Summary
Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Erleichterung der Erzeugung definierter heterozygoter oder homozygoter Nukleotid-Änderungen mit CRISPR-CAS9 in menschlichen pluripotenten Stammzellen.
Abstract
Menschliche pluripotente Stammzellen bieten ein leistungsfähiges System, um die Genfunktion zu untersuchen und modellspezifische Mutationen zu modellieren, die für Krankheiten relevant sind. Die Erzeugung präziser heterozygoter genetischer Modifikationen ist aufgrund der CRISPR-CAS9-vermittelten Indelbildung im zweiten Allel eine Herausforderung. Hier zeigen wir ein Protokoll, um diese Schwierigkeit zu überwinden, indem wir zwei Reparaturvorlagen verwenden, in denen nur eine die gewünschte Sequenzänderung ausdrückt, während beide Vorlagen stille Mutationen enthalten, um Nachschneiden und Indelbildung zu verhindern. Diese Methode ist am vorteilhaftesten für Gen-Editing-Codierungsregionen der DNA, um isogene Kontrolle und mutierte menschliche Stammzelllinien für die Untersuchung menschlicher Krankheiten und Biologie zu generieren. Darüber hinaus wurden Optimierungen von Transfektions- und Screening-Methoden durchgeführt, um Arbeit und Kosten eines Gen-Editing-Experiments zu reduzieren. Insgesamt ist dieses Protokoll weithin auf viele Genom-Editing-Projekte anwendbar, die das menschliche pluripotente Stammzellmodell verwenden.
Introduction
Menschliche embryonale Stammzellen (hESCs) und induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) sind wertvolle Werkzeuge zur Modellierung menschlicher Krankheiten aufgrund ihrer Fähigkeit zur Erneuerung, wobei die Fähigkeit zur Erzeugung von Zelltypen verschiedener Abstammungen beibehalten wird1,2 ,3,4. Diese Modelle eröffnen die Möglichkeit, die Genfunktion zu befragen und zu verstehen, wie spezifische Mutationen und Phänotypen mit verschiedenen Krankheiten zusammenhängen5,6. Um jedoch zu verstehen, wie eine bestimmte Veränderung mit einem bestimmten Phänotyp verbunden ist, ist die Verwendung einer gepaarten isogenen Kontrolle und mutierter Zelllinien wichtig, um die Linien-zu-Linienvariabilität7,8zu steuern. Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektornukleasen (TALENs) und Zinkfingernukleasen wurden verwendet, um Insertions- oder Deletionsmutationen (Indels) in verschiedenen genetischen Modellen, einschließlich Primärzellen, zu erzeugen; aber diese Nukleasen können umständlich zu bedienen und teuersein 9,10,11,12,13,14. Die Entdeckung der gruppierten regelmäßig interspaced short palindromic repeat (CRISPR)-CAS9 Nuklease hat das Feld aufgrund der Effizienz in der Indelbildung in praktisch jeder Region des Genoms, der Einfachheit der Anwendung und der Senkung der Kosten revolutioniert15 , 16 , 17 , 18 , 19.
Eine Herausforderung bei der Verwendung der CRISPR-CAS9-basierten Genom-Editing-Technologie war die Erzeugung oder Korrektur spezifischer Mutationen in einem Allel, ohne eine Indelmutation im zweiten Allel20zu erzeugen. Das Hauptziel dieses Protokolls ist es, diese Herausforderung zu überwinden, indem zwei einsträngige Oligonukleotid (ssODN) Reparaturvorlagen verwendet werden, um die Indelbildung im zweiten Allel zu reduzieren. Beide ssODNs sind so konzipiert, dass sie stille Mutationen enthalten, um ein erneutes Schneiden durch die CAS9-Nuklease zu verhindern, aber nur eine enthält die Veränderung des Interesses. Diese Methode erhöht die Effizienz der Erzeugung einer spezifischen heterozygoten genetischen Veränderung, ohne induzieren Indelbildung im zweiten Allel. Anhand dieses Protokolls zeigen Gen-Editing-Experimente an sechs unabhängigen genomischen Standorten die genaue Einführung der gewünschten genomischen Veränderung in einem Allel ohne Indelbildung im zweiten Allel und treten mit einer Gesamteffizienz von 10 % auf. Das beschriebene Protokoll wurde von Maguire et al.21angepasst.
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Protocol
1. Entwurf und Konstruktion von Guide RNA (gRNA)
HINWEIS: Jede gRNA besteht aus zwei 60 Basenpaar (bp) Oligonukleotiden, die geglüht werden, um ein 100 bp Doppelsträngiges (ds) Oligonukleotid zu erzeugen (Abbildung 1A-C). Der Zeitplan für die Effizienz des gRNA-Designs, der Erzeugung und des Testens beträgt ca. 2 Wochen (Abbildung 2).
- Wählen Sie den DNA-Bereich aus, der für das Genom von Interesse ist, und identifizieren Sie 3-4 23 bp Sequenzen, die in das Format 5'-G(N19)NGG-3' passen. Diese Sequenzen sollten sich innerhalb von 20 bp der Interessenregion befinden.
HINWEIS: Targeting kann auf den Sinnes- oder Anti-Sinn-Strang durchgeführt werden. - Bewerten Sie die gRNA-Sequenzen auf genomische Redundanz und Off-Target-Wahrscheinlichkeit mit einer Ressource wie CRISPOR (http://crispor.tefor.net).
- Integrieren Sie die 20 bp Zielsequenz (mit Ausnahme des protospaceer angrenzenden Motivs oder PAM) in zwei 60-Mer-Oligonukleotide wie gezeigt (Sequenzen sind 5' bis 3' und Rot und Grün sind umgekehrte Ergänzungen, wie in Abbildung 1Cdargestellt).
- Bestellen Sie die beiden 60 bp Oligonukleotide beim Lieferanten der Wahl. Sobald die Oligonukleotide empfangen sind, setzen Sie jeweils eine Endkonzentration von 100 M in ddH2O aus. Machen Sie einen Arbeitsbestand von 10 M.
- Anneal die beiden Oligonukleotide und erzeugen Sie ein 100 bp dsDNA Fragment mit DNA-Polymerase (Tabelle der Materialien). Kombinieren Sie 5 l von 10 'M vorwärts Oligonukleotid und 5 'L von 10 'M Reverse Oligonukleotid in einem Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Streifenrohr und inkubieren bei 95 °C für 5 min. Kühlen Sie die Reaktion für 10 min bei Raumtemperatur (RT).
- Richten Sie die PCR wie in Tabelle 1beschrieben ein. PcR-Verstärkung in einem thermischen Cycler unter Verwendung der in Tabelle 2beschriebenen Parameter durchführen.
- Visualisieren Sie die PCR-Produkte auf einem 1,5% (w/v) Ethidiumbromid (EtBr) Agarose-Gel elektrophoresed bei 80-100 V für 40 min. Verbrauchen Sie das 100 bp Band (Abbildung 3A), visualisiert auf einem LED-Leuchtkasten, aus dem Gel mit einer Rasierklinge und reinigen Sie mit einem Gel Extraktionskit (Materialtabelle).
2. Design von PCR-Primern zum Screening
- Führen Sie das Screening der bearbeiteten DNA mit Vorwärts- und Reverse-PCR-Primern durch, die speziell entwickelt wurden, um eine 400-500 bp-Region des Gens von Interesse zu verstärken (Tabelle 2). Verwenden Sie DNA isoliert aus jeder Kontroll-iPSC-Leitung, um ein sauberes Amplikon zu bestätigen, wenn Sie die Screening-PCR durchführen.
- Visualisieren Sie PCR-Produkte auf einem 1,5% (w/v) Gel nach Elektrophorese bei 80-100 V für 1 h.
HINWEIS: Die Sequenzierung der bearbeiteten Klone erfolgt mit einem verschachtelten Primer, der nach Bestätigung des Screening-Primers-Sets entworfen wurde. Beispiele werden zur Sequenzierung an eine kommerzielle Quelle gesendet.
3. Vorbereitung des gRNA_cloning Vektorplasmids
- Um den Klonvektor linearisieren zu können, nehmen Sie ein 1,5 ml Zentrifugenrohr und fügen Sie 1-5 g DNA des gRNA_cloning-Vektors zusammen mit 4 l des Afl II-Restriktionsenzympuffers und 1,5 l des Afl-II-Restriktionsenzymshinzu. Bringen Sie die Reaktion auf 24 l ddH2O. Mischen Sie die Reaktion durch Pipettieren nach oben und unten. Bei 37 °C über Nacht (O/N) inkubieren.
- Elektrophorese auf einem 1% Agarose-Gel bei 80-100 V für 1 h und Verbrauchbandbreiten (erwartete Bandgröße beträgt 3519 bp).
- Extrahieren und reinigen sie wie in Schritt 1.6.
4. Montage des gRNA-Vektors
- Richten Sie Reaktionen ein und montieren Sie DNA-Fragmente mit dem Montagesatz (Materialtabelle) bei 1:5 Verhältnissen von AflII verdaut gRNA Klonvektor zu 100 bp gel gereinigten Einsatz, wie in Tabelle 3beschrieben.
- Inkubieren Sie die Reaktion bei 50 °C für 15 min. Verdünnen Sie die Reaktion 1:3 in ddH2O und verwenden Sie 3 l für die bakterielle Transformation, wie vom Hersteller vorgeschrieben (Materialtabelle). Plattenzellen auf Kanamycin LB/Agar-Platten.
- Wählen Sie 3-5 Kolonien pro gRNA. Impfen Sie jede Kolonie in 4 ml LB und wachsen Sie O/N bei 37 °C in einem orbitalen Schüttelinkubator.
- Reinigen Sie Plasmid-DNA mit einem Miniprep-Plasmid-Isolationskit und sequenzieren Sie jede gRNA mit den folgenden Primern, um ein erfolgreiches Klonen zu gewährleisten: Weiter: GTACAAAAAAAGCAGGTTAAAGG; Umgekehrt: TGCCAACTTTGTACAAGAAAAGCT.
5. Test gRNA Schneideffizienz
- Platten-HESCs auf bestrahlten murinen embryonalen Fibroblasten (MEFs) in einer 6-Well-Platte, wie zuvor beschrieben21. Wenn die Zellen 70-80% Konfluenz erreichen, bereiten Sie den in Tabelle 4beschriebenen Transfektionsmaster-Mix vor.
- Durch Pipettieren mischen und bei RT 15 min inkubieren. Tropfenweise zu den Zellen hinzufügen und bei 37 °C für 48 h brüten (mit einem Medienwechsel nach 24 h).
- Erntezellen zum Sortieren nach 48 h.
- Entfernen Sie MEFs enzymatisch (Tabelle der Materialien) mit einer 3 min RT Inkubation.
- Spülzellen 1x mit hESC-Medium (Tabelle 5) und in hESC-Medium + 10 M Y-27632 Dihydrochlorid (Materialtabelle )kratzen.
- Pelletzellen bei 300 x g für 3 min und resuspendieren in 0,5 ml hESC-Medium + 10 M Y-27632 Dihydrochlorid.
- Filtern Sie in ein 5 ml-Rohr durch eine 35 m Zell-Siebkappe.
- Mit Fluoreszenz aktivierte Zellsortierung (FACS), Gate auf lebenden Zellen und sortieren die grünen fluoreszierenden Protein (GFP) positive Zellen.
- Übertragen Sie maximal 1,5 x 104 sortierte Zellen direkt in eine 10 cm2 Schale, die mit 1:3 Kellermembranmatrix (Materialtabelle) und bestrahlten MEFs in hESC-Medium (Tabelle 5) mit Y-27632-Dihydrochlorid beschichtet ist.
- Täglich mit dem hESC-Medium (Tabelle 5) ohne Y-27632-Dihydrochlorid wechseln und Klone nach 10-15 Tagen manuell pflücken, wenn die Kolonien einen Durchmesser von 1 mm haben.
- Mit einer P200 Pipette und einem Mikroskop einen einzelnen Klon sorgfältig kratzen und Zellen in die Pipette ziehen.
- Dispergieren Sie die Zellen durch sanfte Pipettierung 3-4x in einer 96-Well-Platte im Medium mit der Kolonie erstellt.
- In PCR-Streifenröhren zum Sieben und Pellet der Zellen durch Zentrifugation bei 10.000 x g für 5 min. Wählen Sie 20 Kolonien pro gRNA.
6. Klon-Screening
- Isolieren Sie die DNA, indem Sie Zellpellets in 20 L Proteinase-K-Puffer(Tabelle 5) (1 h bei 55 °C und 10 min bei 95 °C) und kräftig wirbeln. Zentrifuge bei 10.000 x g für 5 min und den Überstand sammeln.
- Führen Sie die Screening-PCR (Abschnitt 2) in einem Gesamtvolumen von 20 l mit einem Master-Mix aus Primern durch, die den Interessenbereich verstärken sollen, und 5 l der Proteinase K-Digest. Verwenden Sie genomische DNA, die aus der Zelllinie isoliert wurde, die als Kontrolle bearbeitet wurde.
- Bewerten Sie Größenänderungen von PCR-Produkten nach 1 h Elektrophorese bei 70-90 V auf einem 2,5% (w/v) Agaro-Gel (Abbildung 3B,C). Jeder Größenunterschied deutet auf Spaltung hin.
7. Präzise Genombearbeitung in pluripotenten Stammzellen mit einsträngiger Oligo-DNA (ssODNs)
- Design 100 bp ssODNs zentriert um die effizienteste gRNA-Sequenz bestimmt, um die beste Schneideffizienz zu haben.
- Verhindern Sie eine erneute Spaltung des rekombinierten ODN durch die Einführung von stillen Mutationen in der gRNA-Sequenz. Eine einzelne stille Mutation in der PAM-Sequenz ist ausreichend, aber wenn nicht möglich, funktionieren 3-4 stille Mutationen.
ANMERKUNG: Um das Screening von gezielten Klonen zu erleichtern, ist die Einführung einer Restriktionsstelle innerhalb von 20 bp der gRNA-Sequenz ideal. - Entwerfen Sie ein ODN mit den gewünschten Basisänderungen, um die Mutation des Interesses zu erzeugen, und einen ODN ohne die Basisänderung(n).
ANMERKUNG: Diese Änderungen sollten nicht mehr als 20 bp von der vorhergesagten CRISPR/CAS9-Schnittstelle sein, da die Rekombination in größeren Entfernungen erheblich abfällt. - Bestellen Sie die beiden ssODNs vom Anbieter der Wahl und suspendieren Sie in Wasser, um 1 g/ l Lagerzujer zu machen. Lagerbestände bei -20 °C.
8. Transfektions-Setup
- Um die ssODN und die CRISPR-CAS9-Plasmide zu transfekten, verfestigen Sie die Zielzelllinie in einer 6-Well-Schale auf bestrahlten MEFs, um nach einer O/N-Inkubation eine Konfluenz von 70-80% zu erreichen.
- Richten Sie die Transfektionsreaktion wie in Tabelle 6beschrieben ein. Mischen Sie die Reaktion durch Pipettieren und inkubieren Sie für 15 min bei RT. Fügen Sie das Transfektionsreaktionsgemisch tropfenweise zu den Zellen hinzu.
- Bereiten Sie die Zellen nach 48 h auf die Zellensortierung vor, wie in Abschnitt 5.3 beschrieben.
- Wählen Sie Kolonien 10 Tage nach der Beschichtung einzelner Zellen mit einer 200-L-Pipette. Übertragen Sie 100 l Zellen in einen Brunnen einer 24 oder 48 Wellplatte, die zuvor mit Gelatine und bestrahlten MEFs in hESC-Medium mit Y-27632-Dihydrochlorid beschichtet war. Verwenden Sie die verbleibenden 100 l für die DNA-Isolierung, wie in Abschnitt 6 beschrieben.
9. Überprüfung auf Mutationen in einzelnen Kolonien
- Um die erfolgreiche Integration des ssODN zu überprüfen, nehmen Sie 5 l DNA, die aus jeder Kolonie isoliert ist, um PCR mit den in Abschnitt 2 entworfenen Screening-Primern durchzuführen. Reinigen Sie die PCR-Produkte (Materialtabelle) und bereiten Sie die Restriktionsenzymverdauung mit der einzigartigen Enzym-Site vor, die in der ssODN erstellt wurde.
HINWEIS: Diese Verdauung umfasst auch den Restriktionsenzympuffer und die vom Hersteller empfohlene Konzentration des Restriktionsenzyms in einem Volumen von 40 l. - Mischen Sie die Reaktion durch Pipettieren und inkubieren Sie bei der vom Hersteller empfohlenen Temperatur für 1-3 h.
- Visualisieren Sie die verdauten PCR-Produkte auf einem 1,5% (w/v) EtBr Agarose Gel elektrophoresed bei 80-100 V für 40 min. Wenn eine erfolgreiche Integration der ssODN stattgefunden hat, sequenziumen spezifische Mutationen mit einem verschachtelten Primer.
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Representative Results
Generierung von gRNAs und Screening für Indels
Jede gRNA wird in einen Plasmidvektor geklont und mit dem U6-Promotor exprimiert. Das AflII Restriktionsenzym wird zur Linearisierung des Plasmids (Addgen #41824) verwendet und befindet sich nach dem U6-Promotor. Das nach dem Glühen der beiden 60 bp Oligos erzeugte 100 bp-Band wird mit Hilfe der DNA-Assembly in den gRNA-Expressionsvektor geklont. Sobald die gRNA-Plasmide erzeugt sind, werden sie zusammen mit einem CRISPS-CAS9 GFP-Plasmid (Addgen-#44719) in hESCs oder iPSCs transfiziert. Die GFP+-Zellen werden nach 2 Tagen sortiert, um sich für transfizierte Zellen anzureichern und plattiert (siehe Abschnitt 5). Nach 10-14 Tagen werden einzelligabgeleitete Kolonien gepflückt und verwendet, um DNA zu isolieren, um die für jede gRNA erzeugte Indelbildung zu untersuchen. Eine PCR-Verstärkung mit Primern, die die gRNA-Stelle überspannen, wird verwendet, um die Indelbildung mit einem 2,5% (w/v) Agarose-Gel mit EtBr zu visualisieren, elektrophorisiert bei 70-90 V für 1 h.
Erzeugung von 100 bp ssODN zur Einführung spezifischer Mutationen
Zwei ssODN Oligos sind um die gRNA mit dem effizientesten Schneiden ausgelegt. Jede gRNA ist 100 bp und enthält stille Mutationen, vorzugsweise in der PAM-Sequenz, um ein erneutes Schneiden zu vermeiden (Abbildung 4A). Eine stille Mutation in der PAM-Sequenz kann eine eindeutige Einschränkungssite generieren, die bei der erfolgreichen Integration in ein oder zwei Allele hilft (Abbildung 4B).
ssODN-Rekombinationsergebnisse
Mit diesem Protokoll wird die Häufigkeit von Targeting-Ereignissen für sechs verschiedene Gene mit dem beiden ssODN-Ansatz in Abbildung 5dargestellt. Durch die Untersuchung der genomischen Veränderung an der gRNA-Stelle in beiden Allelen wurden unterschiedliche Ergebnisse erwartet, einschließlich der Rekombination des Wildtyps (WT) ssODN, der mutierten ssODN und der Indelbildung. Die Klone, bei denen nur ein Allel eine Rekombination durchlaufen hatte, war die am häufigsten auftretende Bildung im zweiten Allel (10-42%). Die Klone, die die ssODNs in beide Allele eingebunden hatten, führten zu drei unterschiedlichen Ergebnissen: 1) Integration der WT ssODN in beide Allele (0-8%), 2) Integration der mutierten ssODN in beide Allele (0-25%), und 3) Integration sowohl der WT- als auch der Mutant-SsODN WT (8-21%).
Abbildung 1: Übersicht über die gRNA-Generierung. (A) Entwerfen Sie im Interessengebiet vier gRNAs, die in GG enden und nicht mehr als 20 bp voneinander entfernt sind. (B) Jede gRNA von 23 bp hat eine PAM-Sequenz von NGG am 3'-Ende. (C) Die 60 bp Primer bestehen aus einer 40 bp Sequenz, die das gRNA-Backbone-Plasmid und die 20 bp gRNA-Sequenz ohne die PAM-Sequenz ergänzt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Protokoll-Zeitleiste für gRNA-Generierung und Klon-Screening. Die Zeitleiste für gRNA-Generierungs- und Screening-Klone wird angezeigt. Das Entwerfen und Klonen von gRNA-Expressionsplasmiden dauert etwa eine Woche. Etwa 48 Stunden nach der Transfektion in menschliche PSCs werden GFP+-Zellen sortiert und bei begrenzungder Verdünnung plattiert. Kolonien sollten zwischen 7-10 Tagen und an etwa Tag 20 sichtbar sein, Klone können für Screening, Erweiterung und Sequenzbestätigung ausgewählt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: gRNA-Test zur Schneideffizienz. (A) Bei der gRNA-Konstruktion wird ein 100 bp-Band aus einem 1,5% Agarose-Gel entfernt. (B) Nach der Zelltransfektion wird die Validierung des gRNA-Schneidens mit einem 2,5%-Agarose-Gel visualisiert. Ein 180 bp PCR-Produkt wird verwendet, um die Indelbildung zu überprüfen, bei der eine ungeschnittene Steuerung und verschiedene Klone auf Bandverschiebungen analysiert werden, die auf eine Indelbildung hinweisen. (C) Verschiedene gRNAs können unterschiedliche Schnitteffizienzen aufweisen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Erzeugung und Screening von Mutationen mit zwei ssODNs. (A) Um ein erneutes Schneiden der bearbeiteten Allele durch CRISPR-CAS9 zu vermeiden, kann die PAM-Sequenz mit einer G-zu-A-Stummmutation geändert werden. Diese Änderung fügt eine einzigartige EcoRI-Einschränkungswebsite hinzu, die zum Screening verwendet werden kann. Zusätzlich zu dieser stillen Mutation enthält die mutierte ssODN die gewünschte Grundänderung. (B) Das Screening auf Oligonukleotid-Rekombination mit EcoRI-Restriktionsenzymverdauung kann zu drei möglichen Ergebnissen führen: kein Schneiden, das durch ein WT-Band bei 650 bp dargestellt wird, eine Rekombination in einem Allel, das durch ein ungeschnittenes Band von 650 bp und zwei kleinere Bänder oder Einfügung in beide Allele, die nur durch kleinere Bänder dargestellt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Effizienz und Ergebnisse der ssODN-Integration. Die Integrationseffizienz und die Ergebnisse der beiden ssODN-Ansätze wurden durch die Analyse von sechs verschiedenen Genen bestimmt. Wenn nur eine ssODN integriert ist, wurde in der Regel in der anderen Allele die Indelbildung erkannt. Wenn zwei ssODNs integriert sind, wurden drei mögliche Ergebnisse erkannt, wie gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Reagenz | Volumen (L) |
| dNTPs (10 mM) | 0.4 |
| Taq-Polymerase | 0.2 |
| PCR-Puffer | 4.0 |
| Glüh-Oligos (10 m) | 10.0 |
| ddH2O | 5.4 |
Tabelle 1: gRNA-Klon-PCR-Bedingungen.
| PCR-Programm | |
| Schritt 1 | 98 °C für 30 s |
| Schritt 2 | 98 °C für 10 s |
| Schritt 3 | 55 °C für 20 s |
| Schritt 4 | 72 °C für 30 s |
| Schritt 5 | Wiederholen Sie die Schritte 2 x 4 für 30 Zyklen |
| Schritt 6 | 72 °C für 5 min |
| Schritt 7 | Halten bei 4 °C |
Tabelle 2: PCR-Zyklusparameter.
| Reagenz | Volumen (L) |
| linearisierter gRNA-Vektor mit AflII (d.h. 50 ng/L) | 1.0 |
| 100 bp DNA (d. h. 250 ng/l) | 1.0 |
| Master-Mix 2x | 10.0 |
| ddH2O | q.s. bis 20 |
Tabelle 3: gRNA-Montagereaktionsbedingungen.
| Reagenz | betrag |
| DMEM/F12 | 50,0 l |
| pCas9_GFP-Vektor (Addgenplasmid 44719) | 0,5 g |
| gRNA-Plasmid | 0,5 g |
| Lipidtransfektionsreagenz | 3,0 l |
Tabelle 4: Zelltransfektionsmaster-Mischung.
| hESC Mittel | |
| Reagenz | Endgültige Konzentration |
| DMEM/F12 | |
| Knockout-Serumersatz (KDR) | 15% (v/v) |
| Nicht essentielle Aminosäuren | 100 m |
| Natriumpyruvat | 1 mM |
| Glutamin | 2 mM |
| Mercaptoethanol | 0,1 mM |
| bFGF human (grundlegender Fibroblasten-Wachstumsfaktor) | 10 ng/mL |
| 10x Proteinase K Puffer | |
| Tris.HCl pH:7.4 | 50 mM |
| Ammoniumsulfat pH:: 9,3 | 15 mM |
| MgCl2 | 2,5 mM |
| Tween 20 | 0,1% (v/v) |
| Proteinase K | 100 g/ml |
Tabelle 5: Zellkulturmedium und Proteinase K Verdauungspuffer.
| Reagenz | betrag |
| DMEM/F12 | 50,0 l |
| pCas9_GFP-Vektor (Addgenplasmid 44719) | 0,5 g |
| gRNA-Plasmid | 0,5 g |
| ssODN (0,5 g jedes ssODN) | 1,0 g |
| Lipidtransfektionsreagenz | 3,0 l |
Tabelle 6: ssODN Zelltransfektionsmastermischung.
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Discussion
In diesem Protokoll wird die Verwendung von CRISPR-CAS9 zusammen mit zwei ssODN-Reparaturvorlagen zur Erzeugung spezifischer heterozygoter oder homozygoter Genomveränderungen in menschlichen pluripotenten Stammzellen nachgewiesen. Diese Methode führte zur erfolgreichen Erzeugung isogener Zelllinien, die heterozygote genomische Veränderungen mit einer Effizienz von fast 10 % exdrücken. Dieses Protokoll wurde sowohl für menschliche ESCs als auch für iPSCs optimiert, die auf bestrahlten MEFs angebaut werden, die das Zellwachstum und das Überleben unterstützen, nachdem Zellen mit geringer Dichte nach der Zellsortierung gekultt wurden. Der Zelltod kann minimiert werden, indem Zellen mit 10 ng/mL bFGF und Y-27632 Dihydrochlorid erhalten werden. Es ist möglich, dass dieses Protokoll an Feeder-freie Kultursysteme angepasst wird, aber eine weitere Optimierung kann notwendig sein.
Die Transfektionseffizienz kann von Zelllinie zu Zelllinie variabel sein, aber die Verwendung von 3 g DNA und 3 l eines Lipidtransfektionsreagenzes lieferte in der Regel die besten Ergebnisse zwischen 0,5-2% Transfektionseffizienz. Wenn jedoch die Transfektionseffizienz geringer ist, kann eine Optimierung der Menge an DNA und Lipidreagenz durchgeführt werden. Andere Transfektionsreagenzien können ebenfalls vom Prüfer getestet werden.
Die Effizienz der Indel-Generierung variiert mit verschiedenen gRNAs und kann durch den genomischen Standort beeinflusst werden. In den allermeisten Fällen, wenn vier gRNAs entworfen werden, wird mindestens ein- und mehrmals 2 bis 3 effizient arbeiten. Darüber hinaus ist vor dem Testen von gRNAs die Optimierung der PCR-Strategie zur Visualisierung von Indels mit einem sauberen Einzelband-DNA-Produkt wichtig. Für das Screening ssODN-basierter Genombearbeitung ist es am besten, eine Restriktionsenzym-Site hinzuzufügen, wenn eine stille Mutation(n) eingeführt wird, aber wenn nicht möglich, kann auch das Löschen einer Restriktionsenzym-Site verwendet werden. Darüber hinaus erfordert die homologiegesteuerte Reparatur aktiv Zykluszellen, so dass die Zelldichte der Kulturen vor der Transfektion ist entscheidend, um die Häufigkeit der Klone mit der eingeführten ssODN-Vorlage repariert zu verbessern.
Einige der Einschränkungen dieses Protokolls beziehen sich auf die Position im Genom, die bearbeitet wird. Wenn die Kodierungsbereiche modifiziert werden, verhindert ssODN mit stillen Mutationen, dass der Cas9 die bearbeitete Stelle erneut schneidet, und die stillen Mutationen verändern das Proteinprodukt nicht. Die Bearbeitung in regulatorischen oder nicht-kodierenden Regionen mit dieser Methode wird jedoch schwieriger, da stille Mutationen nicht möglich sind. Wenn die zu bearbeitende Basis Teil einer PAM-Sequenz ist, kann dies erfolgreich durchgeführt werden, aber nur homozygote Änderungen können effizient generiert werden.
Das hier beschriebene Protokoll ist nützlich, um heterozygote Codierungsmutationen ohne Zugabe von unbeabsichtigten Indels im zweiten Allel zu erzeugen oder zu korrigieren. Dieses Protokoll wird die Verwendung menschlicher PSPs erleichtern, um eine breite Palette von Themen zu untersuchen, von der Entwicklungsbiologie bis zur Modellierung genetischer Krankheiten. Die Verwendung isogener Linien ist entscheidend, um Funktionen einer bestimmten Kodierungsmutation zu definieren, ohne dass effekte aufgrund unterschiedlicher genetischer Hintergründe verwirrend sind.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde durch Fördermittel des National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI), National Institutes of Health durch Die Stipendien U01HL099656 (P.G. und D.L.F.) und U01HL134696 (P.G. und D.L.F.) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
| 6-well polystyrene tissue culture dishes | Corning | 353046 | |
| AflII restriction endonuclease | New England Biolabs | R0520 | |
| Agarose | VWR | N605 | |
| DMEM/F12 medium | ThermoFisher | 11320033 | |
| dNTPs | Roche | 11969064001 | |
| Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus | |||
| Gel extraction kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Gibson Assembly Kit | New England Biolabs | E2611 | |
| gRNA_Cloning Vector | Addgene | 41824 | |
| LB agar plates containing 50 μg/ml kanamycin | |||
| Lipofectamine Stem Reagent | ThermoFisher | (STEM00001) | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 354230 | |
| Murine embryonic fibroblasts (MEFs) | |||
| Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Orbital shaking incubator | |||
| pCas9_GFP vector | Addgene | 44719 | |
| PCR strip tubes | USA Scientific | 1402-2900 | |
| Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5× Phusion buffer | New England Biolabs | M0530 | |
| PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | K210011 | |
| Proteinase K | Qiagen | Qiagen 19133 | |
| StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells | Takara | 636763 | |
| SOC medium | New England Biolabs | B9020S | |
| TrypLE Express Enzyme | ThermoFisher | 12605036 | |
| Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi) | Tocris | 1254 |
References
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