Uma adaptação semi-high-throughput do ensaio ATPase NADH-acoplado para a seleção de inibidores pequenos da molécula

Laszlo Radnai; Rebecca F. Stremel; James R. Sellers; Gavin Rumbaugh; Courtney A. Miller

doi:10.3791/60017

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Artigo de método

Uma adaptação semi-high-throughput do ensaio ATPase NADH-acoplado para a seleção de inibidores pequenos da molécula

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DOI:

10.3791/60017

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17 de agosto de 2019

Laszlo Radnai¹^,² , Rebecca F. Stremel¹^,² , James R. Sellers³ , Gavin Rumbaugh² , Courtney A. Miller¹^,²

¹Department of Molecular Medicine, The Scripps Research Institute, ²Department of Neuroscience, The Scripps Research Institute, ³Laboratory of Molecular Physiology, NHLBI, National Institutes of Health

Neste artigo

Resumo

Um ensaio de ATPase acoplado a nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADH) foi adaptado à triagem de taxa de transferência semialta de inibidores de miosina de pequena molécula. Este ensaio cinético é executado em um formato de microplaca de 384 poços com volumes de reação total de apenas 20 μL por poço. A plataforma deve ser aplicável a praticamente qualquer enzima produtora de ADP.

Resumo

As enzimas ATPase utilizam a energia livre armazenada em trifosfato de adenosina para catalisar uma grande variedade de processos bioquímicos endergônicos in vivo que não ocorreriam espontaneamente. Estas proteínas são cruciais para essencialmente todos os aspectos da vida celular, incluindo o metabolismo, divisão celular, respostas a mudanças ambientais e movimento. O protocolo aqui apresentado descreve um ensaio de ATPase acoplado a nicotinamida adenina dinucleotídeo que foi adaptado à triagem de taxa de transferência semialta de inibidores de ATPase de pequenas moléculas. O ensaio foi aplicado à miosina II do músculo cardíaco e esquelético, dois ATPases motores moleculares à base de actina, como prova de princípio. A hidrólise do ATP é acoplada à oxidação de NADH por reações enzimáticas no ensaio. Primeiramente, o ADP gerado pelo ATPase é regenerado ao ATP pelo piruvato kinase (PK). PK catalisa a transição de fosfoenolpiruvato (PEP) para piruvato em paralelo. Subseqüentemente, o piruvato é reduzido ao lactato pelo desidrogenase do lactato (LDH), que catalisa a oxidação de NADH paralelamente. Assim, a diminuição da concentração de ATP está diretamente correlacionada com a diminuição da concentração de NADH, que se segue da mudança para a fluorescência intrínseca da NADH. Contanto que o PEP esteja disponível no sistema de reação, a concentração de ADP permanece muito baixa, evitando a inibição da enzima ATPase pelo seu próprio produto. Além disso, a concentração de ATP permanece quase constante, produzindo cursos de tempo linear. A fluorescência é monitorada continuamente, o que permite uma fácil estimativa da qualidade dos dados e ajuda a filtrar artefatos potenciais (por exemplo, decorrentes de precipitação composta ou alterações térmicas).

Introdução

Myosins são transdutores de energia Mecanoquímica que hidrolisam trifosfato de adenosina (ATP) para gerar movimento direcional ao longo dos filamentos do citoesqueleto de actina em eucariontes^1,2^. Eles têm tanto estruturalmente e kineticamente adaptados às suas várias funções intracelulares, como o transporte de organelas, contração muscular ou a geração de tensão citoesquelética^1,2^. A superfamília da miosina é representada por ~ 40 genes de miosina pertencentes a ~ 12 classes distintas de miosina no genoma humano^3,4<....