Summary
GPCR-β-arrestin interaksjoner er et voksende felt i GPCR narkotika funnet. Nøyaktige, presise og enkle å sette opp metoder er nødvendig for å overvåke slike interaksjoner i levende systemer. Vi viser en strukturell komplementering analysen for å overvåke GPCR-β-arrestin interaksjoner i sanntid levende celler, og det kan utvides til enhver GPCR.
Abstract
Interaksjoner mellom G-protein kombinert reseptorer (GPCRs) og β-arrestins er vitale prosesser med fysiologiske implikasjoner av stor betydning. Foreløpig karakterisering av romanen medikamenter mot deres interaksjon med β-arrestins og andre cytosolic proteiner er svært verdifull innen GPCR narkotika funnet spesielt under studiet av GPCR partisk agonism. Her viser vi anvendelsen av en roman strukturelle komplementering analysen for å nøyaktig overvåke reseptor-β-arrestin interaksjoner i sanntid levende systemer. Denne metoden er enkel, nøyaktig og kan lett utvides til noen GPCR av interesse og også den har den fordelen at det overvinner løs interaksjoner på grunn av tilstedeværelsen av et lavt uttrykk arrangøren stede i hver vektor system. Denne strukturelle komplementering analysen gir viktige funksjoner som tillater en nøyaktig og presis overvåking av reseptor-β-arrestin interaksjoner, noe som gjør det egnet i studiet av partisk agonism av ethvert GPCR system samt GPCR c-Terminus ' fosforylering koder ' skrevet av forskjellige GPCR-kinaser (GRKs) og post-translational modifikasjoner av arrestins som stabiliserer eller destabilisere reseptoren-β-arrestin kompleks.
Introduction
GPCRs representerer målet på nesten 35% av dagens narkotika i markedet1,2 og en klar forståelse av deres farmakologi er avgjørende i utviklingen av romanen terapeutiske legemidler3. En av de viktigste aspektene i GPCR narkotika funnet, spesielt under utviklingen av partisk agonister er karakterisering av romanen ligander mot reseptor-β-arrestin interaksjoner4 og β-arrestin interaksjoner med andre cytosolic proteiner slik som clathrin5.
Det har blitt dokumentert at β-arrestin avhengige signalering spiller en nøkkelrolle i nevrologiske lidelser som bipolar lidelse, store depresjonen, og schizofreni6 og også alvorlige bivirkninger i noen medisiner som morfin7.
Gjeldende metoder som brukes til å overvåke disse interaksjoner vanligvis ikke representerer faktiske endogene nivåer av proteiner i studien, i noen tilfeller viser de svake signal, photobleaching og avhengig av GPCR det kan være teknisk utfordrende å sette opp8. Denne romanen strukturelle komplementering analysen bruker lavt uttrykk promoter vektorer for å etterligne endogene fysiologiske nivåer og gir høy følsomhet i forhold til dagens metoder9. Ved hjelp av denne tilnærmingen, var det mulig å enkelt karakterisere Galanin reseptor-β-arrestin1/2 og også β-arrestin2-clathrin interaksjoner10. Denne metodikken kan bli mye brukt til noen GPCR av spesiell interesse der β-arrestins spille en viktig fysiologisk funksjon eller deres signalering er relevant i enkelte sykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. primer design strategi
- Design primere å innføre gener av interesse i pBiT 1.1-C [TK/LgBiT], pBiT 2.1-C [TK/SmBiT], pBiT 1.1-N [TK/LgBiT] og pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] vektorer.
- Velg minst ett av disse tre nettstedene som en av de to unike begrensning enzymer som trengs for retningsbestemt kloning på grunn av tilstedeværelsen av en in-Frame stopp Codon som deler multicloning området som vist i figur 111.
- Innlemme nukleotid sekvensen inn i grunning som vist i tabell 1 for å kode linker rester som vises i rødt i tabell 211.
- For pBiT 1.1-C [TK/LgBiT] og pBiT 2.1-C [TK/SmBiT]-vektorer må du sørge for at 5 ́ primer inneholder en ATG Codon og en potent Kozak konsensus sekvens (GCCGCCACC).
- For pBiT 1.1-N [TK/LgBiT] og pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] vektorer, må du sørge for at 3 ́ primer inneholder en stopp Codon.
Merk: hver vektor inneholder HSV-TK arrangøren å minimere spesifikk forening og redusere eksperimentelle gjenstander, også hver vektor har et uttrykk kassett for Ampicillin resistens i bakterier.
2. PCR
- Sette opp og kjøre PCR reaksjoner for å forsterke INSERT DNA av genet av interesse ved hjelp av primere utformet fra trinn 1. Det er viktig å bruke et høyverdig DNA-polymerase for å minimere mutasjoner.
- Bruk nøyaktig følgende rekkefølge for å klargjøre 50 μL av PCR-reaksjonen. Tilsett 35,5 μL av destillert vann, 5 μL av 10x polymerase buffer, 5 μL av dNTP-blanding (2,5 mM hver), 1 μL av plasmider mal (200 ng/μL), 1,25 μL av forover og omvendt grunning (10 μM) og 1 μL av høykvalitets polymerase (5 U/μL).
- Ved hjelp av en thermocycler sette opp følgende DNA forsterkning program.
- Denaturere ved 95 ° c i 5 min.
- Gjenta 25 ganger følgende termisk syklus: 95 ° c i 30 s, 60 ° c i 1 min, 72 ° c i 2 min per 1 KBP som skal forsterkes.
- Kjør en siste utvidelse ved 72 ° c i 10 min.
- Hold prøvene ved 4 ° c innenfor thermocycler.
Merk: det anbefales sterkt å bruke en High-Fidelity polymerase for å minimere punkt mutasjoner spesielt de som forekommer under forsterkning av lange sekvenser. Som amplicon blir lengre, graden av nøyaktighet i replikering av DNA avtar. For PCR-reaksjonen velger du annealing temperatur basert på Smeltetemperaturen i regionen der oligos direkte hybridize med DNA-malen, og ikke med hele sekvensen av primer.
- PCR produkt rensing
- Isoler PCR-produktet fra resten av PCR-reaksjonen ved hjelp av et sett fra en produsent av preferanse12. PCR-produktet er nå klart til å begrense fordøyelsen.
3. DNA fordøyelse
- For PCR produktet fordøyelsen forberede 50 μL av fordøyelsen reaksjon som følger.
- Bruk et 1,5 mL rør, tilsett 12 μL destillert vann.
- Tilsett 5 μL av 10x buffer med den beste kompatibiliteten med begge Begrensnings enzymer.
- Fra trinn 2,4 tilsett 30 μL av PCR produkt
- Til slutt, tilsett 1,5 μL av hver restriksjon enzym.
- Bland kort med Vortex og ruge ved 37,5 ° c over natten.
- For mottakeren plasmider fordøyelsen forberede 50 μL av fordøyelsen reaksjon som følger:
- Bruk en 1,5 mL tube, tilsett 23 μL av destillert vann.
- Tilsett 5 μL av 10x buffer med den beste kompatibiliteten med begge Begrensnings enzymer.
- Tilsett 15 μL av mottaker plasmider (200 ng/μL).
- Tilsett 1,5 μL av hvert Begrensnings enzym.
- Bland kort med Vortex og ruge ved 37,5 ° c over natten.
Merk: det er viktig å bruke 3 μg av mottaker plasmider for å oppnå tilstrekkelig materiale etter DNA-agarose gel rensing. Det er også relevant å la DNA digestions over natten ved hjelp av begge enzymer for å oppnå høy kloning effektivitet.
4. DNA agarose gel rensing og kloning
- Forbered en 1% agarose gel å kjøre fordøyd DNA plasmider og setter inn og fortsette å kutte tilsvarende band. Når tilsvarende vektor og sette band har blitt purified12, bestemme DNA konsentrasjon ved hjelp av en spektrofotometer.
- Utfør DNA ligation å fusjonere innsatsen til mottakeren plasmider.
- Forbered ligation reaksjoner på rundt 100 ng av totalt DNA inkludert 50 ng av plasmider vektor.
- Sett opp mottaker plasmider ratio på ca 1:3; Det kan beregnes ved hjelp av en vektor-INSERT kalkulator13.
- Definer negative kontroller parallelt. For eksempel, en ligation av mottakeren plasmider DNA uten alle innsette ville skaffe opplysninger på hvor mye miljøet av ufordøyd eller selv-ligating mottager plasmider er gave.
5. transformasjon av kloner
- Plasser et rør av DH5α kompetente celler fra fryseren ved-80 ° c og umiddelbart overføre den på isen i 20 min.
- Etter denne tid, ta 55 μL av DH5α kompetente celler og tilsett 4 μL av ligation reaksjon og bland ved å sveipe røret og lagre på is i 45 min.
- Plasser røret i et vannbad tidligere varmet ved 42 ° c for nøyaktig 48 s og umiddelbart få rørene tilbake på isen for en annen 3 min.
- Tilsett 600 μL av Luria buljong (LB) medium tidligere varmet ved 37,5 ° c og ruge med risting i 1 time ved 200 rpm.
- Overfør 200 til en agar plate som inneholder Ampicillin 100 μg/mL og forsiktig spres over overflaten med væsken er mest absorbert.
- Ruge platene over natten for å se koloniene neste morgen. Mottakeren plasmider på innsatsen plate bør ha betydelig flere kolonier enn mottakeren plasmider alene plate.
6. isolering av det ferdige plasmider
- Plukk 3-10 individuelle bakterie kolonier og Overfør til 1 mL LB medium inneholdende Ampicillin (100 μg/mL) og ruge for 6 timer.
- Ta 200 μL av bakteriell suspensjon og overføre til 5 mL LB medium som inneholder den samme konsentrasjonen av Ampicillin som i trinn 6,1 og ruge over natten ved 37,5 ° c med risting ved 200 rpm.
- Ved hjelp av en miniprep DNA Kit rensing, utføre miniprep DNA renselser bruker 5 mL LB vokst over natten etter produsentens instruksjoner14.
- For å identifisere vellykkede ligations, sett opp PCR-reaksjoner på samme måte som i del 2 ved hjelp av DNA Hentet fra trinn 6,3 som en mal med samme grunning som i del 2 under den første PCR. Positive kloner vil produsere PCR-produkter med tilsvarende størrelse.
- Etter store prep DNA rensing av positive kloner, gjennomføre en diagnostisk begrensning fordøyelse av 500 ng av renset DNA med enzymer som brukes under kloning trinn og kjøre fordøyd produkter på en 1% agarose gel. Det bør være to band: en av størrelsen på vektoren og en av størrelsen på den nye innsatsen.
- Kontroller konstruksjons sekvensen etter sekvensering ved hjelp av følgende primere: Forward 5 '-aaggtgacgcgtgtggcctcgaac-3 ' og Reverse 5 '-gcatttttttcactgcattctagtt-3 '.
Merk: Når DNA blir replisert ved hjelp av PCR, er det alltid mulighet for feil under forsterkningen selv når du bruker en Hi-Fi polymerase, derfor er svært viktig å sekvens de endelige konstruksjoner.
7. transfeksjoner og protein uttrykk
- I en tidligere Poly-L-lysin-belagt hvit 96 brønn plate, utføre celle seeding en dag før transfeksjoner på 2,5 x 104 celler per brønn bruker Dulbecco ' s modifiserte Eagle ' s medium supplert med 10% av fosterets storfe Serum, 100 U/ml penicillin G, og 100 μg/ mL Streptomycin.
- Bruk bare 60 indre brønner for å minimere potensialet for termiske graderinger på tvers av platen og kanteffekter fra fordampning. Tilsett 200 μL av sterilt destillert vann i de 36 utvendige brønnene og 150 μL i mellomrommene mellom brønner og ruge over natten ved 37,5 ° c og 5% av CO2.
- Neste morgen utfører transfeksjoner bruker 100 ng av totalt DNA (50 ng hver konstruere).
- Sett opp fire forskjellige plasmider kombinasjoner (reseptor: β-arrestin) i henhold til figur 2b.
- For hver plasmider kombinasjon brukes 20 μL av modifiserte Eagle ' s minimum Essential Media bufret med HEPES ved hjelp av 0,3 μL av lipidic transfeksjoner reagens per brønn.
- Tilsett 20 μL av lipidic transfeksjoner reagens-DNA-blanding til hver brønn og bland platen i sirkler i 10 s.
- Endre friskt medium etter 6 HR inkubasjons ved 37,5 ° c og 5% CO2.
- Ruge platen i 24 timer ved 37,5 ° c og 5% CO2.
8. overvåking reseptor-β-arrestin1/2 interaksjoner i HEK293 celler
- Aspirer medium og tilsett 100 μL av modifisert Eagle ' s minimum Essential Media bufret med HEPES til hver brønn og la platen stabilisere ved RT i 10 min.
- Forbered det furimazine underlaget ved å kombinere 1 volum med 100 ganger substrat med 19 bind av LCS fortynning buffer (en 20-fold fortynning)11, lage en 5x lager å blande med cellekultur medium.
- Tilsett 25 μL av 5x furimazine til hver brønn og bland forsiktig i sirkler i 10 s.
- Mål luminescence for 10 min for signal stabilisering ved RT.
Merk: ved å bruke denne Baseline signal å normalisere responsen av hver brønn vil det bidra til å redusere variasjoner forårsaket av forskjeller i antall celler belagt per brønn, også forskjeller i transfeksjoner effektivitet, etc. Når beregnet, gjennomsnittlig normalisert respons fra replikere brønner for en gitt narkotikabehandling. - Forbered 13,5 x ligand løsning i modifisert Eagle ' s minimum Essential Media bufret med HEPES.
- For eksperimenter ved romtemperatur med 10 μL av 13,5 x ligand tillegg, Legg til forbindelsene ved hjelp av sprøytebrukere eller en flerkanals pipette og bland platen for hånd eller ved hjelp av en orbital shaker (20 s ved 200 RPM).
- For eksperimenter ved 37,5 ° c med 10 μL av 13,5 x ligand tillegg, bruk sprøytebrukere til å dispensere forbindelser og mikse ved hjelp av instrumentets orbital shaker. Hvis du ikke bruker sprøytebrukere, fjerner du platen fra luminometeret, legger til ligander og blander platen for hånd eller ved hjelp av en orbital shaker (20 s ved 200 RPM).
Merk: Bruk sprøytebrukere og en shaker i deteksjons instrumentet for å minimere temperatursvingninger forbundet med å fjerne platen fra luminometeret. Standard stasjonære luminometers kan brukes for denne analysen. Bruk en integrasjons tid på 0,25 – 2 s.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av prosedyren som presenteres her, ble interaksjoner mellom en prototypiske GPCR og to β-arrestin isoformene overvåket. Glukagon som peptid reseptor (GLP-1R) konstruksjoner ble gjort ved hjelp av primere som inneholder NheI og EcoRI enzym restriksjon nettsteder og klonet i vektorer pBiT 1.1-C [TK/LgBiT] og pBiT 2.1-C [TK/SmBiT] mens i tilfelle av β-arrestins, to ekstra vektorer ble brukt pBiT 1.1-N [TK/LgBiT] og pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] ved hjelp av enzym restriksjon nettsteder BgIII og EcoRI i tilfelle av β-arrestin2 og NheI og XhoI i tilfelle av β-arrestin1. HEK293 celler ble transfekterte ved hjelp 50 ng av GLP-1R-LgBiT/SmBiT og 50 ng av β-arrestin merket med LgBiT eller SmBiT på N-eller C-terminal. Fire forskjellige plasmider kombinasjoner ble vist (Figur 3) og den med høyest selvlysende signal ble valgt for videre eksperimenter (Figur 4). For å bestemme EC50-verdiene for hver β-arrestin isoformen rekruttering ble dose respons kurvene utført ved hjelp av 10 μM, 1 μM, 100 nM, 10 nM og 1 nM med GLP-1 ligand konsentrasjon (figur 4c). Dose respons kurver ble innhentet fra maksimal respons av hver konsentrasjon fra kinetisk studier (Figur 4a, 4b).
Figur 1. Nukleotid sekvenser av multicloning nettsteder av vektorer som brukes i utformingen av GLP-1R-β-arrestin1/2 strukturelle komplementering analysen.
For å utvikle den strukturelle komplementering-analysen for GLP-1R-β-arrestin1/2-system, var det nødvendig å tagge på C-terminalen GLP-1R med LgBiT og SmBiT ved hjelp av enzym begrensningene NheI og EcoRI ved pBiT 1.1-C [TK/LgBiT] og pBiT 2.1-C [TK/SmBiT] Vektor. I tilfelle av β-arrestin1/2 de også var merket med LgBiT og SmBiT på C-og N-Terminal ved hjelp av enzymet restriksjoner BglII/EcoRI for β-arrestin2 og NheI/XhoI for β-arrestin1 på de fire vektorer. Alle vektorer bruker HSV-TK promoter å minimere spesifikk forening og redusere eksperimentelle gjenstander og hver vektor inneholder et uttrykk kassett for Ampicillin resistens i bakterier. Bilde tilpasset fra referanse 11. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Skjematisk fremstilling av GPCR: β-arrestin1/2 strukturelle komplementering analysen.
(a) hvordan GPCR: β-arrestin1/2 strukturelle komplementering analysen fungerer i nærvær av ligand. (b) strukturell representasjon av de ulike plasmider kombinasjonene for GPCR og β-arrestin isoformene merket med LgBiT eller SmBiT. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. 1R/β-arrestins orientering.
For å oppnå den høyeste følsomheten 4 forskjellige plasmider kombinasjoner ble uttrykt i løpet av 24 timer etter transfeksjoner. Selvlysende signaler ble påvist i nesten alle forskjellige plasmider kombinasjoner (a-c) med unntak av bare en GLP-1R: β-arrestin orientering (d). Resultatene uttrykkes som gjennomsnittet ± S.E.M. av to eksperimenter utført i duplikat; hver duplikat ble gjennomsnitt før beregning av S.E.M. Pilene angir klokkeslettet da cellene ble behandlet med GLP-1 ved siste konsentrasjon på 10 μM. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. GLP-1R-β-arrestin1/2-interaksjoner er en dose avhengig måte.
Dose avhengig ligand forhold β-arrestin2 (a) og β-arrestin1 rekruttering (b). Kurver for dose respons viser differensial rekruttering mellom β-arrestin1 og β-arrestin2 ved GLP-1R (c). Resultatene uttrykkes som gjennomsnittet ± S.E.M. av to eksperimenter utført i duplikat; hver duplikat ble gjennomsnitt før beregning av S.E.M. Pilene angir tidspunktet da cellene ble behandlet med GLP-1 i de tilsvarende konsentrasjonene (10 μM, 1 μM, 100 nM, 10 nM og 1 nM, endelige konsentrasjoner). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Vektor | Enzym restriksjon som brukes | Primer sekvens |
| pBiT 1.1-C [TK/LgBiT]/pBiT 2.1-C [TK/SmBiT] | SacI | 5 ́-XXXXXXXXGAGCTCC(rev si)-3 ́ |
| EcoRI | 5 ́-XXXXXXXXGAATTCCC(rev si)-3 ́ | |
| XhoI | 5 ́-XXXXXXXXCTCGAGCC(rev si)-3 ́ | |
| pBiT 1.1-N [TK/LgBiT]/pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] | Xho | 5 ́-XXXXXXXXCTCGAGCGGT (si)-3 ́ |
| SacI | 5 ́-XXXXXXXXGAGCTCAG(si)-3 ́ | |
| EcoRI | 5 ́-XXXXXXXXGAATTCA(si)-3 ́ |
Tabell 1. Sekvenser av primere for de ulike restriksjon enzymet steder i kodingen sekvensen av linker for pBiT 1.1 og pBiT 2.1 vektorer.
SI = sekvens av interesse; Rev SI = reversere komplementære av sekvensen av interesse. Tabell tilpasset fra referanse 11.
| Vektor | Sekvens for linker | Enzym restriksjon som brukes | ||
| pBiT 1.1-C [TK/LgBiT]/pBiT 2.1-C [TK/SmBiT] | SI-GlyAlaGlnGlyAsnSerGlySerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerSerGly-(LgBiT/SmBiT) | SacI | ||
| SI-GlyAsnSerGlySerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerSerGly-(LgBiT/SmBiT) | EcoRI | |||
| SI-GlySerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerSerGly-(LgBiT/SmBiT) | XhoI | |||
| pBiT 1.1-N [TK/LgBiT]/pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] | (LgBiT/SmBiT)-GlySerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerSerGly-si | XhoI | ||
| (LgBiT/SmBiT)-GlySerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerSerGlyGlyAlaGln-si | SacI | |||
| (LgBiT/SmBiT)-GlySerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerSerGlyGlyAlaGlnGlyAsnSer-SI | EcoRI | |||
Tabell 2. Linker amino acid sekvenser relatert med SacI, EcoRI eller XhoI begrensning nettsteder i pBiT 1.1 og pBiT 2.1 vektorer.
Røde rester må kodes av PCR-primere. Tabell tilpasset fra referanse 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved hjelp av metoden som presenteres her, interaksjoner mellom noen GPCR og β-arrestin1/2 kan overvåkes i sanntid levende systemer ved hjelp av denne GPCR-β-arrestin strukturelle komplementering analysen. I denne forbindelse var vi i stand til å observere differensial β-arrestin rekruttering mellom de to β-arrestin isoformene av GLP-1R (A prototypiske klasse B GPCR), vi observerte også en dissosiasjon av reseptoren-β-arrestin kompleks noen få minutter etter å ha nådd det maksimale selvlysende signal.
For å ha den beste følsomheten i den strukturelle komplementering analysen systemet, ble det vist med fire forskjellige romlig orientering mellom reseptoren og hver β-arrestin isoformen og den med høyeste selvlysende signal ble brukt for bakre som for eksempel stimulering av dose respons (Figur 4). Ved hjelp av denne metodikken var det mulig å karakterisere reseptor-β-arrestin interaksjoner ved hjelp av en GPCR av høy terapeutisk verdi i endocrinological sykdommer som diabetes mellitus15. På samme måte denne strategien kan enkelt tilpasses alle GPCR ved enkel merking av GPCR av interesse med LgBiT eller SmBiT på C-terminalen og bruke β-arrestin1/2 konstruksjoner beskrevet her og det framgår som et kraftig alternativ til dagens metoder uten nødvendigheten av en kompleks satt opp der overlappende mellom donor og Acceptor kan være et hinder som i noen tilfeller av BRET og bånd. En annen betydelig fordel er at vektorer som brukes i dette systemet inneholder lavt uttrykk arrangører i et forsøk på å etterligne endogene uttrykks nivåer. Med denne funksjonen kan vi utelukke muligheten for ikke-spesifikke foreninger på grunn av høye uttrykks nivåer av reseptoren og/eller β-arrestin. I Figur 3 og Figur 4, det er en klar forskjell i reseptor-β-arrestin kompleks mellom β-arrestin1 versus β-arrestin2 og også en høyere effekt og intensitet mot β-arrestin1 over β-arrestin2. Den screening i fire forskjellige retninger ble foreslått å øke følsomheten til analysen gjør systemet svært følsom selv på endogene uttrykk nivåer.
Denne metodikken er veldig rett frem å utføre. Kanskje det mest kritiske trinnet i denne protokollen er primer design for å forsterke reseptoren av interesse. Brukeren må være svært forsiktig i å velge hva begrensning enzym å bruke i henhold til figur 1 og basert på dette for å legge den tilsvarende nukleotider til grunning (tabell 1) for å kode de røde markerte aminosyrer (tabell 2).
En begrensning av denne metodikken kan være at furimazine vil forringe i en vandig løsning på eller nær fysiologisk pH, fører til en gradvis reduksjon i luminescence intensitet uavhengig av endringer i GPCR-β-arrestin interaksjoner16. For å overkomme denne begrensningen bør brukeren alltid inkludere en normalisering kontroll (kjøretøy behandlet prøver) når kontinuerlig overvåking luminescence for lengre tidsperioder. Det er også viktig å bruke lave nivåer av fosterets storfe serum under analysen siden sin tilstedeværelse det kan øke frekvensen av furimazine degradering16. Et problem som kan oppstå under analysen er at for selvlysende verdier for en kjent GPCR-β-arrestin interaksjon kan være noen signifikant økning er registrert i forhold til base linjeverdier i alle fire forskjellige plasmider kombinasjoner. Dette kan skyldes den lave uttrykk fra HSV-TK arrangøren17. I så fall er ett alternativ å subclone åpne lese RAM mer koding LgBiT og SmBiT Fusion proteiner i uttrykket vektorer ved hjelp av CMV promoter. Når du skifter til en sterkere promoter, bør optimalisering av mengden transfekterte DNA gjøres for å oppnå den beste analysen respons.
Ved hjelp av denne strukturelle komplementering analysen vi var i stand til å observere med stor nøyaktighet β-arrestin1/2 rekruttering interaksjoner med en prototypiske klasse B GPCR. Ved hjelp av denne metoden, er det mulig å farmakologisk karakterisere romanen legemidler av spesiell interesse målretting GPCRs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av stipend fra forskningsprogrammet (NRF-2015M3A9E7029172) av National Research Foundation of Korea (NRF) finansiert av departementet for vitenskap, IKT og fremtidig planlegging.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotics penicillin streptomycin | Welgene | LS202-02 | Penicillin/Streptomycin |
| Bacterial Incubator | JEIO Tech | IB-05G | Incubator (Air-Jacket), Basic |
| Cell culture medium | Welgene | LM 001-05 | DMEM Cell culture medium |
| Cell culture transfection medium | Gibco | 31985-070 | Optimem 1X cell culture medium |
| CO2 Incubator | NUAIRE | NU5720 | Direct Heat CO2 Incubator |
| Digital water bath | Lab Tech | LWB-122D | Digital water bath lab tech |
| DNA Polymerase proof reading | ELPIS Biotech | EBT-1011 | PfU DNA polymerase |
| DNA purification kit | Cosmogenetech | CMP0112 | miniprepLaboPass Purificartion Kit Plasmid Mini |
| DNA Taq Polymerase | Enzynomics | P750 | nTaq DNA polymerase |
| Enzyme restriction BglII | New England Biolabs | R0144L | BglII |
| Enzyme restriction buffer | New England Biolabs | B72045 | CutSmart 10X Buffer |
| Enzyme restriction EcoRI | New England Biolabs | R3101L | EcoRI-HF |
| Enzyme restriction NheI | New England Biolabs | R01315 | NheI |
| Enzyme restriction XhoI | New England Biolabs | R0146L | XhoI |
| Fetal Bovine Serum | Gibco Canada | 12483020 | Fetal Bovine Serum |
| Gel/PCR DNA MiniKit | Real Biotech Corporation | KH23108 | HiYield Gel/PCR DNA MiniKit |
| Ligase | ELPIS Biotech | EBT-1025 | T4 DNA Ligase |
| Light microscope | Olympus | CKX53SF | CKX53 Microscope Olympus |
| lipid transfection reagent | Invitrogen | 11668-019 | Lipofectamine 2000 |
| Luminometer | Biotek/Fisher Scientific | 12504386 | Synergy 2 Multi-Mode Microplate Readers |
| NanoBiT System | Promega | N2014 | NanoBiT PPI MCS Starter System |
| Nanoluciferase substrate | Promega | N2012 | Nano-Glo Live Cell assay system |
| PCR Thermal cycler | Eppendorf | 6336000015 | Master cycler Nexus SX1 |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P4707-50ML | Poly-L-lysine solution |
| Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | Trysin EDTA 10X |
| White Cell culture 96 well plates | Corning | 3917 | Assay Plate 96 well plate |
References
- Sriram, K., Insel, P. A. GPCRs as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs? Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).
- Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schiöth, H. B., Gloriam, D. E. Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (12), 829-842 (2017).
- Langmead, C. J., Summers, R. J.
- Lohse, M. J., Hoffmann, C. Arrestin Interactions with G Protein-Coupled Receptors. Handbook of Experimental Pharmacology. 219, 15-56 (2014).
- Kang, D. S., et al. Structure of an arrestin2-clathrin complex reveals a novel clathrin binding domain that modulates receptor trafficking. Journal of Biological Chemistry. 284, 29860-29872 (2009).
- Park, S. M., et al. Effects of β-Arrestin-Biased Dopamine D2 Receptor Ligands on Schizophrenia-Like Behavior in Hypoglutamatergic Mice. Neuropsychopharmacology. 41 (3), 704-715 (2016).
- Zhu, L., Cui, Z., Zhu, Q., Zha, X., Xu, Y. Novel Opioid Receptor Agonists with Reduced Morphine-like Side Effects. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry. 18 (19), 1603-1610 (2018).
- Smith, J. S., Lefkowitz, R. J., Rajagopal, S. Biased signalling: from simple switches to allosteric microprocessors. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (4), 243-260 (2018).
- Dixon, A. S. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
- Reyes-Alcaraz, A., Lee, Y. N., Yun, S., Hwang, J. I., Seong, J. Y. Conformational signatures in β-arrestin2 reveal natural biased agonism at a G-protein-coupled receptor. Communications Biology. 3, 1-128 (2018).
- Promega. Nanobit Protein Protein Interaction System Protocol. , https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/101/nanobit-protein-protein-interaction-system-protocol.pdf?la=en (2019).
- Life Biomedical. HiYield Gel/PCR Fragments Extraction Kit. , https://www.lifebiomedical.com/uploads/2/4/7/2/24727678/gel_pcr_dna_fragments_extraction_kitydf_protocol_v3.0.pdf (2019).
- New England BioLabs. Ligation Calculator. , https://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation (2019).
- Cosmo Genetech. , http://www.cosmogenetech.com/cosmo/productmngr/prm11.jsp?P_BR_CD=1&P_CTG_CD=1&P_PRODUCT_CD=1&P_N_PAGE=1&P_CAT_POS= (2019).
- Baggio, L. L., Drucker, D. J. Biology of incretins: GLP-1 and GIP. Gastroenterology. 132, 2131-2157 (2007).
- ProMega. NanoGLO Endurazine and Vivazine Live Cell Substrates Technical Manual. , https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/500/nano-glo-endurazine-and-vivazine-live-cell-substrates-technical-manual.pdf?la=en (2019).
- Ali, R., Ramadurai, S., Barry, F., Nasheuer, H. P. Optimizing fluorescent protein expression for quantitative fluorescence microscopy and spectroscopy using herpes simplex thymidine kinase promoter sequences. FEBS Open Bio. 8 (6), 1043-1060 (2018).
