As interações de GPCR-β-prendedor são um campo emergente na descoberta da droga de GPCR. Métodos precisos, precisos e fáceis de configurar são necessários para monitorar tais interações em sistemas vivos. Nós mostramos um ensaio estrutural da complementação para monitorar interações de GPCR-β-prendedor em pilhas vivas do tempo real, e pode ser estendido a todo o GPCR.
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Artigo de método
Monitorando GPCR-β-arrestin1/2 interações em tempo real sistemas vivos para acelerar a descoberta de drogas
Neste artigo
Resumo
Resumo
As interações entre receptores acoplados à proteína G (GPCRs) e β-prendedor são processos vitais com implicações fisiológicas de grande importância. Atualmente, a caracterização de drogas novas para suas interações com β-prendedor e outras proteínas citosólico é extremamente valiosa no campo da descoberta da droga de GPCR particular durante o estudo do agonism tendencioso de GPCR. Aqui, mostramos a aplicação de um novo ensaio de complementação estrutural para monitorar com precisão as interações receptor-β-prendedor em sistemas vivos em tempo real. Este método é simples, exato e pode facilmente ser estendido a todo o GPCR do interesse e igualmente tem a vantagem que supera interações inespecíficas devido à presença de um promotor da baixa expressão atual em cada sistema do vetor. Este ensaio de complementação estrutural fornece características-chave que permitem um monitoramento preciso e preciso das interações receptor-β-prendedor, tornando-o adequado no estudo do agonismo tendencioso de qualquer sistema GPCR, bem como a fosforilação do GPCR c-Terminus códigos ' escritos por diferentes GPCR-quinases (GRKs) e modificações pós-translacionais de presas que estabilizam ou destabilizam o complexo receptor-β-prendedor.
Introdução
Os GPCRs representam o alvo de quase 35% dos fármacos atuais no mercado1,2 e um entendimento claro de sua farmacologia é crucial no desenvolvimento de novas drogas terapêuticas3. Um dos aspectos-chave na descoberta da droga de GPCR, particular durante o desenvolvimento de agonistas tendenciosos é a caracterização de ligantes novos para interações do receptor-β-prendedor4 e interações do β-prendedor com outras proteínas citosólico tais como clathrin5.
Foi documentado que a sinalização dependente do β-prendedor jo....
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Protocolo
1. estratégia de design da cartilha
- Projete primers para introduzir genes de interesse em pBiT 1.1-C [TK/LgBiT], pBiT 2.1-C [TK/SmBiT], pBiT 1.1-N [TK/LgBiT] e pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] vetores.
- Selecione pelo menos um desses três sites como uma das duas enzimas de restrição exclusivas necessárias para a clonagem direcional devido à presença de um Codon de parada no quadro que divide o site multicloning como mostrado na Figura 111.
- Incorporar a seqüência de nucleotídeo nos primers como mostrado na tabela 1 para codificar os resíduos do vinculador mostrados em vermelho na <....
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Resultados
Usando o procedimento apresentado aqui, as interações entre um GPCR protótipo e duas isoformas do β-prendedor foram monitoradas. Glucagon como os construtores do receptor do peptide (GLP-1R) foram feitos usando os primers que contêm locais da limitação da enzima de NheI e de EcoRI e clonados nos vetores pBiT 1.1-C [TK/LgBiT] e pBiT 2.1-C [TK/SmBiT] quando no caso de β-prendedor, dois vetores adicionais foram usado pBiT 1.1-N [TK/LgBiT] e pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] usando sites de restrição enzimática BgIII e EcoRI no caso de .......
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Discussão
Usando o método apresentado aqui, as interações entre todo o GPCR e β-arrestin1/2 podem ser monitoradas em sistemas vivos do tempo real usando este ensaio estrutural da complementação do GPCR-β-prendedor. Neste sentido, nós pudemos observar o recrutamento diferencial do β-prendedor entre as duas isoformas do β-prendedor pelo GLP-1R (uma classe protótipo B GPCR), nós igualmente observamos uma dissociação do complexo do receptor-β-prendedor alguns minutos após ter alcançado o máximo sinal luminescente.
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Divulgações
Os autores não declaram interesses concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por subsídios do programa de pesquisa (NRF-2015M3A9E7029172) da Fundação Nacional de pesquisa da Coréia (NRF) financiado pelo Ministério da ciência, TIC, e planejamento futuro.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Antibióticos penicilina estreptomicina | Welgene | LS202-02 | penicilina/estreptomicina |
| JEIO Tech | IB-05G | Incubadora (Air-Jacket), Basic | |
| Cell Culture Medium | Welgene | LM 001-05 | DMEM Cell culture medium |
| Cell transfection medium | Gibco | 31985-070 | Optimem 1X cell culture medium |
| Incubadora de CO2 | NUAIRE | NU5720 | Incubadora de CO2 de Calor Direto |
| Banho-maria digital | Laboratório técnico | LWB-122D | Banho-maria digital técnico de laboratório |
| Polimerase leitura à prova | ELPIS Biotech | EBT-1011 | PfU DNA polimerase |
| Kit de purificação de DNA | Cosmogenetech | CMP0112 | miniprepKit de purificação LaboPass Plasmídeo Mini |
| DNA Taq Polimerase | Enzynomics | P750 | nTaq DNA polimerase |
| Restrição enzimática BglII | New England Biolabs | R0144L | BglII |
| Tampão de restrição enzimática | New England Biolabs | B72045 | CutSmart 10X Buffer |
| Restrição enzimática EcoRI | New England Biolabs | R3101L | EcoRI-HF |
| Restrição enzimática NheI | New England Biolabs | R01315 | NheI |
| Restrição enzimática XhoI | New England Biolabs | R0146L | XhoI |
| Soro bovino fetal | Gibco Canadá | 12483020 | soro bovino fetal |
| /PCR DNA MiniKit | Real Biotech Corporation | KH23108 | HiYield Gel/PCR DNA MiniKit |
| Ligase | ELPIS Biotech | EBT-1025 | T4 DNA Ligase |
| Microscópio óptico | Olympus | CKX53SF | CKX53 Microscópio Olympus |
| reagente de transfecção de lipídios | Invitrogen | 11668-019 | Lipofectamine 2000 |
| Luminômetro | Biotek / Fisher Scientific | 12504386 | Synergy 2 Leitores de microplacas multimodo |
| Sistema NanoBiT | Promega | N2014 | NanoBiT PPI MCS Sistema inicial |
| Substrato de nanoluciferase | Promega | N2012 | Nano-Glo Sistema de ensaio de células vivas |
| PCR Termociclador | Eppendorf | 6336000015 | Ciclador mestre Nexus SX1 |
| Poli-L-lisina | Sigma Aldrich | P4707-50ML | Solução de poli-L-lisina |
| Tripsina EDTA | Gibco | 25200-056 | Trysin EDTA 10X |
| Cultura de células brancas 96 placas de poços | Corning | 3917 | Placa de ensaio de 96 poços |
Referências
- Sriram, K., Insel, P. A. GPCRs as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs? Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).
- Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schiöth, H. B., Gloriam, D. E. Trends in GPCR ....
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Reimpressões e permissões
