Summary
이 프로토콜은 인간 다능성 줄기 세포에서 CRISPR-CAS9를 사용하여 정의된 이형 이형 또는 동형접합 뉴클레오티드 변화의 생성을 용이하게 하는 방법을 제공한다.
Abstract
인간의 다능성 줄기 세포는 유전자 기능을 연구하고 질병과 관련된 특정 돌연변이를 모델링하는 강력한 시스템을 제공합니다. 정확한 이형 유전 적 변형의 생성은 CRISPR-CAS9가 두 번째 알레일에서 인델 형성을 매개했기 때문에 도전적입니다. 여기서는 두 템플릿 모두 재절단 및 인델 형성을 방지하기 위해 자동 돌연변이를 포함하는 반면, 하나의 복구 템플릿만 이 문제를 극복하는 데 도움이 되는 프로토콜을 시연합니다. 이 방법론은 인간 질병 및 생물학을 공부하기 위한 이원성 제어 및 돌연변이 인간 줄기 세포주를 생성하는 DNA의 유전자 편집 코딩 영역에 가장 유리하다. 또한 유전자 편집 실험의 인건비와 비용을 줄이기 위해 형질전환 및 스크리닝 방법론의 최적화가 수행되었습니다. 전반적으로, 이 프로토콜은 인간 다능성 줄기 세포 모델을 활용하는 많은 게놈 편집 프로젝트에 널리 적용가능하다.
Introduction
인간 배아 줄기 세포 (hESCs) 및 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)는 다른 혈통의 세포 유형을 생성하는 능력을 유지하면서 재생 능력으로 인해 인간 질병을 모델링하기위한 귀중한도구입니다1,2 ,3,4. 이들 모델은 유전자 기능을 심문할 수 있는 가능성을 열어주며, 특정 돌연변이와 표현형이 다양한질병과어떻게 관련되어 있는지 를 이해한다5,6. 그러나, 특정 변경이 특정 표현형에 어떻게 연결되는지 이해하기 위하여, 쌍이성 등소제 학적 제어 및 돌연변이 세포주의 사용은 라인 대 라인 가변성7,8에대한 제어에 중요하다. 전사 활성제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALENs) 및 아연 핑거 뉴클레아제는 1차 세포를 포함한 다양한 유전 모델에서 삽입 또는 결실(indels) 돌연변이를 생성하는데 사용되어 왔다; 그러나 이 뉴클레아제는 9,10,11,12,13,14를사용하는 것이 번거로울 수 있습니다. 클러스터된 정기적인 간격짧은 palindromic 반복 (CRISPR)-CAS9 뉴클레아제의 발견은 게놈의 거의 모든 영역에서 인델 형성의 효율성, 사용의 단순성 및 비용 절감으로 인해 분야에 혁명을 일으켰습니다15 , 16세 , 17세 , 18세 , 19.
CRISPR-CAS9 기반 게놈 편집 기술을 사용하는 데 있어 도전과제는 제2 대문자20에서인델 돌연변이를 생성하지 않고 하나의 대문자에서 특정 돌연변이의 생성 또는 보정이었다. 이 프로토콜의 주요 목표는 두 개의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드(ssODN) 수리 템플릿을 사용하여 제2 대문에서 의인 형성을 감소시킴으로써 이러한 과제를 극복하는 것이다. 두 ssODN은 CAS9 뉴클레아제에 의한 재절단을 방지하기 위해 자동 돌연변이를 포함하도록 설계되었지만, 오직 하나만이 관심의 변경을 포함하고 있다. 이 방법은 제2 대문예에서 인델 형성을 유도하지 않고 특정 이형 유전적 변형을 생성하는 효율을 증가시킨다. 이 프로토콜을 사용하여, 6개의 독립적인 게놈 위치에서의 유전자 편집 실험은 두 번째 알레르에서 인델 형성없이 하나의 대틀에서 원하는 게놈 변화의 정확한 도입을 입증하고 ~ 10%의 전반적인 효율로 발생한다. 기재된 프로토콜은 Maguire 외21에서적응되었습니다.
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Protocol
1. 가이드 RNA (gRNA)의 설계 및 건설
참고: 각 gRNA는 100 bp 이중 연선(ds) 올리고뉴클레오티드(그림1A-C)를생성하기 위해 어닐링되는 2개의 60염기쌍(bp) 올리고뉴클레오티드로 구성된다. gRNA 설계, 생성 및 테스트 절단 효율에 대한 타임라인은 약 2주입니다(그림2).
- 유전체 편집할 관심 있는 DNA 영역을 선택하고 형식에 맞는 3-4 23 bp서열을 식별, 5'-G(N 19)NGG-3'. 이러한 서열은 관심 영역의 20 bp 내에 위치해야 합니다.
참고: 타겟팅은 감지 또는 안티센스 가닥에서 수행할 수 있습니다. - CRISPOR(http://crispor.tefor.net)와 같은 자원을 사용하여 게놈 중복 성 및 오프 타겟 확률에 대한 gRNA 서열을 평가합니다.
- 도시된 바와 같이 20bp 표적 서열(프로토스페이서 인접 모티프 또는 PAM 제외)을 2개의 60-mer 올리고뉴클레오티드(서열은 5' ~ 3'이고 적색 및 녹색은 도 1C에도시된 바와 같이 역보수)에 통합한다.
- 선택의 공급 업체에서 두 60 bp 올리고 뉴클레오티드를 주문합니다. 올리고뉴클레오티드가 수신되면, ddH2O. 10 μM의 작동 스톡을 만들어 100 μM의 최종 농도로 각각 재중단한다.
- 두 올리고뉴클레오티드를 어닐레에 DNA 폴리머라제(표자료)를이용하여 100 bp dsDNA 단편을 생성한다. 5 μL의 10 μM 포워드 올리고뉴클레오티드 및 10 μM의 역 올리고뉴클레오티드를 중합효소 연쇄 반응(PCR) 스트립 튜브에 결합하고 95°C에서 5분간 배양합니다.
- 표 1에설명된 대로 PCR을 설정합니다. 표 2에 설명된 매개 변수를 사용하여 열 주기에서 PCR 증폭을 수행합니다.
- PCR 제품을 1.5% (w/v) 에티듐 브로마이드(EtBr) 아가로즈 젤을 80-100V에서 40분 동안 40분 동안 전기화시켰다. 추출 키트(재료 표).
2. 스크리닝을 위한 PCR 프라이머 설계
- 관심 있는 유전자의 400-500 bp 영역을 증폭하도록 특별히 설계된 전진 및 역방향 PCR 프라이머를 사용하여 편집된 DNA의 스크리닝을 수행한다(표2). 임의의 대조군 iPSC 라인에서 분리된 DNA를 사용하여 스크리닝 PCR을 수행할 때 깨끗한 앰플리콘을 확인한다.
- 1시간 동안 80-100V에서 전기영동을 한 후 1.5%(w/v) 젤로 PCR 제품을 시각화합니다.
참고: 편집된 클론의 시퀀싱은 스크리닝 프라이머 세트의 확인 후 설계된 중첩 프라이머를 사용하여 수행됩니다. 시퀀싱을 위해 시료를 상용 소스로 보냄.
3. gRNA_복제 벡터 플라스미드의 준비
- 복제 벡터를 선형화하려면 1.5 mL 원심분리기 튜브를 취하고 AflII 제한 효소 완충제의 4 μL과 함께 gRNA_클로닝 벡터의 DNA 1-5 μg를 추가하고 AflII 제한 효소의 1.5 μL을 추가합니다. ddH2O. 24 μL의 반응을 불러오십시오. 밤새 37 °C에서 배양하십시오 (O / N).
- 전기포어는 80-100 V에서 80-100 V에서 1 시간 및 소비세 대역에 대한 1% 아가로즈 겔에 (예상 밴드 크기는 ~ 3519 bp이다).
- 1.6단계에서와 같이 추출및 정제한다.
4. gRNA 벡터의 조립
- 표 3에기재된 바와 같이 AflII 소화gRNA 클로닝 벡터의 1:5 비율로 1:5 비율로 반응을 설정하고 DNA 단편을 조립한다.
- 50°C에서 15분 동안 배양하여 ddH2O에서 반응을 1:3 희석하고 제조자의 지시에 따라 세균 변환을 위해 3 μL을사용한다(재료 표). 카나마이신 LB/한천 플레이트의 플레이트 셀.
- gRNA당 3-5개의 콜로니를 선택합니다. 각 콜로니를 LB 4 mL로 접종하고 궤도 흔들림 인큐베이터에서 37°C에서 O/N을 성장시다.
- 미니프렙 플라스미드 절연 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 정화하고, 성공적인 복제를 보장하기 위해 다음 프라이머를 사용하여 각 gRNA를 서열화한다: 앞으로: GTACAAAAAAAAAAAAAAAGCAGGTTAAGGAAGGAAGG; 역: TGCCAACTTTGTACAAAGCT.
5. 테스트 gRNA 절단 효율
- 앞서 설명한바와같이 6웰 플레이트에서 조사된 뮤린 배아 섬유아세포(MEFs)에 대한 플레이트 hESCs. 세포가 70-80% 동률에 도달하면 표 4에설명된 형질감염 마스터 믹스를 준비합니다.
- 파이펫팅하고 RT에서 15 분 동안 배양하여 혼합하십시오. 세포에 드롭 와이즈를 추가하고 37 °C에서 48 시간 동안 배양하십시오 (24 시간 후 미디어 변경).
- 48 시간 후에 분류하기위한 수확 세포.
- 3분 RT 인큐베이션으로 MEF를 효소적으로 제거합니다(재료표).
- hESC배지로세포를 1x 헹구고 hESC 배지 + 10 μM Y-27632 다수소염화물(재료 표)로긁어냅니다.
- 펠릿 세포는 300 x g에서 3 분 동안 hESC 배지 + 10 μM Y-27632 디하이드로 클로라이드의 0.5 mL에서 재중단.
- 35 μm 셀 스트레이너 캡을 통해 5 mL 튜브로 필터링합니다.
- 형광 활성화 세포 선별(FACS)을 사용하여, 살아있는 세포에 대한 게이트및 녹색 형광 단백질(GFP) 양성 세포를 정렬한다.
- 최대 1.5 x 104 개의 분류 된 세포를 1:3 지하 멤브레인 매트릭스(재료 표)로코팅 한 10cm2 접시에 직접 옮기고 Y-27632 디하이드로 염화물을 함유 한 hESC 배지(표 5)에조사 된 MEF를 조사합니다.
- Y-27632 디하이드로클로라이드없이 hESC 배지(표 5)를사용하여 매일 배지를 변경하고 콜로니가 직경이 ~ 1mm인 경우 10-15 일 후에 수동으로 클론을 선택합니다.
- P200 파이펫과 현미경을 사용하여 조심스럽게 단일 클론을 긁어 내고 피펫에 세포를 그립니다.
- 콜로니와 함께 그려진 배지에서 96 웰 플레이트에서 3-4x를 부드럽게 피펫팅하여 세포를 분산시.
- 5 분 동안 10,000 x g에서 원심 분리하여 세포를 스크리닝하고 펠릿을 위해 PCR 스트립 튜브에 분배하십시오.
6. 복제 스크리닝
- 단백질화 K 완충액의 20 μL에서 세포 펠릿을 배양하여 DNA를 분리(표 55°C에서 1 시간 및 95 °C에서 10 분) 및 와류를 힘차게. 10,000 x g에서 5 분 동안 원심 분리기를 수집하고 상류를 수집합니다.
- 단백질분해제 K 다이제스트의 관심 영역 및 5 μL을 증폭하도록 설계된 프라이머를 포함하는 마스터 믹스를 사용하여 총 부피 20 μL에서 스크리닝 PCR(섹션 2)을 수행한다. 유전자가 대조군으로서 편집된 세포주로부터 분리된 게놈 DNA를 사용한다.
- 2.5% (w/v) 아가로즈 겔(그림 3B,C)에70-90 V에서 1 시간 전기 영동 다음 PCR 제품의 크기 변화를 평가합니다. 크기 차이는 분열을 나타냅니다.
7. 단일 가닥 올리고 DNA (ssODN)를 사용하여 다능성 줄기 세포에서 정확한 게놈 편집
- 설계 100 bp ssODN은 최고의 절단 효율을 가지는 것으로 결정된 가장 효율적인 gRNA 서열을 중심으로 합니다.
- gRNA 서열에 침묵하는 돌연변이를 도입하여 재결합된 ODN의 재절단을 방지한다. PAM 서열에서 단일 무음 돌연변이는 충분하지만 가능하지 않은 경우 3-4 개의 자동 돌연변이가 작동합니다.
참고: 표적 클론의 스크리닝을 용이하게 하기 위해, gRNA 서열의 ~20 bp 이내의 제한 부위의 도입이 이상적이다. - 원하는 염기 변경으로 하나의 ODN을 설계하여 베이스 변경 없이 관심 있는 돌연변이와 하나의 ODN을 생성합니다.
참고: 이러한 변경 사항은 더 먼 거리에서 재조합이 상당히 떨어지기 때문에 예측된 CRISPR/CAS9 절단 사이트에서 ~20bp 를 넘지 않아야 합니다. - 2개의 ssODN을 선택한 공급업체에서 주문하고 물에 다시 일시 중단하여 1 μg/μL 스톡을 만듭니다. -20 °C에서 주식을 저장합니다.
8. 형질 감염 설정
- ssODN 및 CRISPR-CAS9 플라스미드를 트랜스펙트하기 위해, O/N 인큐베이션 후 70-80% 수렴에 도달하기 위해 조사된 MEF에 6웰 접시에 표적 세포줄을 플레이트한다.
- 표 6에기재된 바와 같이 형질감염 반응을 설정한다. 파이펫팅에 의해 반응을 혼합하고 RT에서 15 분 동안 배양. 형질전환 반응 혼합물을 세포에 드롭 와이즈를 추가합니다.
- 48시간 후, 섹션 5.3에 기재된 바와 같이 세포 정렬을 위한 세포를 준비한다.
- 200 μL 파이펫을 사용하여 단일 세포를 도금 한 후 ~ 10 일 동안 식민지를 선택하십시오. 100 μL의 세포를 이전에 젤라틴으로 코팅한 24 또는 48 웰 플레이트 중 하나에 전달하고 Y-27632 디하이드로클로라이드로 hESC 배지에 조사된 MEF를 조사하였다. 섹션 6에 기재된 바와 같이 DNA 격리를 위해 나머지 100 μL을 사용한다.
9. 단일 식민지에서 돌연변이 확인
- ssODN의 성공적인 통합을 확인하려면, 섹션 2에서 설계된 스크리닝 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하기 위해 각 콜로니로부터 분리된 DNA의 5 μL을 취하십시오. PCR제품(재료표)을정화하고 ssODN에서 생성된 독특한 효소 부위를 이용하여 제한 효소 소화를 준비한다.
참고: 이 소화에는 제한 효소 완충제와 제조업체가 권장하는 제한 효소 농도가 40 μL의 양으로 포함되어 있습니다. - 파이펫팅하여 반응을 혼합하고 제조업체의 권장 온도에서 1-3 시간 동안 배양하십시오.
- 소화된 PCR 제품을 1.5% (vv) EtBr 아가로즈 젤에 80-100V에서 40분 동안 전기로 가다. ssODN의 성공적인 통합이 발생한 경우, 중첩된 프라이머를 사용하여 특정 돌연변이를 시퀀스한다.
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Representative Results
인델에 대한 gRNA 생성 및 스크리닝
각 gRNA는 플라스미드 벡터로 복제되고 U6 프로모터를 사용하여 발현될 것이다. AflII 제한 효소는 플라스미드(addgene #41824)를 선형화하는 데 사용되며 U6 프로모터 의 후에 위치한다. 2개의 60 bp 올리고를 어닐링한 후에 생성된 100 bp 대역은 DNA 조립체를 사용하여 gRNA 발현 벡터내로 복제된다. gRNA 플라스미드가 생성되면, 그들은 CRISPS-CAS9 GFP 플라스미드(addgene #44719)와 함께 hESCs 또는 iPSCs로 형질감염된다. GFP+ 세포는 형질감염된 세포를 풍부하게 하기 위해 2일 후에 분류되고 도금된다(섹션 5 참조). 10-14일 후에, 단세포 유래 식민지는 각 gRNA를 위해 생성된 인델 형성을 위해 DNA를 선별하고 분리하는 데 사용된다. gRNA 부위에 걸친 프라이머를 이용한 PCR 증폭은 EtBr을 이용한 2.5%(w/v) 아가로즈 겔을 사용하여 인델 형성을 시각화하는 데 사용되며, 전기 영동은 1시간 동안 70-90V로 사용된다.
특정 돌연변이를 도입하기 위한 100bp ssODN 생성
2개의 ssODN 올리고는 가장 효율적인 절단을 가진 gRNA를 중심으로 디자인됩니다. 각 gRNA는 100 bp이고 재절단을 피하기 위해, 바람직하게는 PAM 서열에서 침묵하는 돌연변이를 함유한다(도4A). PAM 서열에서의 무음 돌연변이는 하나 또는 두 개의 알레일(도4B)에성공적으로 통합을 위해 스크리브하는 데 도움이 되는 독특한 제한 부위를 생성할 수 있다.
ssODN 재조합 결과
이 프로토콜을 사용하여, 2개의 ssODN 접근법을 사용하여 6개의 상이한 유전자에 대한 표적화 이벤트의 빈도는 도 5에나타내고 있다. 두 절기모두에서 gRNA 부위에서 게놈 변형을 조사함으로써, 야생형(WT) ssODN, 돌연변이 ssODN 및 인델 형성의 재조합을 포함하여 상이한 결과가 예상되었다. 단 하나의 알레만이 재결합을 겪은 클론은 가장 일반적인 결과는 두 번째 알레일 (10-42 %)에서 인델 형성이었습니다. 두 절전항에 ssODN을 통합한 클론은 세 가지 상이한 결과를 초래했습니다: 1) 두 알레이모두에서 WT ssODN의 통합(0-8%), 2) 둘 다에 돌연변이 ssODN의 통합(0-25%), 및 3) WT 및 돌연변이 ssODN WT(8-21%)의 통합.
그림 1: gRNA 생성 개요. (A)관심 영역에서 는 20bp 를 초과하지 않는 GG로 끝나는 4개의 gRNA를 설계합니다. (B)23 bp의 각 gRNA는 3' 말단에서 NGG의 PAM 서열을 갖는다. (C)60 bp 프라이머는 PAM 서열없이 gRNA 백본 플라스미드 및 20 bp gRNA 서열에 상보적인 40 bp 서열로 구성된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: gRNA 생성 및 복제 스크리닝을 위한 프로토콜 타임라인. gRNA 생성 및 스크리닝 클론에 대한 타임라인이 도시된다. gRNA 발현 플라스미드를 설계하고 복제하는 데는 약 1주일 정도 걸립니다. 인간 PSCs로 형질전환 후 약 48시간 후에 GFP+ 세포는 희석을 제한하여 분류되고 도금됩니다. 콜로니는 7-10 일 사이에 볼 수 있어야하고 약 20 일, 클론은 선별, 확장 및 서열 확인을 위해 선택 될 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 절단 효율을 위한 gRNA 시험. (A)gRNA 시공의 경우, 1.5% 아가로즈 겔로부터 100 bp 대역을 절제한다. (B)세포 형질감염 후, gRNA 절단의 유효성검사는 2.5% 아가로즈 겔을 사용하여 가시화된다. 180 bp PCR 생성은 인델 형성을 나타내는 대역 이동에 대해 절단되지 않은 제어 및 다른 클론이 분석되는 인델 형성을 확인하는 데 사용됩니다. (C)다른 gRNA는 다른 절단 효율을 가질 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 2개의 ssODN을 사용하여 돌연변이의 생성 및 스크리닝. (a)편집된 대두의 CRISPR-CAS9 재절단을 방지하기 위해, PAM 서열은 G to A 무음 돌연변이를 사용하여 수정될 수 있다. 이 수정은 스크리닝에 사용할 수 있는 고유한 EcoRI 제한 사이트를 추가합니다. 이러한 침묵하는 돌연변이 이외에, 돌연변이 ssODN은 원하는 염기 변화를 포함한다. (B)에코RI 제한 효소 소화를 사용하여 올리고뉴클레오티드 재조합에 대한 스크리닝은 세 가지 가능한 결과를 초래할 수 있습니다: ~650 bp에서 WT 대역으로 표현되는 절단 없음, 650 bp및 2의 절단되지 않은 밴드로 대표되는 하나의 단조로 재조합 작은 밴드 또는 두 eeles에 삽입만 작은 밴드로 표현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: ssODN 통합 효율성 및 결과. 2개의 ssODN 접근법의 통합 효율 및 결과는 6개의 상이한 유전자를 분석하여 결정되었다. 단 하나의 ssODN만 이통합된 경우, 인델 형성은 일반적으로 다른 대일에서 검출되었다. 두 개의 ssODN이 통합된 경우 그림과 같이 세 가지 가능한 결과가 검색되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 시약 | 볼륨(μl) |
| DNTP (10 mM) | 0.4 |
| 타크 폴리머라제 | 0.2 |
| PCR 버퍼 | 4.0 |
| 어닐드 올리고스 (10 μM) | 10.0 |
| ddH2O | 5.4 |
표 1: gRNA 복제 PCR 조건.
| PCR 프로그램 | |
| 1단계 | 30s에 대한 98 °C |
| 2단계 | 10s에 대한 98 °C |
| 3단계 | 20s에 대한 55 °C |
| 4단계 | 30s에 대한 72 °C |
| 5단계 | 30사이클동안 2-4단계를 반복 |
| 6단계 | 72 °C ( 5 분) |
| 7단계 | 4 °C에서 유지 |
표 2: PCR 사이클링 매개 변수.
| 시약 | 볼륨(μl) |
| AflII를 사용하는 선형화된 gRNA 벡터(즉, 50 ng/μL) | 1.0 |
| 100 bp DNA (즉, 250 ng/μL) | 1.0 |
| 마스터 믹스 2x | 10.0 |
| ddH2O | q.s. ~ 20 |
표 3: gRNA 어셈블리 반응 조건.
| 시약 | 금액 |
| DMEM/F12 | 50.0 μL |
| pCas9_GFP 벡터(애드진 플라스미드 44719) | 0.5 μg |
| gRNA 플라스미드 | 0.5 μg |
| 지질 형질 감염 시약 | 3.0 μL |
표 4: 세포 형질감염 마스터 혼합물.
| hESC 매체 | |
| 시약 | 최종 농도 |
| DMEM/F12 | |
| 녹아웃 혈청 교체 (KDR) | 15% (v/v) |
| 불필요한 아미노산 | 100 μM |
| 피루베이트 나트륨 | 1 mM |
| 글루타민 | 2 mM |
| β-메르카포에탄올 | 0.1 mM |
| bFGF 인간 (기본 섬유 아세포 성장 인자) | 10 ng/mL |
| 10x 프로테이나제 K 버퍼 | |
| 트리스.HCl pH:7.4 | 50 mM |
| 황산 암모늄 pH: 9.3 | 15 mM |
| MgCl2 | 2.5 mM |
| 트웬 20 | 0.1% (v/v) |
| 프로테이나제 K | 100 μg/mL |
표 5: 세포 배양 배지 및 단백질분해제 K 소화 완충제.
| 시약 | 금액 |
| DMEM/F12 | 50.0 μL |
| pCas9_GFP 벡터(애드진 플라스미드 44719) | 0.5 μg |
| gRNA 플라스미드 | 0.5 μg |
| ssODN (각 ssODN의 0.5 μg) | 1.0 μg |
| 지질 형질 감염 시약 | 3.0 μL |
표 6: ssODN 세포 형질감염 마스터 혼합물.
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Discussion
이 프로토콜에서, CRISPR-CAS9를 2개의 ssODN 수리 템플릿과 함께 사용하여 특정 이형이능 또는 동형접합체 게놈 변화를 생성하는 것은 인간 다능성 줄기 세포에서 입증된다. 이 방법은 10%에 가까운 효율로 이형게놈 변화를 발현하는 이소제세포주를 성공적으로 생성시켰다. 이 프로토콜은 세포 선별 후 저밀도에서 세포를 배양한 후 세포 성장과 생존을 지원하는 조사된 MEF에서 성장한 인간 ESCs 및 iPSCs 모두에 최적화되었습니다. 세포 사멸은 10 ng/mL bFGF 및 Y-27632 디하이드로클로라이드로 세포를 유지함으로써 최소화될 수 있다. 이 프로토콜은 피더 프리 컬쳐 시스템에 적용될 수 있지만 추가 최적화가 필요할 수 있습니다.
형질감염 효율은 세포주에서 세포주까지 가변적일 수 있지만, 지질 형질전환 시약의 DNA 3 μg 및 3 μL의 사용은 일반적으로 0.5-2% 사이의 형질감염 효율의 최상의 결과를 주었다. 그러나, 형질감염 효율이 낮으면, DNA 및 지질 시약의 양을 최적화할 수 있다. 다른 형질감염 시약은 또한 조사자에 의해 시험될 수 있다.
인델 생성의 효율은 다른 gRNA에 따라 달라질 수 있으며 게놈 위치에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 대부분의 경우 4개의 gRNA가 설계되면 적어도 한 번, 두 번에서 3번까지 효율적으로 작동합니다. 또한 gRNA를 테스트하기 전에 깨끗한 단일 밴드 DNA 제품으로 인델을 시각화하는 PCR 전략의 최적화가 중요합니다. ssODN 기반 게놈 편집스크리닝의 경우, 침묵하는 돌연변이를 도입할 때 제한 효소 부위를 추가하는 것이 가장 좋지만, 가능하지 않은 경우, 제한 효소 부위의 삭제도 사용할 수 있다. 또한, 상동성 지시 수리는 적극적으로 순환 세포를 필요로하므로 형질 감염 전에 배양의 세포 밀도는 도입 된 ssODN 템플릿을 사용하여 수리 클론의 주파수를 향상시키는 것이 중요하다.
이 프로토콜의 한계 중 일부는 편집될 게놈의 위치와 관련이 있습니다. 코딩 영역이 수정되면, ssODN은 자동 돌연변이를 운반하는 Cas9가 편집된 부위를 다시 절단하는 것을 방지하고 침묵하는 돌연변이는 단백질 생성물들을 변경하지 않습니다. 그러나 이 방법론을 사용하여 규제 또는 비코딩 영역에서 편집하는 것은 자동 돌연변이가 불가능하기 때문에 더욱 어려워집니다. 편집할 기준이 PAM 시퀀스의 일부인 경우 이 작업을 성공적으로 수행할 수 있지만 동종 변경사항만 효율적으로 생성할 수 있습니다.
여기서 설명된 프로토콜은 제2 대회문에서 의도하지 않은 인델을 첨가하지 않고 이형코딩 돌연변이를 생성하거나 수정하는 데 유용하다. 이 프로토콜은 발달 생물학에서 유전 질환의 모델링에 이르기까지 광범위한 주제를 연구하기 위해 인간 PSCs의 사용을 용이하게합니다. 등소원 라인의 사용은 다른 유전 적 배경으로 인해 혼란스러운 효과없이 주어진 코딩 돌연변이의 기능을 정의하는 데 중요합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 연구는 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소 (NHLBI), 보조금 U01HL099656 (P.G. 및 D.L.F.) 및 U01HL134696 (P.G. 및 D.L.F.)를 통해 건강의 국립 연구소에서 자금지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
| 6-well polystyrene tissue culture dishes | Corning | 353046 | |
| AflII restriction endonuclease | New England Biolabs | R0520 | |
| Agarose | VWR | N605 | |
| DMEM/F12 medium | ThermoFisher | 11320033 | |
| dNTPs | Roche | 11969064001 | |
| Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus | |||
| Gel extraction kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Gibson Assembly Kit | New England Biolabs | E2611 | |
| gRNA_Cloning Vector | Addgene | 41824 | |
| LB agar plates containing 50 μg/ml kanamycin | |||
| Lipofectamine Stem Reagent | ThermoFisher | (STEM00001) | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 354230 | |
| Murine embryonic fibroblasts (MEFs) | |||
| Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Orbital shaking incubator | |||
| pCas9_GFP vector | Addgene | 44719 | |
| PCR strip tubes | USA Scientific | 1402-2900 | |
| Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5× Phusion buffer | New England Biolabs | M0530 | |
| PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | K210011 | |
| Proteinase K | Qiagen | Qiagen 19133 | |
| StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells | Takara | 636763 | |
| SOC medium | New England Biolabs | B9020S | |
| TrypLE Express Enzyme | ThermoFisher | 12605036 | |
| Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi) | Tocris | 1254 |
References
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