Micro-fragmentação do tecido adiposo humano para a caracterização do Phenotyping e do Secretome da pilha

Resumo

Aqui, nós apresentamos o tecido adiposo humano microfragmentação enzima-livre usando um dispositivo fechado do sistema. Este novo método permite a obtenção de aglomerados de submilímetro de tecido adiposo adequado para transplante in vivo, cultura in vitro e maior isolamento e caracterização celular.

Resumo

Na última década, os transplantes de tecido adiposo têm sido amplamente utilizados na cirurgia plástica e ortopedia para melhorar a reposição tecidual e/ou regeneração. Assim, as técnicas de colheita e processamento do tecido adiposo humano evoluíram de forma rápida e eficiente para obter grandes quantidades de tecido. Entre estes, a tecnologia de sistema fechado representa um sistema inovativo e easy-to-use para colher, processar, e re-injetar o tecido gordo refinado em um curto período de tempo e na mesma intervenção (intra-operatively). O tecido adiposo é coletado por lipoaspiração, lavado, emulsionado, lavado e picado mecanicamente em aglomerados de células de 0,3 a 0,8 mm. a transplantação autóloga do tecido adiposo mecanicamente fragmentou demonstrou a eficácia notável em diferentes terapêutica indicações como medicina estética e cirurgia, Ortopedia e cirurgia geral. A caracterização do tecido adiposo microfragmentado revelou a presença de pequenos vasos intactos dentro dos aglomerados de adipócitos; daqui, o Niche perivascular é deixado unperturbed. Estes aglomerados são enriquecidos em células perivasculares (i.e., ancestrais de células-tronco mesenquimais (MSC)) e a análise in vitro mostrou uma maior liberação de fatores de crescimento e citocinas envolvidas na reparação e regeneração tecidual, em comparação com os MSCs enzimaticamente derivados. Isto sugere que o potencial terapêutico superior do tecido adiposo microfragmentado seja explicado por uma freqüência mais elevada de MSCS presuntivos e de atividade secretora realçada. Se estes pericitos adicionados contribuem diretamente ao fator de crescimento mais elevado e à produção do citocinas não é sabido. Este procedimento clinicamente aprovado permite a transplantação de MSCs presuntivos sem a necessidade para a expansão e/ou o tratamento enzimático, assim ignorando as exigências de directrizes do PBF, e reduzindo os custos para terapias Cell-Based.

Introdução

O tecido adiposo, usado por muito tempo como um enchimento na cirurgia reconstrutiva e cosmética, tornou-se recentemente mais popular na medicina regenerativa reconhecida uma vez como uma fonte para pilhas de haste mesenquimais (MSCS)¹. Os lipoaspirates dissociados enzimaticamente em suspensões da único-pilha rendem uma fração vascular stromal adipocyte-livre (SVF) que seja usada inalterada no paciente ou, mais geralmente, é cultivada por diversas semanas em MSCs².

No entanto, a dissociação enzimática rompe os microsambientes teciduais, isolando células reguladoras vizinhas de células regenerativas presuntivas que se tornam consideravelmente modificadas pela cultura in vitro. Para evitar tais artefatos experimentais e conseqüentes alterações funcionais, foram feitas tentativas para processar o tecido adiposo para uso^{terapêutico, mantendo}sua configuração nativa tão intacta quanto possível^3,4. Notavelmente, a ruptura do tecido mecânico começou a substituir a dissociação enzimática. Para este fim, os microfragmentos fechados do sistema da imersão cheia lipoaspirates em aglomerados do tecido do secundário-milímetro, do sangue-e do óleo-livre (por exemplo, Lipogems) através de uma seqüência da filtração da peneira e do rompimento induzido mármore de aço³. A transplantação autóloga do tecido adiposo micro-fragmentado, usando esta tecnologia Closed do sistema, foi bem sucedida em indicações múltiplas, abrangendo cosméticos, orthopedics, Proctologia e Ginecologia^{4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13}.

A comparação entre o tecido adiposo microfragmentado humano (MAT) obtido com o dispositivo fechado do sistema e o SVF isogênicos revelou que com respeito à distribuição vascular/stromal da pilha e à atividade secretora na cultura, a esteira contem mais pericytes, que são presuntivos MSCS¹⁴, e secreta maiores quantidades de fatores de crescimento e citocinas¹⁵.

O artigo atual ilustra a microfragmentação enzima-livre do tecido adiposo subcutaneous humano usando um dispositivo fechado do sistema, e o processamento mais adicional de tal tecido adiposo micronizada para a cultura in vitro, immunohistochemistry e a análise de FACS, a fim de identificar os tipos de células presentes e os fatores solúveis secretados (Figura 1). O método descrito com segurança gera os organóides derivados do submilímetro do adiposo que contêm populações viáveis da pilha do tecido adiposo em um nicho intacto, apropriado para umas aplicações e uns estudos mais adicionais.

Protocolo

A aprovação ética para o uso de tecidos humanos nesta pesquisa foi obtida do Comitê de ética em pesquisa do sudeste da Escócia (referência: 16/SS/0103).

1. coleta de tecido adiposo abdominal subcutâneo

Nota: Todos os instrumentos utilizados no procedimento de lipo-aspiração manual são fornecidos pelo fabricante do dispositivo de microfragmentação.

1. Mantenha a esterilidade para todos os fluidos, recipientes, instrumentos e a área operacional durante todo o experimento.
2. Coloque a amostra de abdominoplastia (suprida pela equipe cirúrgica em um saco estéril sem qualquer solução) em cima de um pano cirúrgico com a pele voltada para cima. Nenhuma lavagem é exigida. Para uma utilização óptima, manter a amostra a 4 ° c e processar a amostra adiposa dentro de 16 h de colheita.
3. Injetar 50 a 100 mL de 37 ° c 0,9% solução de NaCl, dependendo do tamanho da amostra de tecido (use 50 mL para um máximo de 15 cm² superfície do tecido adiposo e aumentar o volume em conformidade), usando uma cânula de infiltração de tecido descartável, no subcutâneo tecido adiposo. Manuseie a amostra pela parte cutânea.
4. Ligue uma seringa de bloqueio luer de 10 mL a uma cânula de lipoaspiração descartável.
5. Introduza com cuidado a cânula dentro do tecido adiposo das bordas. Uma vez dentro, crie o vácuo dentro da seringa puxando o êmbolo. Mantenha o êmbolo em posição à mão para fixar a aspiração a vácuo.
6. Faça movimentos radiais dentro da amostra de tecido adiposo até que a seringa esteja cheia de lipoaspirado. Retire cuidadosamente a cânula do tecido e desconecte a seringa. Ligue uma nova seringa vazia.
7. Repita o procedimento até que 60 mL de lipoaspirado tenham sido recolhidos.
   Nota: A quantidade máxima de lipoaspirado que pode ser processado muda de acordo com o tipo de dispositivo usado. Por favor, consulte as instruções do fabricante (tabela de materiais).

2. microfragmentação do lipoaspirado

Nota: Este protocolo destina-se apenas ao uso da pesquisa. A microfragmentação é realizada com a ajuda de um dispositivo disponível comercialmente (tabela de materiais).

1. Retire o dispositivo da embalagem e verifique se a unidade principal está conectada ao saco de lixo. Coloque o saco de recolha de resíduos no chão e certifique-se de que as válvulas estão fixadas nas tampas da unidade de processo.
2. Conecte o ponto terminal da linha de entrada ao saco salino perfurando a porta de conexão do saco. Mantenha o saco salino mais alto do que a unidade de processamento.
   Nota: Para o tipo de dispositivo utilizado neste protocolo, recomenda-se um saco de 2.000 mL de soro fisiológico estéril.
3. Verifique se todas as 5 braçadeiras conectadas aos tubos dos circuitos estão abertas. Coloque a unidade de processamento em uma posição vertical com a tampa cinza para cima.
4. Permitir que a solução salina preencha a unidade de processamento. Verifique se o fluxo atinge o saco de lixo. Retire todas as bolhas de ar da unidade de processamento agitando-a.
   Nota: Todas as passagens a seguir devem ser realizadas na ausência de ar na unidade de processamento.
5. Coloque a unidade de processamento em uma posição vertical com a tampa azul para cima e feche a braçadeira ao lado da linha de entrada.
6. Comece injetando o lipoaspirado conectando a seringa à válvula Self-occluding da tampa azul da entrada. Mantenha a unidade de processamento vertical durante este procedimento e puxe lentamente o êmbolo da seringa até que todo o lipoaspirado tenha sido transferido para a unidade. Repita o processo até que todo o lipoaspirado esteja dentro da unidade de processamento.
   Nota: Para a unidade de processamento utilizada no vídeo, adicione o máximo de 30 mL de lipoaspirado no momento. O procedimento pode ser executado no máximo duas vezes, até 60 mL de lipoaspirado terem sido processados.
7. Abra o grampo de entrada para restaurar o fluxo fisiológico.
8. Agitar vigorosamente a unidade de processamento durante 2 min, pelo menos, verificando regularmente o fluxo da solução salina no saco de resíduos.
9. Quando a solução salina na unidade de processamento se torna transparente, depois de aproximativamente 2 min de agitação, coloque a unidade com a tampa cinza para cima, e feche a braçadeira localizada no dreno perto da tampa cinza. O tecido processado flutuará na parte superior.
10. Encha uma seringa de bloqueio luer de 10 mL com solução salina e ligue-a à válvula de carga da tampa azul. Feche a braçadeira localizada perto da tampa azul. Ligue uma seringa de bloqueio Luer vazia de 10 mL, com o êmbolo completamente inserido, na válvula da tampa cinzenta.
    Nota: Utilize apenas seringas de bloqueio Luer.
11. Injete firmemente o soro fisiológico na unidade de processamento a partir da tampa azul. Assegure-se de que a seringa conectada à válvula cinzenta esteja sendo enchida conseqüentemente com o tecido processado. Depois de ter injetado todas as salinas, Retire cuidadosamente ambas as seringas.
12. Repita as etapas 2,10 e 2,11 até que todo o tecido processado seja coletado.
    Nota: O rendimento médio da MAT é de 30 mL de 60 mL de lipoaspirado manual. Alguns tecidos permanecerão dentro da unidade de processamento e alguns grupos podem estar presentes anexados à borda azul dentro da unidade.
13. No final do processamento, remova todas as seringas, feche todas as braçadeiras, retire a bolsa salina e descarte o dispositivo de acordo com os protocolos locais.
    Nota: O dispositivo de processamento não pode ser reutilizado.

3. imunoistoquímica de fluorescência

1. Transfira 300-500 μL de MAT para um tubo de 1,5 mL. Adicione 1 mL de paraformaldeído tamponado a 4% (PFA), misture suavemente à mão (sem vortexing) e deixe a 4 ° c durante a noite (de 16 a 24 h).
2. Colete a amostra e transfira para um tubo limpo de 1,5 mL contendo 1 mL de PBS. Repita o passo duas vezes para remover o excesso de PFA.
3. Transferir a amostra em 15% (p/v) de sacarose em solução de PBS e incubar a 4 ° c durante a noite (de 16 a 24 h)
4. Transfira a amostra em um poço de uma placa de 24 poços e adicione uma solução de incorporação feita de 15% de sacarose e 7% de gelatina (w/v) em PBS. Encha a metade do poço. Incubar por 4 h a 37 ° c.
5. Transfira as amostras para 4 ° c. Após 2-4 h para a gelatina para solidificar, encher o poço com a solução de incorporação e deixar a 4 ° c durante a noite.
6. Retire as amostras dos poços. Remover o excesso de incorporação composto e congelar em gelo seco. Guarde as amostras a-80 ° c.
7. Corte 8-10 μm de seções grossas usando um criostat. Para o corte ideal, use o criostat a-30 ° c. Os slides podem ser armazenados em-80 ° c.
8. Antes de prosseguir com a imunofluorescência, fixar as secções em 4% PFA por 7 min. Retire o PFA e lave duas vezes com PBS morno (37 ° c), a fim de remover a gelatina das secções.
9. Bloqueie a ligação de anticorpos não específicos incubando as lâminas com 10% de soro de cabra em PBS (v/v) durante 1 h à temperatura ambiente.
10. Diluir os anticorpos primários no diluente de anticorpos ou 0,2% (p/v) de albumina sérica bovina (BSA) em PBS (p/v): rato anti-Human-NG2 (1:100, Stock 0,5 mg/mL), coelho anti-humano-PDGFRβ (1:100, Stock 0,15 mg/mL).
11. Retire a solução de bloqueio e adicione os anticorpos primários diluídos. Incubar a 4 ° c durante a noite.
    Nota: Realize todos os passos de incubação a partir de agora no escuro.
12. Retire os anticorpos primários e lave 3 vezes com PBS durante 10 min de cada vez.
13. Diluir os anticorpos secundários no diluente do anticorpo ou 0,2% (w/v) BSA em PBS: cabra anti-rato-555 (1:300), cabra anti-coelho-647 (1:300). Incubar 1 h à temperatura ambiente.
14. Retire os anticorpos secundários e lave três vezes com PBS durante 10 min de cada vez.
15. Se for utilizada uma lectina conjugada com biotina, utilize o kit de bloqueio avidina/biotina. Incubar por 10 min com cada reagente fornecido com duas lavas no meio com PBS.
16. Repita a etapa de bloqueio incubando os slides por 1 h à temperatura ambiente com 10% de soro de cabra em PBS.
17. Adicione a lectina biotinylated, Ulex europaeus lectina de biotinylated (1:200, estoque 2 mg/mL), diluído em 0,2% BSA (w/v) no PBS ou no diluente do anticorpo. Incubar 1 h e 30 min à temperatura ambiente.
18. Remova o excesso de lectina biotinilada e lave três vezes com PBS por 10 min de cada vez.
19. Adicione o anticorpo conjugado de estreptavidina secundário diluído em 0,2% (w/v) BSA no PBS ou no diluente do anticorpo. Incubar por 1 h.
20. Retire o anticorpo secundário e lave três vezes com PBS durante 10 min de cada vez.
21. Núcleos de contratura com 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1:500, estoque 5 mg/mL), diluído em 0,2% BSA (w/v) em PBS, por 10 min à temperatura ambiente.
22. Retire a solução DAPI e lave duas vezes com PBS, 10 min de cada vez.
23. Monte os slides com um agente de montagem aquoso. Deixe secar completamente, ou durante a noite no banco no escuro ou 1 h a 37 ° c.
24. Mantenha as lâminas a 4 ° c no escuro e adquira imagens em um microscópio de epifluorescência.

4. digestão do tecido adiposo microfragmentado e isolamento celular

1. Transfira o tecido adiposo microfragmentado para um recipiente estéril.
2. Recentemente compõem o meio de digestão dissolvendo a colagenase do tipo II em DMEM na concentração de 1 mg/mL.
3. Adicione o mesmo volume de meio de digestão ao tecido adiposo microfragmentado (ou seja, para 30 mL de amostra adicione 30 mL de meio de digestão).
4. Coloc o recipiente selado em um 37 ° c que agitam o banho de água ajustado a 120 rpm para 45 minutos. Por favor, note que o recipiente deve permitir uma agitação adequada da amostra. Se um recipiente grande não estiver disponível, use tubos de 2 50 mL (30 mL de mistura média de amostra/digestão em cada) colocados horizontalmente.
5. Após a incubação, bloqueie a digestão adicionando um volume igual de solução de bloqueio (2% (v/v) FCS/PBS) e filtre sequencialmente através de filtros de células de 100 μm e 70 μm.
6. Centrifugue a suspensão filtrada durante 5 min a 200 x g. Descarte o sobrenadante.
7. Ressuscitar o pellet em aproximadamente 5 mL de tampão de Lise eritrocitário (155 mM NH₄Cl, 170 mm Tris, pH 7,65). O volume do tampão pode variar de acordo com a contaminação do eritrócitos observada no pellet celular. Incubar à temperatura ambiente durante 15 min.
8. Adicione um volume igual de solução de bloqueio e filtre através de um filtro de célula de 40 μm.
9. Centrifugue a suspensão celular por 5 min a 200 x g e descarte o sobrenadante.
10. Resuspend o pellet em solução de bloqueio. Misture bem com pipetagem. Contagem de células viáveis com trypan exclusão azul em um Hemocytometer.
    1. Misture um volume igual da suspensão da célula com a mancha azul de trypan. Aspirar 10 μL da solução e colocá-lo num hemociômetro.
    2. Conte o número de células vivas (brilhantes e redondas) presentes em pelo menos 5 quadrados e obtenha o número médio de células. A fim incluir o fator da diluição da mancha, multiplique o número médio da pilha por 2. Para obter o número total de células ao vivo por 1 mL de amostra multiplicar o número obtido por 10⁴.
       Nota: a suspensão da célula única obtida, ou seja, a fração vascular estromal (SVF), pode ser semeada em 20.000 células/cm² em meio de crescimento celular perivascular (DMEM suplementado com 20% de FCS inativado por calor, 1% de penicilina/estreptomicina e 1% L-glutamina) ou utilizado para análise e classificação de citometria de fluxo. O rendimento médio das células nucleadas na SVF é de aproximadamente 3 x 10⁴ células por ml de Mat. A triagem de experimentos requer pelo menos 8 x 10⁵ células para obter células perivasculares suficientes para cultivo.

5. rotulagem e classificação das células

1. Centrifugue a suspensão da pilha na temperatura ambiente por 5 minutos em 200 x g, e Resuspenda a pelota no meio de obstrução em uma concentração de 1 x 10⁶ pilhas por 100 μl.
2. Alíquota pelo menos 50.000 pilhas para o controle não manchado e a fluorescência menos um (FMO) controla em tubos de citometria de fluxo de fundo redondo de poliestireno. Use o resto das células para coloração multicolor, colocando em outro tubo.
   Nota: uma vez que as configurações do experimento foram estabelecidas (ou seja, intensidade do laser, estratégia de gating), o número de células utilizadas para o controle não manchado e os FMOs podem ser reduzidos, se, os anticorpos utilizados são os mesmos.
3. Adicione anticorpos CD31-V450 (1:400), CD34-PE (1:100), CD45-V450 (1:400) e CD146-BV711 (1:100) à suspensão de uma única célula para coloração multicolorida. Para os controles de FMO, adicione: para os volumes equivalentes de V450 FMO de CD34-PE e de CD146-BV711 mais o controle do isotipo V450; para os volumes equivalentes de PE FMO de CD31-V450, CD45-V450 e CD146-BV711 mais o controle do isotipo do PE; para os volumes equivalentes de BV711 FMO de CD31-V450, CD45-V450 e CD34-PE mais o controle do isotipo BV711.
4. Gentilmente pipeta, ou Vortex lentamente a solução no tubo para misturar e incubar os tubos a 4 ° c por 20 min no escuro.
5. Prepare contas de controle de compensação. Adicione 15 μL de grânulos positivos e 15 μL de grânulos negativos a 70 μL de meio de bloqueio em 3 tubos de fluxo de fundo redondo de poliestireno-citometria. Adicionar CD34-PE, CD31-V450 ou CD45-V450, e CD146-BV711 anticorpos, um por tubo.
6. Gentilmente pipeta, ou Vortex lentamente, para misturar os anticorpos com os grânulos e incubar todos os tubos a 4 ° c por 20 min no escuro.
   Nota: o procedimento descrito pode ser usado tanto para análise de citometria de fluxo quanto para classificação celular.
7. Prepare os tubos de coleta pré-molhando a superfície interna dos tubos com meio de crescimento endotelial (EGM), deixando aproximadamente 50 μL de meio na parte inferior de cada tubo.
8. Após a incubação do anticorpo, remova o excesso do anticorpo lavando as pilhas e os grânulos com 2 mL do meio de obstrução.
9. Retire a solução centrifugação dos tubos a 200 x g durante 5 min e aspirando cuidadosamente o sobrenadante. Replicar a etapa de lavagem.
10. Ressuscitem as células em meio de bloqueio em uma concentração final de 1 x 10⁶ células por 250 μl. Ressuspender as esferas em 100 μl de meio de bloqueio.
11. Transfira as células para novos tubos de citometria de fluxo com fundo redondo de poliestireno com tampa do filtro de células. Isso permitirá a ruptura de aglomerantes de células.
12. Transporte todas as suspensões da pilha e do grânulo ao classificador da pilha no gelo na obscuridade.
13. Executar células de controle não manchadas para estabelecer a fluorescência de fundo e definir as tensões.
14. Execute os tubos de controle de compensação para definir a compensação de fluorescência.
15. Use a área de dispersão direta (FSC-A) vs área de dispersão lateral (SSC-A) para identificar células e, em seguida, use a área de dispersão direta (FSC-A) versus a altura de dispersão direta (FSC-H) para selecionar células únicas.
16. Adicionar DAPI, 1 μL de solução de 5 μg/mL para cada mL de amostra, para o controle não manchado para definir a gating para células mortas (Figura 2). Nenhuma lavagem é exigida após a mancha de DAPI.
17. Executar controles de isotipo para estabelecer limiares de fluorescência de plano de fundo relacionados à vinculação não específica e definir o gating.
18. Execute a amostra manchada multicolorida. Exclua células hematopoiéticas e endoteliais por gating em CD31 e CD45 células negativas. Coletar as populações de pericyte (CD146⁺ CD34^-) e célula adventícia (CD146^- CD34⁺) em tubos de coleta (Figura 2).
    Nota: os rendimentos de células viáveis ideais são aproximadamente 2% da dissociação total da célula viva para os pericitos e 1,5% para as células adventiciais.

6. cultura celular

1. Os pericitos recentemente classificados da semente e as pilhas adventitial em uma densidade de 30.000 a 40.000 Cells/cm² em placas revestidas gelatina da cultura
2. Para revestir as placas de cultura, cubra a área da chapa com gelatina estéril de 0,2% (p/v) em solução de PBS (aproximadamente 100 μL de solução por cm²). Incubar à temperatura ambiente durante 10 min e retire a solução. Mantenha pilhas recentemente classificadas no gelo durante o revestimento da placa da cultura.
3. Centrifugue pilhas recentemente coletadas em 200 x g por 5 minutos e Resuspenda delicadamente a pelota da pilha em uma quantidade apropriada de meio de crescimento endothelial (EGM). Se o número de células coletadas for muito baixa, evite a centrifugação e a placa diretamente as células coletadas.
4. Semente as pilhas em placas gelatina-revestidas. Incubar a 37 ° c em 5% CO₂.
5. Uma vez que as células se estabeleceram e aderiram à placa (após pelo menos 72 h), troca EGM com meio de crescimento celular perivascular (DMEM suplementado com 20% de calor inativado FCS, 1% penicilina/estreptomicina e 1% L-glutamina) para ambos os pericitos e células adventiciais.
6. Uma vez que pericitos e células adventiciais atingiram 80%-90% confluência, dissociar as células usando 0, 5% tripsina-EDTA. Colete com 5% FCS/PBS, centrifugador em 200 x g por 5 min, re-suspender no meio de crescimento de células perivasculares e, em seguida, passar as células de 1:3 a 1:5 proporção (ou em aproximadamente 7.000 células/cm²) em placas de cultura de poliestireno não revestido ou frascos.

Resultados

A dissociação mecânica dos lipoaspirados manuais resultou na produção de tecido adiposo microfragmentado (MAT), constituído por um agregado de adipócitos envolvendo uma rede microvascular (Figura 3). A análise da imunofluorescência da esteira gelatina-encaixada e cryofixed destaca esta estrutura, mostrando a rede vascular marcada pelo receptor da pilha endothelial Ulex europaeus aglutinina 1 (UEA-1) que consiste principalmente em pequenos, vasos capilar-como ...

Discussão

Este papel descreve o fractionation físico, usando um dispositivo fechado do sistema, do tecido adiposo humano em conjuntos pequenos que indicam a microanatomia normal do tecido adiposo.

O tecido adiposo subcutaneous humano manualmente aspirado e a solução salina são carregados em um cilindro plástico transparente que contem grandes esferas metálicas do pinball-estilo que, em cima da agitação manual vigorosa do dispositivo, rompam a gordura no submilímetro Fragmentos. Filtros anexados e saída ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Paraformaldeído tamponado a 4% (PFA)	VWR produtos químicos	9317.901
Solução de NaCl a 0,9%	Baxter	3KB7127
AlexaFluor 555 anti-rato de cabra IgG	Life Technologies	A21422
AlexaFluor 647 cabra anti-Coelho IgG	Life Technologies	A21245
químicos para pescadores	de cloreto de amônio	1158868
Antigent Diluent	Life Technologies	3218
Anti-Mouse Ig, κ/Controle Negativo (BSA) Compensação Mais	BD Biosciences	560497
Kit de Bloqueio Avidin/Biotina	Life Technologies	4303
BD LSR Fortessa 5-laser citômetro de fluxo& nbsp;	BD Biosciences		Laser 405 nm (violeta)/375 nm (UV) - filtro V450/50 para anticorpos DAPI e V450; Laser 561nm (Amarelo-verde) - ndash; filtro YG582/15 para anticorpos PE; Laser 405 nm (violeta)/375 nm (UV) – filtro V710/50 para anticorpos BV711
Laboratórios biotinilados do vetor da lectina do europaeus do europaeus		Vector-B1065
BV711 Rato IgG1, controle do isotipo k	BD Biosciences	563044
CD146-BV711	BD Biosciences	563186
CD31-V450	BD Biosciences	561653
CD34-PE	BD Biosciences	555822
CD45-V450	BD Biosciences	560367
DAPI	Life Technologies	D1306	concentração de estoque: 5mg/mL
Cânula de lipoaspiração descartável (LGI 13 G x185 mm – AR 13/18)	Lipogemas		fornecido no kit cirúrgico Lipogems
Software Diva 306 (v.6.0)	BD Biosciences
DMEM, glicose alta, GlutaMAX sem piruvato de sódio	Technologies	61965026
EGMTM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitTM	Lonza	CC-3156
Soro Fetal de Bezerro (FCS)	Sigma-Aldrich	F2442
FlowJo (v.10.0)	Gelatina FlowJo
Fluoromount G	SouthernBiotech	0100-01
	Kit Cirúrgico Acros Organics	410870025
Lipogems	Lipogems	LG SK 60
Mouse anti humano- NG2	BD Biosciences	554275	concentração de estoque: 0,5 mg/mL
PE Mouse IgG1, κ Controle de Isotipo	BD Biosciences	555749
Penicilina-Estreptomicina	Sigma-Aldrich	P4333
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Tubo de 5 mL de poliestireno com tampa de pressão de filtro de células	BD Biosciences	352235, 25/Pacote
Tubos de poliestireno de fundo redondo de 5 mL	BD Biosciences	352003
Rabbit anti humano - PDGFRb	Abcam	32570	concentração de estoque: 0,15 mg/mL
Estreptavidina conjugada-488	Life Technologies	S32354
Sucarose	Sigma-Aldrich	84100-5kg
Cânula de infiltração de tecido (17 G x 185 mm-VG 17/18)	Lipogemas		fornecido no kit cirúrgico Lipogems
Tris base	fisher chemicals	BP152-500
Type- II Collagenase	Gibco	17101-015
V450 Mouse IgG1, κ Controle de isotipo	BD Biosciences	560373
Widefield Zeiss observador	Zeiss		Objetiva usada: Plan-Apo 20x/0.8
Zeiss Colibri7 Fonte de luz LED (LEDs: 385, 475, 555, 590, 630 nm)	Zeiss		DAPI: UV, excitação 385 nm; 488: Azul, excitação 475 nm;   555: Verde, excitação 555 nm;   647:Vermelho, excitação 630 nm