structurele complementatie test.
Om de structurele complementatie test voor het GLP-1R-β-arrestin1/2-systeem te ontwikkelen, het was noodzakelijk om te taggen op de C-Terminal de GLP-1R met LgBiT en SmBiT met behulp van de enzym beperkingen NheI en EcoRI op de pBiT 1.1-C [TK/LgBiT] en pBiT 2.1-C [TK/SmBiT] Vector. In het geval van β-arrestin1/2 werden ze ook getagd met de LgBiT en SmBiT op de C-en N-Terminal met behulp van de enzym beperkingen BglII/EcoRI voor β-arrestin2 en NheI/XhoI voor β-arrestin1 bij de vier vectoren. Alle vectoren gebruiken de HSV-TK-promotor om niet-specifieke associatie te minimaliseren en experimentele artefacten te reduceren en elke vector bevat een expressie cassette voor ampicillaire resistentie bij bacteriën. Afbeelding aangepast aan verwijzing 11. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2. Schematische weergave van de GPCR: β-arrestin1/2 structurele complementatie test.
a) hoe werkt de structurele complementatie test van de GPCR: β-arrestin1/2 in aanwezigheid van ligand. b) de structurele representatie van de verschillende plasmide combinaties voor de GPCR-en β-vanger-isovormen gelabeld met lgbit of smbit. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3. GLP-1R/β-vanger oriëntatie screening.
Om de hoogste gevoeligheid te verkrijgen werden 4 verschillende plasmide combinaties uitgedrukt gedurende 24 uur na transfectie. In bijna alle verschillende plasmide combinaties (a-c) werden lichtgevende signalen waargenomen, met uitzondering van slechts één GLP-1R: β-vanger in oriëntatie (d). De resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde ± S.E.M. van twee experimenten die in tweevoud worden uitgevoerd; elk duplicaat werd gemiddeld voor de berekening van de S.E.M. De pijlen geven de tijd aan waarop de cellen werden behandeld met GLP-1 bij een uiteindelijke concentratie van 10 μM. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4. GLP-1R-β-arrestin1/2 interacties zijn dosisafhankelijke manier.
Dosisafhankelijke ligand relatie van β-arrestin2 (a) en β-arrestin1 recruitment (b). Dosisrespons curves met differentiële werving tussen β-arrestin1 en β-arrestin2 door GLP-1R (c). De resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde ± S.E.M. van twee experimenten die in tweevoud worden uitgevoerd; elk duplicaat werd gemiddeld voor de berekening van de S.E.M. De pijlen geven de tijd aan waarop de cellen werden behandeld met GLP-1 bij de corresponderende concentraties (10 μM, 1 μM, 100 nM, 10 nM en 1 nM, eindconcentraties). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Vector | Enzym beperking gebruikt | Primer sequentie |
| pBiT 1.1-C [TK/LgBiT]/pBiT 2.1-C [TK/SmBiT] | SacI | 5 ́-XXXXXXXXGAGCTCC(Rev si)-3 ́ |
| EcoRI | 5 ́-XXXXXXXXGAATTCCC(Rev si)-3 ́ | |
| XhoI | 5 ́-XXXXXXXXCTCGAGCC(Rev si)-3 ́ | |
| pBiT 1.1-N [TK/LgBiT]/pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] | Xho | 5 ́-XXXXXXXXCTCGAGCGGT (SI)-3 ́ |
| SacI | 5 ́-XXXXXXXXGAGCTCAG(SI)-3 ́ | |
| EcoRI | 5 ́-XXXXXXXXGAATTCA(SI)-3 ́ |
Tabel 1. Sequenties van primers voor de verschillende beperkings enzym sites in de codeer volgorde van de linker voor de pBiT 1.1 en pBiT 2.1 vectoren.
SI = volgorde van belangstelling; Rev SI = omgekeerde aanvulling van de volgorde van de rente. Tabel die is aangepast aan verwijzing 11.
| Vector | Linker-sequentie | Enzym beperking gebruikt | ||
| pBiT 1.1-C [TK/LgBiT]/pBiT 2.1-C [TK/SmBiT] | SI-Glyalaglnglyasnserglyserserglycoglyglyglyserglyglyglyglysersergly-(lgbit/smbit) | SacI | ||
| SI-Glyasnserglyserserglyglyglyglyserglyglyglysersergly-(lgbit/smbit) | EcoRI | |||
| SI-Glyserserglycoglyglyglyserglyglyglyglysersergly-(lgbit/smbit) | XhoI | |||
| pBiT 1.1-N [TK/LgBiT]/pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] | (LgBiT/SmBiT)-GlyserserglycoglyglyglyserglyglyglyglyserSergly-si | XhoI | ||
| (LgBiT/Smbits)-GlySerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerSerGlyGlyAlaGLN-si | SacI | |||
| (LgBiT/SmBiT)-Glyserserglyglyglyglyserglyglyglyserserglyglyalaglnglyasnser-SI | EcoRI | |||
Tabel 2. Linker aminozuur sequenties gerelateerd aan SacI, EcoRI of XhoI beperking sites in de pBiT 1.1 en pBiT 2.1 vectoren.
Rode residuen moeten worden gecodeerd door PCR-primers. Tabel die is aangepast aan verwijzing 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Met behulp van de hier gepresenteerde methode kunnen interacties tussen GPCR en β-arrestin1/2 worden bewaakt in real time levende systemen met deze GPCR-β-vanger in structurele complementatie test. In dit verband waren we in staat om de differentiële β-vanger in de rekrutering tussen de twee β--vanger-isovormen te observeren door de GLP-1R (een prototypische klasse B GPCR), we observeerden ook een dissociatie van de receptor-β-vanger in complex enkele minuten na het bereiken van de maximale lichtgevende signaal.
Om de beste gevoeligheid in het structurele complementatie testsysteem te hebben, werd het gescreend met vier verschillende ruimtelijke oriëntaties tussen de receptor en elke β-vanger isovorm en de ene met het hoogste lichtgevende signaal werd gebruikt voor posterieure onderzoeken, zoals dosisrespons stimulatie Curves (Figuur 4). Met behulp van deze methodologie was het mogelijk om de interacties van receptor-β-vanger te karakteriseren met behulp van een GPCR van hoge therapeutische waarde bij endocrinologische ziekten zoals diabetes mellitus15. Op dezelfde manier kan deze strategie eenvoudig worden aangepast aan elke GPCR door eenvoudige tagging van de GPCR van belang met LgBiT of SmBiT op de C-Terminal en het gebruik van de β-arrestin1/2 constructies beschreven hier en het blijkt als een krachtig alternatief voor de huidige methodologieën zonder de noodzaak van een complex opgezet waar de overlapping tussen de donor en acceptor een obstakel kan zijn, zoals in sommige gevallen van BRET en FRET. Een ander belangrijk voordeel is dat de in dit systeem gebruikte vectoren lage uitdrukkings bevorderaar bevatten in een poging om endogene expressieniveaus na te bootsen. Met deze functie, kunnen we de mogelijkheid van niet-specifieke associaties als gevolg van hoge expressieniveaus van de receptor en/of β-vanger uit te buiten. In Figuur 3 en Figuur 4is er een duidelijk verschil in het receptor-β-vanger-complex tussen β-arrestin1 versus β-arrestin2 en ook een hogere werkzaamheid en intensiteit ten opzichte van β-arrestin1 over β-arrestin2. De screening in vier verschillende oriëntaties werd voorgesteld om de gevoeligheid van de assay te verhogen waardoor het systeem zeer gevoelig is, zelfs bij endogene expressieniveaus.
Deze methodologie is zeer ongecompliceerd om uit te voeren. Misschien is de meest kritieke stap binnen dit protocol het primer ontwerp om de receptor van belang te versterken. De gebruiker moet heel voorzichtig zijn bij het selecteren van welk restrictie-enzym te gebruiken volgens Figuur 1 en op basis hiervan om de corresponderende nucleotiden toe te voegen aan de primers (tabel 1) om de rode gemarkeerde aminozuren te coderen (tabel 2).
Een beperking van deze methodologie kan zijn dat de furimazine in een waterige oplossing zal afnemen bij of in de buurt van fysiologische pH, wat leidt tot een geleidelijke afname van de luminescentie intensiteit, onafhankelijk van elke verandering van GPCR-β-Afin-interacties16. Om deze beperking te overwinnen, moet de gebruiker altijd een normalisatie controle (met voertuig behandelde monsters) opnemen wanneer de luminescentie gedurende langere tijd continu wordt bewaakt. Het is ook belangrijk om lage concentraties van foetaal runderserum te gebruiken tijdens de bepaling, omdat het de snelheid van furimazine afbraak16kan verhogen. Een probleem dat zich tijdens de bepaling kan voordoen, is dat voor luminescente waarden voor een bekende interactie met GPCR-β-vanger geen significante toename wordt geregistreerd in vergelijking met de basislijn waarden in alle vier de verschillende plasmide combinaties. Dit kan te wijten zijn aan de lage expressie van de HSV-TK Promoter17. In dat geval is een alternatief om te subklonen van de open Lees kaders coderen LgBiT en SmBiT Fusion eiwitten in Expression vectoren met behulp van de promotor CMV. Bij het overstappen op een sterkere promotor moet optimalisatie van de hoeveelheid getransfuneerde DNA worden gedaan om de beste assay-respons te verkrijgen.
Met behulp van deze structurele complementatie test konden we met grote nauwkeurigheid de β-arrestin1/2 recruitment interacties waarnemen door een prototypische klasse B GPCR. Met behulp van deze methode, het is mogelijk om het farmacologisch karakteriseren van nieuwe geneesmiddelen van bijzonder belang gericht op GPCRs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door subsidies van het onderzoeksprogramma (NRF-2015M3A9E7029172) van de National Research Foundation of Korea (NRF), gefinancierd door het ministerie van Wetenschappen, ICT en toekomstige planning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotics penicillin streptomycin | Welgene | LS202-02 | Penicillin/Streptomycin |
| Bacterial Incubator | JEIO Tech | IB-05G | Incubator (Air-Jacket), Basic |
| Cell culture medium | Welgene | LM 001-05 | DMEM Cell culture medium |
| Cell culture transfection medium | Gibco | 31985-070 | Optimem 1X cell culture medium |
| CO2 Incubator | NUAIRE | NU5720 | Direct Heat CO2 Incubator |
| Digital water bath | Lab Tech | LWB-122D | Digital water bath lab tech |
| DNA Polymerase proof reading | ELPIS Biotech | EBT-1011 | PfU DNA polymerase |
| DNA purification kit | Cosmogenetech | CMP0112 | miniprepLaboPass Purificartion Kit Plasmid Mini |
| DNA Taq Polymerase | Enzynomics | P750 | nTaq DNA polymerase |
| Enzyme restriction BglII | New England Biolabs | R0144L | BglII |
| Enzyme restriction buffer | New England Biolabs | B72045 | CutSmart 10X Buffer |
| Enzyme restriction EcoRI | New England Biolabs | R3101L | EcoRI-HF |
| Enzyme restriction NheI | New England Biolabs | R01315 | NheI |
| Enzyme restriction XhoI | New England Biolabs | R0146L | XhoI |
| Fetal Bovine Serum | Gibco Canada | 12483020 | Fetal Bovine Serum |
| Gel/PCR DNA MiniKit | Real Biotech Corporation | KH23108 | HiYield Gel/PCR DNA MiniKit |
| Ligase | ELPIS Biotech | EBT-1025 | T4 DNA Ligase |
| Light microscope | Olympus | CKX53SF | CKX53 Microscope Olympus |
| lipid transfection reagent | Invitrogen | 11668-019 | Lipofectamine 2000 |
| Luminometer | Biotek/Fisher Scientific | 12504386 | Synergy 2 Multi-Mode Microplate Readers |
| NanoBiT System | Promega | N2014 | NanoBiT PPI MCS Starter System |
| Nanoluciferase substrate | Promega | N2012 | Nano-Glo Live Cell assay system |
| PCR Thermal cycler | Eppendorf | 6336000015 | Master cycler Nexus SX1 |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P4707-50ML | Poly-L-lysine solution |
| Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | Trysin EDTA 10X |
| White Cell culture 96 well plates | Corning | 3917 | Assay Plate 96 well plate |
References
- Sriram, K., Insel, P. A. GPCRs as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs? Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).
- Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schiöth, H. B., Gloriam, D. E. Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (12), 829-842 (2017).
- Langmead, C. J., Summers, R. J.
- Lohse, M. J., Hoffmann, C. Arrestin Interactions with G Protein-Coupled Receptors. Handbook of Experimental Pharmacology. 219, 15-56 (2014).
- Kang, D. S., et al. Structure of an arrestin2-clathrin complex reveals a novel clathrin binding domain that modulates receptor trafficking. Journal of Biological Chemistry. 284, 29860-29872 (2009).
- Park, S. M., et al. Effects of β-Arrestin-Biased Dopamine D2 Receptor Ligands on Schizophrenia-Like Behavior in Hypoglutamatergic Mice. Neuropsychopharmacology. 41 (3), 704-715 (2016).
- Zhu, L., Cui, Z., Zhu, Q., Zha, X., Xu, Y. Novel Opioid Receptor Agonists with Reduced Morphine-like Side Effects. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry. 18 (19), 1603-1610 (2018).
- Smith, J. S., Lefkowitz, R. J., Rajagopal, S. Biased signalling: from simple switches to allosteric microprocessors. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (4), 243-260 (2018).
- Dixon, A. S. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
- Reyes-Alcaraz, A., Lee, Y. N., Yun, S., Hwang, J. I., Seong, J. Y. Conformational signatures in β-arrestin2 reveal natural biased agonism at a G-protein-coupled receptor. Communications Biology. 3, 1-128 (2018).
- Promega. Nanobit Protein Protein Interaction System Protocol. , https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/101/nanobit-protein-protein-interaction-system-protocol.pdf?la=en (2019).
- Life Biomedical. HiYield Gel/PCR Fragments Extraction Kit. , https://www.lifebiomedical.com/uploads/2/4/7/2/24727678/gel_pcr_dna_fragments_extraction_kitydf_protocol_v3.0.pdf (2019).
- New England BioLabs. Ligation Calculator. , https://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation (2019).
- Cosmo Genetech. , http://www.cosmogenetech.com/cosmo/productmngr/prm11.jsp?P_BR_CD=1&P_CTG_CD=1&P_PRODUCT_CD=1&P_N_PAGE=1&P_CAT_POS= (2019).
- Baggio, L. L., Drucker, D. J. Biology of incretins: GLP-1 and GIP. Gastroenterology. 132, 2131-2157 (2007).
- ProMega. NanoGLO Endurazine and Vivazine Live Cell Substrates Technical Manual. , https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/500/nano-glo-endurazine-and-vivazine-live-cell-substrates-technical-manual.pdf?la=en (2019).
- Ali, R., Ramadurai, S., Barry, F., Nasheuer, H. P. Optimizing fluorescent protein expression for quantitative fluorescence microscopy and spectroscopy using herpes simplex thymidine kinase promoter sequences. FEBS Open Bio. 8 (6), 1043-1060 (2018).
