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Artigo de método

Uma adaptação semi-high-throughput do ensaio ATPase NADH-acoplado para a seleção de inibidores pequenos da molécula

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DOI:

10.3791/60017

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17 de agosto de 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Medicine, The Scripps Research Institute, 2Department of Neuroscience, The Scripps Research Institute, 3Laboratory of Molecular Physiology, NHLBI, National Institutes of Health

Neste artigo

Resumo

Um ensaio de ATPase acoplado a nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADH) foi adaptado à triagem de taxa de transferência semialta de inibidores de miosina de pequena molécula. Este ensaio cinético é executado em um formato de microplaca de 384 poços com volumes de reação total de apenas 20 μL por poço. A plataforma deve ser aplicável a praticamente qualquer enzima produtora de ADP.

Resumo

As enzimas ATPase utilizam a energia livre armazenada em trifosfato de adenosina para catalisar uma grande variedade de processos bioquímicos endergônicos in vivo que não ocorreriam espontaneamente. Estas proteínas são cruciais para essencialmente todos os aspectos da vida celular, incluindo o metabolismo, divisão celular, respostas a mudanças ambientais e movimento. O protocolo aqui apresentado descreve um ensaio de ATPase acoplado a nicotinamida adenina dinucleotídeo que foi adaptado à triagem de taxa de transferência semialta de inibidores de ATPase de pequenas moléculas. O ensaio foi aplicado à miosina II do músculo cardíaco e esquelético, dois ATPases motores moleculares à base de actina, como prova de princípio. A hidrólise do ATP é acoplada à oxidação de NADH por reações enzimáticas no ensaio. Primeiramente, o ADP gerado pelo ATPase é regenerado ao ATP pelo piruvato kinase (PK). PK catalisa a transição de fosfoenolpiruvato (PEP) para piruvato em paralelo. Subseqüentemente, o piruvato é reduzido ao lactato pelo desidrogenase do lactato (LDH), que catalisa a oxidação de NADH paralelamente. Assim, a diminuição da concentração de ATP está diretamente correlacionada com a diminuição da concentração de NADH, que se segue da mudança para a fluorescência intrínseca da NADH. Contanto que o PEP esteja disponível no sistema de reação, a concentração de ADP permanece muito baixa, evitando a inibição da enzima ATPase pelo seu próprio produto. Além disso, a concentração de ATP permanece quase constante, produzindo cursos de tempo linear. A fluorescência é monitorada continuamente, o que permite uma fácil estimativa da qualidade dos dados e ajuda a filtrar artefatos potenciais (por exemplo, decorrentes de precipitação composta ou alterações térmicas).

Introdução

Myosins são transdutores de energia Mecanoquímica que hidrolisam trifosfato de adenosina (ATP) para gerar movimento direcional ao longo dos filamentos do citoesqueleto de actina em eucariontes1,2. Eles têm tanto estruturalmente e kineticamente adaptados às suas várias funções intracelulares, como o transporte de organelas, contração muscular ou a geração de tensão citoesquelética1,2. A superfamília da miosina é representada por ~ 40 genes de miosina pertencentes a ~ 12 classes distintas de miosina no genoma humano3,4. Os membros das classes de miosina desempenham vários papéis em um conjunto altamente diversificado de distúrbios, como vários cânceres, distúrbios neurológicos, miopatias esqueléticas e cardiomiopatia hipertrófica5,6. Dado o grande número de funções fisiológicas e patológicas destes motores moleculares, não é surpreendente que eles estão se tornando cada vez mais reconhecidos como alvos de drogas para uma variedade de condições7. Avanços significativos foram feitos recentemente na descoberta de novos inibidores da miosina8,9,10 e ativadores11, e para melhorar as propriedades dos já existentes12, 13 anos de , 14 anos de , quinze anos.

A nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADH)-acoplado ATPase ensaio tem sido usado para medir a atividade ATPase de várias enzimas, tais como o retículo sarcoplasmático CA2 + bomba ATPase16, o reparo de DNA ATPase RAD5417, o AAA + ATPase p9718 ou o motor microtúnica cinesina19. O ensaio emprega um ciclo de regeneração ATP. O difosfato de adenosina (ADP) gerado pela ATPase é regenerado para ATP por piruvato quinase (PK), que transforma uma molécula de fosfoenolpiruvato (PEP) em piruvato em paralelo. Subseqüentemente, o piruvato é reduzido ao lactato pelo desidrogenase do lactato (LDH). Isso, por sua vez, oxida uma molécula de NADH a NAD. Portanto, a diminuição da concentração de NADH em função do tempo é igual à taxa de hidrólise do ATP. O ciclo de regeneração ATP mantém a concentração de ATP quase constante e a concentração de ADP baixa, contanto que PEP esteja disponível. Isso resulta em cursos de tempo linear, tornando simples determinar as taxas de reação inicial e ajuda a evitar a inibição do produto pela ADP19. Embora o ensaio ATPase acoplado ao NADH já tenha sido adaptado a um formato 96-bem20, os volumes de alta reação (~ 150 μL) tornam-se relativamente dispendiosos devido à alta demanda de reagentes, tornando-o menos adequado à rápida triagem de um grande número de Compostos. Métodos alternativos, como o ensaio verde de Malaquita19,21, que depende da detecção do fosfato produzido pela enzima ATPase, foram comprovados mais adequados para miniaturização e triagem de alta produtividade22 , 23 anos de , 24. no entanto, um ensaio de ponto final é mais susceptível de ser afectado por vários artefactos (discutidos abaixo), que podem continuar a não ser descobertos na ausência de cursos a tempo inteiro.

Aqui, o ensaio ATPase acoplado à NADH foi otimizado para triagem de produção semialta de inibidores de pequenas moléculas. O músculo esquelético e cardíaco miosina II e os inibidores da miosina blebbistatina8 , para-aminoblebbistatin13 e para-nitroblebbistatin12 são utilizados para demonstrar o poder do ensaio, que se baseia na NADH fluorescência como uma leitura. Este protocolo é capaz de triagem de projetos focados em qualquer ADP produzindo enzimas.

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Protocolo

1. preparação de soluções de estoque e reagentes

  1. Prepare a solução de ações ditiotreitol (DTT) dissolvendo a DTT cristalina em água destilada até uma concentração final de 1000 mm. Ajuste o pH para 7,0 com solução de NaOH de 1 M. Alíquota e armazene a-20 ° c.
  2. Prepare a solução de estoque ATP dissolvendo ATP cristalino em água destilada para uma concentração final de 100 mM. Ajuste o pH para 7,0 com solução de NaOH de 1 M. Alíquota e armazene a-20 ° c.
  3. Prepare 10x NADH tampão contendo 70 mM 3-(N-morpholino) propanesulfonic ácido (MOPS), 10 mM MgCl2, 0,9 mm etileno glicol-bis (β-aminoetil éter)-n, N, n ′, n′-ácido tetraacético (EGTA), e 3 mm Nan3. Ajuste o pH para 7,0 com solução de NaOH de 1 M. Conservar a 4 ° c.
  4. Prepare o tampão da miosina 1x contendo 10 mM de MOPS e 0,1 mM de EGTA. Ajuste o pH para 7,0 com solução de NaOH de 1 M. Conservar a 4 ° c. Adicionar albumina sérica bovina (BSA) e TDT a uma concentração final de 0,1% (p/v%) e 1 mM, respectivamente, antes da utilização.
  5. Prepare 1x tampão de actina contendo 4 mM MOPS, 0,1 mM EGTA, 2 mM MgCl2e 3 mm Nan3. Ajuste o pH para 7,0 com solução de NaOH de 1 M. Conservar a 4 ° c. Adicionar BSA e DTT a uma concentração final de 0,1% (w/v%) e 1 mM, respectivamente, antes da utilização.
  6. Prepare a solução de estoque de NADH dissolvendo o NADH cristalino no amortecedor de 10x NADH a uma concentração final de 5,5 milímetros. Alíquota e armazene a-20 ° c.
  7. Prepare a solução de ações PEP dissolvendo a PEP cristalina no tampão NADH 10x para uma concentração final de 50 mM. Alíquota e armazene a-20 ° c.
  8. Prepare a solução de estoque LDH dissolvendo o pó liofilizado de LDH em uma mistura de glicerol e tampão de NADH 10x (50%: 50%) a uma concentração final de 2000 U/mL. Centrifugue a solução para remover qualquer proteína não dissolvida presente (7.197 x g, 20 ° c, 10 min). Transfira o sobrenadante para um tubo de centrifugação limpo com cuidado. Alíquota e armazene a-20 ° c.
  9. Prepare a solução de estoque de PK dissolvendo pó de PK liofilizado em uma mistura de glicerol e tampão de NADH 10x (50%: 50%) a uma concentração final de 10000 U/mL. Centrifugue a solução para remover qualquer proteína não dissolvida presente (7.197 x g, 20 ° c, 10 min). Transfira o sobrenadante para um tubo de centrifugação limpo com cuidado. Alíquota e armazene a-20 ° c.
  10. Reconstituir as amostras de miosina II do músculo cardíaco e esquelético liofilizado, adicionando 100 μL de água destilada para obter 10 mg/mL de soluções de ações correspondentes a ~ 37,9 μM e ~ 40,8 μM concentrações de miosina (monomérica), respectivamente. Para obter mais detalhes, consulte as instruções do fabricante.
  11. Prepare o F-Actin do pó do acetona do músculo de coelho como descrito por Pardee e por Spudich25.

2. medir atividades de ATPase e efeitos inibitórios de inibidores de pequenas moléculas

  1. Prepare a placa composta.
    1. Dissolva os compostos de interesse em Dimetilsulfóxido de alta qualidade (DMSO).
    2. Crie diluições de série 1:2 de quinze passos a partir de concentração composta de 10 mM em DMSO.
    3. Transfira as amostras para uma placa de polipropileno de 384 poços em triplicados (12,5 μL cada) utilizando uma pipeta multicanal. Use duas linhas na placa composta para um composto (em vez de três colunas) para minimizar o número de poços potencialmente afetados por efeitos de borda. Use os três últimos poços na segunda linha para cada composto como controle negativo (somente DMSO). Não utilize a primeira e a última linha da placa para diluições compostas.
    4. Transfira DMSO puro para os poços da primeira linha (reservado para calibração NADH).
    5. Use a última linha para controle positivo.
      Nota: para-aminoblebbistatin na concentração de 4 milímetros no DMSO foi usado aqui.
  2. Prepare 4500 μL de solução de actina diluída de 20 μM para cada placa de ensaio (microplaca de poliestireno de parede preta de 384 poços), diluindo a solução de actina em tampão de actina. Misture a solução completamente pipetando para cima e para baixo 30x usando uma pipeta de 5 mL para reduzir a viscosidade e a heterogeneidade quebrando filamentos de actina. Centrifugue a solução para remover qualquer proteína precipitada presente (7.197 x g, 20 ° c, 10 min). Transfira com cuidado o sobrenadante em um tubo de centrifugação limpo.
  3. Prepare a mistura mestra contendo enzimas LDH e PK ("mistura enzimática"). Para cada placa de ensaio, combine 171,4 μL de solução de LDH, 171,4 μL de solução de PK e 3189,3 μL ou 3252,9 μL de tampão de miosina para ensaios envolvendo a miosina II do músculo cardíaco ou esquelético, respectivamente, em um tubo de centrífuga cônico de 15 mL. Não adicione qualquer miosina neste ponto para evitar a agregação e precipitação.
  4. Prepare a mistura mestra contendo todos os substratos ("mix de substrato"). Para cada placa, combine 162,1 μL de ATP, 162,1 μL de PEP e 324,1 μL de solução de NADH em um tubo de centrífuga cônico de 15 mL. Não adicione actina neste ponto para evitar a agregação e precipitação.
  5. Crie diluições de série 1:2 de sete etapas de NADH para calibração a partir de 250 μM.
    1. Misture 12,3 μL de solução de estoque de NADH com 257,7 μL de tampão de miosina em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
    2. Alíquota 135 μL de tampão de miosina em sete tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.
    3. Transferir 135 μL de solução do primeiro tubo para o segundo e misturar com pipetagem. Repita até chegar ao tubo de 7º .
    4. Use o último tubo como controle no-NADH (somente buffer).
  6. Utilizando uma pipeta de 8 canais, transfira 20 μL das soluções de calibração NADH para a primeira linha da placa de ensaio em triplicados.
  7. Adicionar 68 μL de μL cardíacos ou 4,2 de miosina do músculo esquelético II à mistura enzimática. Vortex brevemente.
  8. Exceto a primeira linha, dispense 8,4 μL da mistura de miosina-enzima preparada em cada poço da placa de ensaio usando um dispensador automatizado.
  9. Transfira 100 nL de soluções da placa composta para a placa de ensaio contendo mistura enzimática utilizando um sistema automatizado de manuseio de líquidos equipado com uma cabeça de ferramenta de pino de 100 nL.
  10. Agitar a placa de ensaio durante 1 min à temperatura ambiente a 1200 RPM utilizando um agitador de microplacas.
  11. Adicionar 4.052 μL da solução de actina centrifugada à mistura de substrato. Vortex brevemente.
  12. Dispense 11,6 μL de mistura de substrato de actina em cada poço da placa de ensaio (excepto a primeira linha) para iniciar a reacção enzimática utilizando um dispensador automatizado.
  13. Agitar a placa de ensaio durante 1 min à temperatura ambiente a 1200 RPM utilizando um agitador de microplacas.
  14. Centrifugue a placa de ensaio a 101 x g durante 30 s.
  15. Certifique-se de que a temperatura interna do leitor de placas foi estabilizada a 25 ° c. Carregar a placa e agitar por mais 30 s. Esta etapa de agitação é necessária para fazer a forma da superfície líquida similar em cada poço e permite o tempo para que a placa alcangue a temperatura da medida.
  16. Grave a fluorescência NADH durante 30 minutos de digitalização da placa em intervalos de 45 s. Use um 380 Nm, filtro de excitação de largura de banda de 10 nm e um 470 nm, filtro de emissão de largura de banda de 24 nm em conjunto com um espelho de corte de 425 nm dichroic. Execute a medição no modo de alta concentração. Otimize o número de flashes, ganho do detector, dimensões da chapa e altura da medição antes de executar os ensaios.
    Nota: as condições finais do ensaio são 300 nM cardíaco/20 nM músculo esquelético miosina II, 10 μM de actina, 40 U/mL LDH, 200 U/mL PK, 220 μM NADH, 1 mM PEP, 1 mM ATP em um tampão contendo 10 mM MOPS (pH = 7,0), 2 mM MgCl2 , 0,15 mM EGTA, 0,1 mg/mL BSA, 0,5% (v/v) DMSO e 1 mM DTT. O volume total é de 20 μL/poço. A concentração final mais elevada do composto é 50 μM. 20 μM para-aminoblebbistatin em 0,5% DMSO serve como o controle positivo e 0,5% DMSO sozinho é o controle negativo. Todas as medições são realizadas em triplicates.

3. analisando dados

  1. Plotar a intensidade de fluorescência observada contra o tempo para cada poço.
  2. Realize uma regressão linear simples para determinar a inclinação e o intercepto das respostas de fluorescência para cada poço. A inclinação é proporcional à taxa de consumo de ATP (NADH), enquanto o intercepto é proporcional à concentração de NADH no início da medição (t = 0 s).
  3. Construa uma curva de calibração para NADH traçando as Interceptas obtidas para a primeira linha da placa contra a concentração de NADH. Certifique-se de que as Interceptas dependem linearmente sobre a concentração de NADH.
    Nota: as Interceptas estimam as intensidades de fluorescência reais em t = 0 s com muito mais confiança do que a média da intensidade da fluorescência bruta lê-se em t ≈ 0 s.
  4. Realize uma regressão linear simples para obter a inclinação e o intercepto da linha de calibração NADH.
    Nota: o intercepto descreve o sinal do fundo da fluorescência (nenhum NADH atual), quando a inclinação corresponder à intensidade extrapolada/teórica da fluorescência de uma solução de 1 M NADH nesse experimento particular.
  5. Divida a inclinação da resposta da fluorescência obtida para o descanso dos poços pela inclinação da linha da calibração de NADH para converter mudanças da fluorescência às taxas de consumo do ATP.
  6. Plotar as taxas de consumo de ATP contra a concentração do inibidor.
  7. Para determinar as constantes inibitórias, use o software estatístico apropriado para ajustar os dados da dose-resposta à seguinte equação quadrática correspondente a um modelo de equilíbrio de ligação um-para-um simples:
    figure-protocol-1
    onde y é a taxa de consumo de ATP, ymin é a taxa de consumo de ATP int a ausência de inibidor, yMax é a taxa de consumo teórico de ATP a 100% de inibição, KI é a constante inibitória , [E]t e [I]t são a concentração total da enzima (miosina) e o inibidor, respectivamente.

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Resultados

O mapa de layout de placa típico usado para experimentos de triagem é mostrado na Figura 1. As primeiras e as últimas fileiras são reservadas para a calibração de NADH e o controle positivo (20 μM para-aminoblebbistatin, 0,5% DMSO), respectivamente. As linhas restantes (B a O) são usadas para testar a atividade inibitória de compostos. Aqui, as diluições de série 1:2 de quinze passos que partem da concentração composta de 10 mM no DMSO são preparadas...

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Discussão

Etapas críticas no protocolo

Otimize o layout da placa executando várias placas com controle negativo somente (reação de ATPase sem inibidor). Inspecione os resultados cuidadosamente para padrões em taxas de reação. Por exemplo, estes podem surgir de efeitos de aresta e/ou imperfeições no revestimento de superfície hidrófilo de placas "não vinculantes". Se um padrão for observado, mude o tipo de chapa e/ou o layout da placa para minimizar os artefatos. Por exemplo, uma curva d...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por uma subvenção do Instituto Nacional de distúrbios neurológicos e AVC e Instituto Nacional de abuso de drogas NS096833 (CAM).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Microplaca de poliestireno NBS de fundo plano preto de flange baixa de 384 poçosCorning3575
ATP (hidrato de sal dissódico de adenosina 5′-trifosfato)DispensadorFRD-IB
AuroraDiscovery, Inc.
Estação de Trabalho de Automação de Laboratório Multicanal Biomek NXPBeckman CoulterA31841
BlebbistatinAMRIN/ASíntese personalizada
BSA (Albumina de Soro Bovino, Livre de Protease)Akron BiotechAK1391 
Centrífuga 5430 R, refrigerada, com rotor FA-35-6-30Eppendorf022620663
Centrífuga 5430, não refrigerada, com rotor A-2-MTPEppendorf022620568
DMSO (dimetilsulfóxido)  SigmaD2650
TDT (DL-Ditiotreitol)  Pipeta Multicanal SigmaD5545
E1 ClipTip; formato 384;Thermo Scientific 4672010
E1 ClipTip de 8 canais; Formato 96; ThermoScientific4672080
EGTA de 8 canais (Etilenoglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N′,N′-ácido tetracético)  LeitorE3889
EnVision 2104PerkinElmer2104-0010
Glicerol  SigmaG2025
LDH (L-Lactic Desidrogenase do músculo de coelho)SigmaL1254
MgCl2.6H2O (Cloreto de magnésio hexahidratado)  AgitadorM2670
VWR12620-926
Microplaca, 384 poços, PP, Pequeno Volume, Poço Profundo,Greiner Natural Bio-One784201
MOPS (ácido 3-(N-Morfolino)propanossulfônico)  SigmaM1254
Proteína Motora de Miosina (comprimento total) (músculo cardíaco bovino)Citoesqueleto MY03
Proteína Motora de Miosina (comprimento total) (músculo esquelético de coelho)Citoesqueleto MY02
NADH (β-Nicotinamida adenina dinucleotídeo, hidrato de sal dissódico reduzido)SigmaN8129
NaN3 (azida sódica)  Sigma71289
NaOH (Hidróxido de sódio)  Filtro Óptico SigmaS8045
CFP 470/24nm (Emissão)PerkinElmer2100-5850Código de Barras 240
Filtro Óptico Fura2 380/10nm (Excitação)PerkinElmer2100-5390Código de Barras 112
Módulo Óptico: Beta LactamasePerkinElmer2100-4270Código de Barras 418
OriginPro 2017 softwareOriginLabN/A
para-AminoblebbitatinaAMRIN/ASíntese personalizada
para-NitroblebistatinaAMRIN/ASíntese personalizada
PEP (sal monopotássico de ácido fosfo(enol)pirúvico)SigmaP7127
PK (piruvato quinase do músculo de coelho)SigmaP9136
Pó de acetonade coelho Pel Biológicos Freez41995-2
Aurora 00017425 Pipeta Multicanal de Placas Multietiquetas Sigma de Microplacas Sigma muscular

Referências

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