Monitorando GPCR-β-arrestin1/2 interações em tempo real sistemas vivos para acelerar a descoberta de drogas

Resumo

As interações de GPCR-β-prendedor são um campo emergente na descoberta da droga de GPCR. Métodos precisos, precisos e fáceis de configurar são necessários para monitorar tais interações em sistemas vivos. Nós mostramos um ensaio estrutural da complementação para monitorar interações de GPCR-β-prendedor em pilhas vivas do tempo real, e pode ser estendido a todo o GPCR.

Resumo

As interações entre receptores acoplados à proteína G (GPCRs) e β-prendedor são processos vitais com implicações fisiológicas de grande importância. Atualmente, a caracterização de drogas novas para suas interações com β-prendedor e outras proteínas citosólico é extremamente valiosa no campo da descoberta da droga de GPCR particular durante o estudo do agonism tendencioso de GPCR. Aqui, mostramos a aplicação de um novo ensaio de complementação estrutural para monitorar com precisão as interações receptor-β-prendedor em sistemas vivos em tempo real. Este método é simples, exato e pode facilmente ser estendido a todo o GPCR do interesse e igualmente tem a vantagem que supera interações inespecíficas devido à presença de um promotor da baixa expressão atual em cada sistema do vetor. Este ensaio de complementação estrutural fornece características-chave que permitem um monitoramento preciso e preciso das interações receptor-β-prendedor, tornando-o adequado no estudo do agonismo tendencioso de qualquer sistema GPCR, bem como a fosforilação do GPCR c-Terminus códigos ' escritos por diferentes GPCR-quinases (GRKs) e modificações pós-translacionais de presas que estabilizam ou destabilizam o complexo receptor-β-prendedor.

Introdução

Os GPCRs representam o alvo de quase 35% dos fármacos atuais no mercado^1,2 e um entendimento claro de sua farmacologia é crucial no desenvolvimento de novas drogas terapêuticas³. Um dos aspectos-chave na descoberta da droga de GPCR, particular durante o desenvolvimento de agonistas tendenciosos é a caracterização de ligantes novos para interações do receptor-β-prendedor⁴ e interações do β-prendedor com outras proteínas citosólico tais como clathrin⁵.

Foi documentado que a sinalização dependente do β-prendedor joga um papel chave em desordens neurológicas tais como a desordem bipolar, a depressão principal, e a esquizofrenia⁶ e igualmente efeitos secundários severos em alguns medicamentações tais como a morfina⁷.

Os métodos atuais usados para monitorar essas interações geralmente não representam os níveis endógenos reais das proteínas em estudo, em alguns casos eles mostram sinal fraco, fotobranqueamento e dependendo da GPCR pode ser tecnicamente desafiador para configurar⁸. Este novo ensaio de complementação estrutural utiliza vetores de promotor de baixa expressão para imitar os níveis fisiológicos endógenos e proporciona alta sensibilidade em relação aos métodos atuais⁹. Usando essa abordagem, foi possível caracterizar facilmente a galanin receptor-β-arrestin1/2 e também as interações β-arrestin2-clathrin¹⁰. Esta metodologia pode ser amplamente utilizada para qualquer GPCR de particular interesse onde os β-prendedor desempenham uma função fisiológica chave ou sua sinalização é relevante em algumas doenças.

Protocolo

1. estratégia de design da cartilha

1. Projete primers para introduzir genes de interesse em pBiT 1.1-C [TK/LgBiT], pBiT 2.1-C [TK/SmBiT], pBiT 1.1-N [TK/LgBiT] e pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] vetores.
2. Selecione pelo menos um desses três sites como uma das duas enzimas de restrição exclusivas necessárias para a clonagem direcional devido à presença de um Codon de parada no quadro que divide o site multicloning como mostrado na Figura 1¹¹.
3. Incorporar a seqüência de nucleotídeo nos primers como mostrado na tabela 1 para codificar os resíduos do vinculador mostrados em vermelho na tabela 2¹¹.
4. Para os vectores pBiT 1.1-C [TK/LgBiT] e pBiT 2.1-C [TK/SmBiT], certifique-se de que o primer 5 ́ contém um Codon ATG e uma potente sequência de consenso de Kozak (GCCGCCACC).
5. Para os vetores pBiT 1.1-N [TK/LgBiT] e pBiT 2.1-N [TK/SmBiT], assegure-se de que o primer 3 ́ contenha um Codon de parada.
   Nota: cada vetor contém o promotor HSV-TK para minimizar a associação não específica e reduzir artefatos experimentais, também cada vetor tem uma expressão de fita para a resistência ampicilina em bactérias.

2. PCR

1. Configurar e executar reações de PCR para amplificar o DNA da pastilha do gene de interesse usando os primers projetados a partir do passo 1. É importante usar uma polimerase de DNA de alta fidelidade para minimizar as mutações.
2. Use exatamente a seguinte ordem para preparar 50 μL de reação de PCR. Adicionar 35,5 μL de água destilada, 5 μL de tampão da polimerase 10x, 5 μL de mistura de dNTP (2,5 mM cada), 1 μL de molde plasmídeo (200 ng/μL), 1,25 μL de primers para a frente e para trás (10 μM) e 1 μL de polimerase de alta fidelidade (5 U/μL).
3. Usando um termociclador ajustou acima o seguinte programa da amplificação do ADN.
   1. Denature a 95 ° c por 5 min.
   2. Repita 25 vezes o seguinte ciclo térmico: 95 ° c para 30 s, 60 ° c por 1 minuto, 72 ° c por 2 min por 1 KBP a ser amplificado.
   3. Execute uma extensão final em 72 ° c por 10 min.
   4. Segure as amostras a 4 ° c dentro do termocicer.
      Nota: recomenda-se altamente usar um polymerase High-fidelity a fim minimizar mutações do ponto particular aquelas que ocorrem durante a amplificação de seqüências longas. Como o amplicon se torna mais longo, o grau de precisão na replicação do DNA diminui. Para a reação do PCR, escolha a temperatura de recozimento baseada na temperatura de derretimento da região onde os oligos diretamente hibridizam com o molde do ADN e não com toda a seqüência do primer.
4. Purificação do produto do PCR
   1. Isole o produto do PCR do descanso da reação do PCR usando um jogo de um fabricante da preferência¹². O produto do PCR está agora pronto para a digestão da limitação.

3. digestão do ADN

1. Para a digestão do produto do PCR Prepare 50 μL da reação da digestão como segue.
   1. Utilizando um tubo de 1,5 mL, adicione 12 μL de água destilada.
   2. Adicione 5 μL de tampão 10x com a melhor compatibilidade com ambas as enzimas de restrição.
   3. A partir do passo 2,4 Adicionar 30 μL de produto PCR
   4. Finalmente, adicione 1,5 μL de cada enzima de restrição.
   5. Misture brevemente pelo Vortex e incubar a 37,5 ° c durante a noite.
2. Para o receptor plasmídeo digestão preparar 50 μL de reação de digestão como segue:
   1. Utilizando um tubo de 1,5 mL, adicione 23 μL de água destilada.
   2. Adicione 5 μL de tampão 10x com a melhor compatibilidade com ambas as enzimas de restrição.
   3. Adicionar 15 μL de plasmídeo receptor (200 ng/μL).
   4. Adicionar 1,5 μL de cada enzima de restrição.
   5. Misture brevemente pelo Vortex e incubar a 37,5 ° c durante a noite.
      Nota: é importante usar 3 μg de plasmídeo receptor, a fim de obter material suficiente após a purificação do gel de agarose de DNA. Também é relevante deixar digestões de DNA durante a noite usando ambas as enzimas para obter alta eficiência de clonagem.

4. purificação e clonagem do gel do Agarose do ADN

1. Prepare um gel de agarose 1% para executar o plasmídeo de DNA digerido e insere e proceder para cortar as bandas correspondentes. Uma vez que o vetor correspondente e as faixas da inserção foram purified12, determine a concentração do ADN usando um espectrofotômetro.
2. Realize a ligadura de DNA para fundir a pastilha ao plasmídeo receptor.
3. Prepare reações de ligadura de cerca de 100 ng de DNA total, incluindo 50 ng de vetor plasmídeo.
4. Configurar a taxa de inserção de plasmídeo receptor de aproximadamente 1:3; Ele pode ser calculado usando uma calculadora de inserção vetorial¹³.
5. Configure controles negativos em paralelo. Por exemplo, uma ligadura do DNA plasmídeo receptor sem qualquer pastilha fornecerá informações sobre o quanto de fundo de plasmídeo receptor não digerido ou autoligante está presente.

5. transformação de clones

1. Coloc um tubo de DH5α pilhas competentes do congelador em-80 ° c e transfira-o imediatamente no gelo por 20 minutos.
2. Após esse tempo, tomar 55 μL de DH5α células competentes e adicionar 4 μL de reação de ligadura e misturar por flicking o tubo e armazenar no gelo por 45 min.
3. Coloc o tubo em um banho de água aquecido previamente em 42 ° c para exatamente 48 s e começ imediatamente os tubos de volta no gelo por outros 3 minutos.
4. Adicionar 600 μL de caldo de Luria (LB) médio previamente aquecido a 37,5 ° c e incubar com agitação durante 1 hora a 200 rpm.
5. Transferir 200 μL para uma placa de ágar contendo ampicilina 100 μg/mL e espalhar suavemente sobre a superfície com o líquido é absorvido principalmente.
6. Incubar as placas durante a noite para ver as colônias na manhã seguinte. O plasmídeo receptor na placa de pastilha deve ter significativamente mais colônias do que a placa de plasmídeo receptor sozinho.

6. isolamento do plasmídeo acabado

1. Escolha 3-10 colônias bacterianas individuais e transfira para 1 mL de meio LB contendo ampicilina (100 μg/mL) e incubar por 6 h.
2. Tomar 200 μL de suspensão bacteriana e transferir para 5 mL de meio LB contendo a mesma concentração de ampicilina como no passo 6,1 e incubar durante a noite a 37,5 ° c com agitação a 200 rpm.
3. Usando uma purificação do kit de DNA protocolo, realize purificações de DNA protocolo usando 5 ml de lb cultivadas durante a noite seguindo as instruções do fabricante¹⁴.
4. Para identificar ligações bem-sucedidas, configurar reações de PCR da mesma forma como na seção 2 usando o DNA obtido da etapa 6,3 como um modelo com os mesmos primers como na seção 2 durante a primeira PCR. Clones positivos produzirão produtos de PCR com o tamanho correspondente.
5. Após a purificação grande do ADN da preparação dos clones positivos, conduza uma digestão diagnóstica da limitação de 500 ng do ADN purified com as enzimas usadas durante a etapa do clonagem e funcione os produtos digeridos em um gel do agarose de 1%. Deve haver duas bandas: uma do tamanho do vetor e uma do tamanho da nova inserção.
6. Verifique a sequência de construção sequenciando usando os seguintes primers: forward 5 '-aaggtgacgcgtgtggcctcgaac-3 ' e Reverse 5 '-gcatttttttcactgcattctagtt-3 '.
   Nota: quando o DNA é replicado usando PCR, há sempre a possibilidade de erros durante a amplificação, mesmo quando se utiliza uma polimerase de alta fidelidade, portanto, é muito importante para sequenciar as construções finais.

7. transfection e expressão da proteína

1. Em uma placa de poço branco 96 revestida previamente poli-L-lisina, realize a semeadura celular um dia antes da transfecção em 2,5 x 10⁴ células por poço usando o meio de águia modificada de Dulbecco suplementado com 10% de soro bovino Fetal, 100 U/ml de penicilina G e 100 μg/ mL de estreptomicina.
2. Use apenas os 60 poços internos para minimizar o potencial de gradientes térmicos nos efeitos da placa e da borda da evaporação. Adicionar 200 μL de água destilada estéril aos 36 poços exteriores e 150 μL nos espaços entre poços e incubar durante a noite a 37,5 ° c e 5% de CO₂.
3. A manhã seguinte executar transfection usando 100 ng de DNA total (50 ng cada construção).
4. Configurar quatro combinações diferentes de plasmídeo (receptor: β-prendedor) de acordo com a Figura 2b.
5. Para cada combinação de plasmídeo use 20 μL de mídia essencial de Eagle ' s Minimum Essential tamponada com HEPES usando 0,3 μL de reagente de transfecção lipídico por poço.
6. Adicionar 20 μL de transfecção lipídico reagente-mistura de DNA para cada poço e misture a placa em círculos para 10 s.
7. Mude o meio fresco após a incubação de 6 horas em 37,5 ° c e 5% CO₂.
8. Incubar a chapa por 24 h a 37,5 ° c e 5% CO₂.

8. monitorização das interações receptor-β-arrestin1/2 em células HEK293

1. Aspirar o meio e adicionar 100 μL de média essencial modificada de Eagle ' s mínima armazenada em buffer com HEPES a cada poço e deixe a placa estabilizar em RT por 10 min.
2. Prepare o substrato furimazina combinando 1 volume de substrato 100x com 19 volumes de tampão de diluição de LCS (uma diluição de 20 vezes)¹¹, criando um estoque de 5x para misturar com meio de cultura celular.
3. Adicione 25 μL de 5x furimazine a cada poço e misture suavemente em círculos por 10 s.
4. Medir a luminescência por 10 min para a estabilização do sinal na RT.
   Nota: ao usar este sinal de linha de base para normalizar a resposta de cada poço, ele ajudará a reduzir a variabilidade causada por diferenças no número de células chapeadas por poço, também diferenças na eficiência de transfecção, etc. Uma vez calculado, a média da resposta normalizada dos poços replicados para um determinado tratamento medicamentoso.
5. Prepare a solução do ligante 13.5 x em meios essenciais mínimos modificados da águia tamponado com HEPES.
6. Para experimentos em temperatura ambiente com 10 μL de 13,5 x adição de ligantes, adicione os compostos usando injetores ou uma pipeta multicanal e misture a placa com a mão ou usando um agitador orbital (20 s a 200 rpm).
7. Para experimentos a 37,5 ° c com 10 μL de 13,5 x adição de ligantes, use injetores para dispensar compostos e misture usando o agitador orbital do instrumento. Em caso de não utilização de injectores, retire a placa do luminómetro, adicione os ligantes e misture a chapa à mão ou utilizando um agitador orbital (20 s a 200 rpm).
   Nota: use injectores e uma coqueteleira dentro do instrumento de detecção para minimizar as flutuações de temperatura associadas à remoção da placa do luminômetro. Os luminômetros padrão do de bancada podem ser usados para este ensaio. Use um tempo de integração de 0,25 – 2 s.

Resultados

Usando o procedimento apresentado aqui, as interações entre um GPCR protótipo e duas isoformas do β-prendedor foram monitoradas. Glucagon como os construtores do receptor do peptide (GLP-1R) foram feitos usando os primers que contêm locais da limitação da enzima de NheI e de EcoRI e clonados nos vetores pBiT 1.1-C [TK/LgBiT] e pBiT 2.1-C [TK/SmBiT] quando no caso de β-prendedor, dois vetores adicionais foram usado pBiT 1.1-N [TK/LgBiT] e pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] usando sites de restrição enzimática BgIII e EcoRI no caso de ...

Discussão

Usando o método apresentado aqui, as interações entre todo o GPCR e β-arrestin1/2 podem ser monitoradas em sistemas vivos do tempo real usando este ensaio estrutural da complementação do GPCR-β-prendedor. Neste sentido, nós pudemos observar o recrutamento diferencial do β-prendedor entre as duas isoformas do β-prendedor pelo GLP-1R (uma classe protótipo B GPCR), nós igualmente observamos uma dissociação do complexo do receptor-β-prendedor alguns minutos após ter alcançado o máximo sinal luminescente.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Antibióticos penicilina estreptomicina	Welgene	LS202-02	penicilina/estreptomicina
	JEIO Tech	IB-05G	Incubadora (Air-Jacket), Basic
Cell Culture Medium	Welgene	LM 001-05	DMEM Cell culture medium
Cell transfection medium	Gibco	31985-070	Optimem 1X cell culture medium
Incubadora de CO2	NUAIRE	NU5720	Incubadora de CO2 de Calor Direto
Banho-maria digital	Laboratório técnico	LWB-122D	Banho-maria digital técnico de laboratório
Polimerase leitura à prova	ELPIS Biotech	EBT-1011	PfU DNA polimerase
Kit de purificação de DNA	Cosmogenetech	CMP0112	miniprepKit de purificação LaboPass Plasmídeo Mini
DNA Taq Polimerase	Enzynomics	P750	nTaq DNA polimerase
Restrição enzimática BglII	New England Biolabs	R0144L	BglII
Tampão de restrição enzimática	New England Biolabs	B72045	CutSmart 10X Buffer
Restrição enzimática EcoRI	New England Biolabs	R3101L	EcoRI-HF
Restrição enzimática NheI	New England Biolabs	R01315	NheI
Restrição enzimática XhoI	New England Biolabs	R0146L	XhoI
Soro bovino fetal	Gibco Canadá	12483020	soro bovino fetal
/PCR DNA MiniKit	Real Biotech Corporation	KH23108	HiYield Gel/PCR DNA MiniKit
Ligase	ELPIS Biotech	EBT-1025	T4 DNA Ligase
Microscópio óptico	Olympus	CKX53SF	CKX53 Microscópio Olympus
reagente de transfecção de lipídios	Invitrogen	11668-019	Lipofectamine 2000
Luminômetro	Biotek / Fisher Scientific	12504386	Synergy 2 Leitores de microplacas multimodo
Sistema NanoBiT	Promega	N2014	NanoBiT PPI MCS Sistema inicial
Substrato de nanoluciferase	Promega	N2012	Nano-Glo Sistema de ensaio de células vivas
PCR Termociclador	Eppendorf	6336000015	Ciclador mestre Nexus SX1
Poli-L-lisina	Sigma Aldrich	P4707-50ML	Solução de poli-L-lisina
Tripsina EDTA	Gibco	25200-056	Trysin EDTA 10X
Cultura de células brancas 96 placas de poços	Corning	3917	Placa de ensaio de 96 poços

Incubadora bacteriana de DNA Gel de