Geração de modificações genómicas definidas usando CRISPR-CAS9 em células-tronco pluripotentes humanas

Células-tronco embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) são ferramentas valiosas para modelar a doença humana devido à sua capacidade de renovação, mantendo a capacidade de gerar tipos de células de diferentes linhagens^{1,2 ,3,4}. Estes modelos abrem a possibilidade interrogar a função do gene, e compreendem como as mutações e os fenótipos específicos são relacionados às várias doenças^5,6. No entanto, para entender como uma alteração específica está ligada a um fenótipo específico, o uso de um controle isogênico pareado e de linhagens celulares mutantes é importante para o controle da variabilidade da linha para a linha^7,8. A transcrição ativador-como os nucleases efetoras (TALENs) e os nucleases do dedo do zinco foram usados para gerar mutações da inserção ou do apagamento (indels) em modelos genéticos diversos, incluindo pilhas preliminares; Mas esses nucleases podem ser complicados de usar e caros^{9,10,11,12,13,14}. A descoberta da repetição palindromic curta interespaçada agrupada regularmente (CRISPR)-a nuclease de CAS9 revolucionou o campo devido à eficiência na formação do Indel em virtualmente toda a região do genoma, na simplicidade do uso, e na redução no custo^{15 , 16 anos} de ^{, 17} anos de ^{, 18 anos} de ^, a ¹⁹.

Um desafio em usar a tecnologia de edição baseada do genoma de CRISPR-CAS9 foi a geração ou a correção de mutações específicas em um alelo sem criar uma mutação do Indel no segundo alelo²⁰. O principal objetivo deste protocolo é superar esse desafio usando dois modelos de reparo de oligonucleotídeo (ssODN) de cadeia única para reduzir a formação de Indel no segundo alelo. Ambos ssODNs são projetados para conter mutações silenciosas para evitar o re-corte pela nuclease CAS9, mas apenas um contém a alteração de interesse. Este método aumenta a eficiência de gerar uma modificação genética heterozygous específica sem induzir a formação do Indel no segundo alelo. Usando este protocolo, as experiências de edição do gene em seis posições genomic independentes demonstram a introdução exata da mudança genomic desejada em um alelo sem formação do Indel no segundo alelo e ocorre com uma eficiência total de ~ 10%. O protocolo descrito foi adaptado de Maguire et al.²¹.

1. projeto e construção do RNA do guia (gRNA)

Nota: cada gRNA é composto de 2 60 pares de base (BP) oligonucleotídeos que são recozidos para gerar um 100 BP duplo encalhado (DS) oligonucleotide (Figura 1a-C). A linha do tempo para o projeto gRNA, geração e eficiência de corte de testes é de aproximadamente 2 semanas (Figura 2).

1. Selecione a região de DNA de interesse a ser editado pelo genoma e identifique 3-4 23 sequências BP que se encaixam no formato, 5 '-G (N₁₉) NGG-3 '. Essas sequências devem ser localizadas dentro de 20 BP da região de interesse.
   Observação: a segmentação pode ser realizada no sentido ou na vertente antisense.
2. Avalie as sequências de gRNA para redundância genômica e probabilidade fora do alvo usando um recurso como CRISPOR (http://crispor.tefor.net).
3. Incorpore a sequência alvo de 20 BP (excluindo o motivo adjacente do protoespaçador ou PAM) em oligonucleotídeos 2 60-Mer como mostrado (as sequências são 5 ' a 3 ' e vermelho e verde são complementos inversos como mostrado na Figura 1C).
4. Encomende o 2 60 BP oligonucleotídeos do fornecedor de escolha. Uma vez que os oligonucleotídeos são recebidos, ressuscitem cada um a uma concentração final de 100 μm em DDH₂O. faça um estoque de trabalho de 10 μm.
5. Anneal os dois oligonucleotídeos e geram um fragmento de dsDNA de 100 BP usando o polymerase do ADN (tabela dos materiais). Combine 5 μL do oligonucleotide dianteiro de 10 μM e 5 μL do oligonucleotide reverso de 10 μM em um tubo da tira da reacção em cadeia do polymerase (PCR) e incubar em 95 ° c por 5 minutos. refrigere a reação por 10 minutos na temperatura ambiente (RT).
6. Configurar o PCR como descrito na tabela 1. Realize a amplificação de PCR em um ciclador térmico utilizando os parâmetros descritos na tabela 2.
7. Visualize os produtos do PCR em um gel do Agarose do brometo do etídio de 1,5% (w/v) (EtBr) electrophoresed em 80-100 v para 40 min. extirpar a faixa de 100 BP (Figura 3a), visualizado em uma caixa leve do diodo emissor de luz, do gel usando uma lâmina de navalha e purificar usando um gel Kit de extração (tabela de materiais).

2. projeto de primers do PCR para a seleção

1. Realize a triagem do DNA editado usando primers de PCR para diante e reverso que são projetados especificamente para amplificar uma região de 400-500 BP do gene de interesse (tabela 2). Use o ADN isolado de toda a linha do iPSC do controle para confirmar um amplicon limpo ao executar o PCR da seleção.
2. Visualize produtos do PCR em um gel de 1,5% (w/v) que segue a electroforese em 80-100 V para 1 h.
   Nota: o sequenciamento de clones editados é realizado usando uma cartilha aninhada que é projetada após a confirmação do conjunto de primer de triagem. As amostras são enviadas para uma fonte comercial para seqüenciamento.

3. preparação de plasmídeo vetorial gRNA_cloning

1. Para linearizar o vetor de clonagem, tome um tubo de centrifugação de 1,5 mL e adicione 1-5 μg de DNA do vetor gRNA_cloning juntamente com 4 μL do tampão enzimático de restrição AFLii e 1,5 μL de enzima de restrição AFLII. Coloque a reacção a 24 μL de ddH₂o. Misture a reacção introduzindo a pipting para cima e para baixo. Incubar a 37 ° c durante a noite (O/N).
2. Electrophorese em um gel do agarose de 1% em 80-100 V para 1 h e as faixas do imposto (o tamanho de faixa esperado são ~ 3519 BP).
3. Extraia e purifique como na etapa 1,6.

4. montagem do vetor gRNA

1. Configurar reações e montar fragmentos de DNA usando o kit de montagem (tabela de materiais) em 1:5 rácios de AFLII digerido grna clonagem de vetor para 100 BP gel purificada inserir, conforme descrito na tabela 3.
2. Incubar a reacção a 50 ° c durante 15 min. diluir a reacção 1:3 em ddH₂o e utilizar 3 μl para transformação bacteriana, de acordo com as instruções do fabricante (tabela de materiais). Células de placa em placas de canamicina lb/agar.
3. Escolha 3-5 colônias por gRNA. Inocular cada colônia em 4 mL de LB e crescer O/N a 37 ° c em uma incubadora de agitação orbital.
4. Purifique o DNA plasmídeo usando um kit de isolamento de plasmídeo protocolo e sequencia cada grna usando os seguintes primers para garantir a clonagem bem-sucedida: forward: gtacaaaaaagcaggctttaaagg; Reverso: TGCCAACTTTGTACAAGAAAGCT.

5. teste gRNA eficiência de corte

1. HESCs da placa em fibroblastos embrionários murino irradiados (mefs) em uma placa de 6 poços, como descrito previamente²¹. Quando as células atingem 70-80% de confluência, prepare o Mix mestre de transfecção delineado na tabela 4.
2. Misture com pipetagem e incubar em RT durante 15 min. Adicionar gota gota às células e incubar a 37 ° c por 48 h (com uma mudança de mídia após 24 h).
3. Células de colheita para classificação após 48 h.
   1. Remover MEFs enzimaticamente (tabela de materiais) com uma incubação de 3 min RT.
   2. Lave as células 1x com meio hESC (tabela 5) e raspe em meio hESC + 10 μm Y-27632 dicloridrato de (tabela de materiais).
   3. Células da pelota a 300 x g por 3 min e ressuscição em 0,5 ml de meio hESC + 10 μm Y-27632 dicloridrato.
   4. Filtre em um tubo de 5 mL através de uma tampa de filtro de células de 35 μm.
4. Usando a triagem de células ativadas por fluorescência (FACS), portão em células ao vivo e classificar as células positivas de proteína verde fluorescente (GFP).
5. Transfira um máximo de 1,5 x 10⁴ células ordenadas diretamente em um prato de 10 cm² revestido com 1:3 matriz de membrana basal (tabela de materiais) e Mefs irradiados em meio hESC (tabela 5) contendo dicloridrato de Y-27632.
6. Mude o meio diário usando o meio hESC (tabela 5) sem o dicloridrato de de Y-27632 e escolha manualmente clones após 10-15 dias, quando as colônias são ~ 1 milímetro no diâmetro.
   1. Usando uma pipeta e um microscópio de P200, raspe com cuidado um único clone e extraia pilhas na pipeta.
   2. Dispersar as células gentilmente pipetando 3-4x em uma placa de 96 bem no meio elaborado com a colônia.
   3. Dispense em tubos de tiras de PCR para triagem e pellet as células por centrifugação em 10.000 x g por 5 min. Pick 20 colônias por grna.

6. rastreio de clones

1. Isole o DNA incubando pelotas de células em 20 μL de tampão proteinase K (tabela 5) (1 h a 55 ° c e 10 min a 95 ° c) e vórtice vigorosamente. Centrifugar a 10.000 x g durante 5 min e recolher o sobrenadante.
2. Realize a triagem de PCR (seção 2) em um volume total de 20 μL usando uma mistura mestra, incluindo primers projetados para amplificar a região de interesse e 5 μL da síntese de proteinase K. Use o ADN genomic isolado da linha celular que era gene editado como um controle.
3. Avalie as alterações de tamanho dos produtos de PCR após 1 h eletroforese a 70-90 V em um gel de agarose 2,5% (w/V) (Figura 3B, C). Qualquer diferença de tamanho é indicativa de clivagem.

7. edição precisa do genoma em pilhas de haste pluripotentes usando o único ADN do oligo da Costa (ssODNs)

1. Design 100 BP ssODNs centrado em torno da seqüência gRNA mais eficiente determinado a ter a melhor eficiência de corte.
2. Impeça o re-Cleavage do ODN recombined introduzindo mutações silenciosas na seqüência do gRNA. Uma única mutação silenciosa na seqüência PAM é suficiente, mas se não for possível, 3-4 mutações silenciosas funcionarão.
   Nota: para facilitar a triagem de clones direcionados, a introdução de um local de restrição dentro de ~ 20 BP da seqüência gRNA é ideal.
3. Projete um ODN com as mudanças de base desejadas para criar a mutação do interesse e um ODN sem a mudança da base (s).
   Nota: estas alterações não devem ser mais do que ~ 20 BP do local de corte CRISPR/CAS9 previsto, uma vez que a recombinação cai consideravelmente a distâncias maiores.
4. Encomendar os dois ssODNs do fornecedor de escolha e ressuscita na água para fazer 1 μg/μL estoques. Armazene estoques em-20 ° c.

8. instalação do transfection

1. Para transfecção o ssodn e os Plasmids de crispr-CAS9, a placa a linha de pilha do alvo em um prato de 6 poços em mefs irradiados para alcangar 70-80% confluência após uma incubação de o/N.
2. Configurar a reação de transfecção conforme descrito na tabela 6. Misture a reacção introduzindo pipetagem e incubar durante 15 min em RT. Adicione a mistura de reação de transfecção gota gota às células.
3. Após 48 h, prepare as células para classificação de células conforme descrito na seção 5,3.
4. Escolha colônias ~ 10 dias após o chapeamento de células individuais usando uma pipeta 200 μL. Transfira 100 μL de células para um poço de uma placa de 24 ou 48 poços previamente revestida com gelatina e MEFs irradiados em meio hESC com dicloridrato de Y-27632. Utilize os restantes 100 μL para isolamento de ADN, conforme descrito na secção 6.

9. verificação de mutações em colônias únicas

1. Para verificar a integração bem-sucedida do ssODN, tome 5 μL de DNA isolados de cada colônia para realizar a PCR usando os primers de triagem projetados na seção 2. Purify os produtos do PCR (tabela dos materiais) e prepare a digestão da enzima da limitação usando o local original da enzima criado no ssODN.
   Nota: esta digestão também inclui o tampão da enzima de restrição e a concentração recomendada pelo fabricante de enzima de restrição num volume de 40 μL.
2. Misture a reacção introduzindo pipetagem e incubar a temperatura recomendada pelo fabricante durante 1-3 h.
3. Visualize os produtos digeridos do PCR em um gel do Agarose do EtBr de 1,5% (w/v) electrophoresed em 80-100 V para 40 minutos. Se a integração bem-sucedida do ssODN ocorreu, sequencia mutações específicas usando uma cartilha aninhada.

Geração de gRNAs e triagem para indels

Cada gRNA será clonado em um vetor de plasmídeo e expressado usando o promotor U6. A enzima de restrição AFLII é usada para linearizar o plasmídeo (addgene #41824) e está localizada após o promotor U6. A faixa de 100 BP gerada após o recozimento do 2 60 BP oligos é clonada no vetor da expressão de gRNA usando o conjunto do ADN. Uma vez que os plasmídeo de grna são gerados, são transfected em hESCs ou em iPSCs junto com um plasmídeo de Crisps-CAS9 GFP (addgene #44719). As células GFP + são classificadas após 2 dias para enriquecer as células transfectadas e banhadas (ver secção 5). Após 10-14 dias, colônias derivadas de células únicas são colhidas e usadas para isolar o DNA para a tela para formação de Indel gerada para cada gRNA. Uma amplificação do PCR com os primers que medem o local do gRNA é usada para visualizar a formação do Indel usando um gel do agarose de 2,5% (w/v) com EtBr, electrophoresed em 70-90 V para 1 h.

Geração de 100 BP ssODN para introduzir mutações específicas

Dois ssODN oligos são projetados em torno do gRNA com o corte mais eficiente. Cada gRNA é 100 BP e contém mutações silenciosas, preferencialmente na seqüência PAM, para evitar o recorte (figura 4a). Uma mutação silenciosa na seqüência PAM pode gerar um local de restrição exclusivo, que ajuda a tela para uma integração bem-sucedida em um ou dois alelos (Figura 4B).

resultados de recombinação de ssODN

Usando este protocolo, a frequência de eventos de segmentação para seis genes diferentes usando a abordagem de dois ssODN é mostrada na Figura 5. Examinando a modificação genomic no local do grna em ambos os alelos, os resultados diferentes foram esperados including o recombinação do tipo selvagem (WT) ssodn, o ssodn do mutante e a formação do INDEL. Os clones em que apenas um alelo havia sido submetido à recombinação, o desfecho mais comum foi a formação de Indel no segundo alelo (10-42%). Os clones que tiveram a integração do ssODNs em ambos os alelos conduziram a três resultados diferentes: 1) integração do WT ssODN em ambos os alelos (0-8%), 2) integração do ssODN do mutante em ambos os alelos (0-25%), e 3) integração do WT e do peso ssODN do mutante (8-21%).

Figura 1: visão geral da geração de gRNA. (A) na região de interesse, projetar quatro grnas terminando em gg que não são mais de 20 BP distante. (B) cada grna de 23 BP tem uma sequência Pam de NGG na extremidade 3 '. (C) os primers 60 BP são constituídos por uma sequência de 40 PB complementar ao plasmídeo da espinha dorsal do grna e a sequência de 20 BP grna sem a sequência Pam. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: cronograma do protocolo para geração de gRNA e rastreamento de clones. A linha do tempo para geração de gRNA e clones de triagem é mostrada. Projetar e clonando plasmídeos da expressão de grna toma aproximadamente uma semana. Aproximadamente 48 horas após o transfection em PSCs humanos, as pilhas de GFP + são classificadas e chapeadas na diluição de limitação. As colônias devem ser visíveis entre 7-10 dias e aproximadamente dia 20, clones podem ser escolhidos para triagem, expansão e confirmação de sequência. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: teste de gRNA para a eficiência do corte. (A) para a construção de grna, uma faixa de 100 BP é extirpada de um gel do agarose de 1,5%. (B) após o transfection da pilha, a validação do corte de grna é visualizada usando um gel do agarose de 2,5%. Um produto do PCR de 180 BP é usado para verific para obter a formação do Indel em que um controle uncut e uns clones diferentes são analisados para deslocamentos da faixa indicativos da formação do INDEL. (C) diferentes grnas podem ter diferentes eficiências de corte. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: geração e triagem de mutações usando dois ssODNs. (A) para evitar o recorte CRISPR-CAS9 dos alelos editados, a sequência Pam pode ser modificada usando uma mutação silenciosa de G para a. Essa modificação adiciona um site de restrição EcoRI exclusivo que pode ser usado para triagem. Além desta mutação silenciosa, o mutante ssODN contém a mudança de base desejada. (B) a triagem para recombinação de oligonucleotídeo usando a digestão da enzima de restrição EcoRI pode resultar em três desfechos possíveis: nenhum corte representado por uma faixa de WT a ~ 650 BP, recombinação em um alelo representado por uma faixa sem cortes de 650 BP e duas bandas menores ou inserção em ambos os alelos representados por apenas bandas menores. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: eficiência e resultados da integração de ssODN. A eficiência e os resultados da integração da aproximação de dois ssODN foram determinados analisando seis genes diferentes. Se somente um ssODN integrou, a formação do Indel foi detectada geralmente no outro alelo. Se dois ssODNs integrados, três resultados possíveis foram detectados, como mostrado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: condições de clonagem de gRNA de PCR.

Tabela 2: parâmetros de ciclagem de PCR.

Tabela 3: condições de reação do conjunto gRNA.

Tabela 4: mistura mestre de transfecção celular.

Tabela 5: meio de cultura celular e tampão de digestão da proteinase K.

Tabela 6: mistura do mestre da transfecção da pilha de ssODN.

Os autores não têm nada a revelar.