Aqui descrevemos e validamos um método para gerar consistentemente cardiomiócitos pluripotentes derivados de células-tronco induzidas por humanos robustos e caracterizar sua função. Essas técnicas podem ajudar no desenvolvimento de insights mecanicistas sobre as vias de sinalização, fornecer uma plataforma para o rastreamento de medicamentos em larga escala e doenças cardíacas de modelo confiável.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Geração de cardiomiócitos derivados de HiPSC semelhantes ao Ventricular e preparações celulares de alta qualidade para caracterização de manuseio de cálcio
Neste artigo
Resumo
Resumo
Cardiomiócitos pluripotentes induzidos por células-tronco induzidas pelo homem (iPSC-CMs) fornecem umavaliosa fonte humana para estudar a ciência básica das vias de manuseio e sinalização de células-tronco de alta taxa de consumo, bem como rastreamento de drogas de alta taxa de rendimento e ensaios de toxicidade. Aqui, fornecemos uma descrição detalhada das metodologias usadas para gerar iPSC-CMs de alta qualidade que podem reproduzir consistentemente características moleculares e funcionais em diferentes linhas celulares. Além disso, um método é descrito para avaliar de forma confiável sua caracterização funcional através da avaliação das propriedades de manuseio Ca2+. As condições de baixo oxigênio (O2),a seleção de lactato e o tempo prolongado na cultura produzem cardiomiócitos ventriculares de alta pureza e alta qualidade. Semelhante aos cardiomiócitos de ratos adultos isolados (ARCMs), os iPSC-CMs de 3 meses de idade apresentam maior amplitude Ca2+, taxa mais rápida de recaptação Ca2+ (decay-tau) e uma resposta lusitropical positiva à estimulação β-adrenergizic em comparação com o dia 30 iPSC-CMs. A estratégia é tecnicamente simples, rentável e reproduzível. Ele fornece uma plataforma robusta para modelar a doença cardíaca e para o rastreamento de drogas em grande escala para atingir proteínas de manuseio Ca2+.
Introdução
Cardiomiócitos pluripotentes induzidos pelo homem (iPSC-CMs) são uma atraente plataforma de base humana para modelar uma grande variedade de doenças cardíacas in vitro1,2,3,5,5,6,7. Além disso, o iPSC-CMs pode ser usado para a previsão de respostas do paciente a medicamentos novos ou existentes, para rastrear compostos de acerto e desenvolver novos medicamentos personalizados9,
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Os experimentos com cardiomiócitos de ratos adultos neste estudo foram realizados com protocolos aprovados do Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Icahn School of Medicine no Monte Sinai. Os cardiomiócitos de rato adultos foram isolados dos corações de rato DeSprague Dawley pelo método baseado em Langendorff, como descrito anteriormente16.
1. Preparação da Mídia
- Prepare a mídia hiPSC.
- Equilibre o suplemento e a temperatura média-sala basal (RT). Certifique-se de que o suplemento tenha descongelado completamente. Misture 400 mL do meio basal e 100 mL do suplemento e filtre usando um....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
O protocolo descrito na Figura 1A gerou cardiomiócitos altamente puros que adquirem um fenótipo ventricular/adulto com o tempo na cultura. Conforme avaliado pela coloração de imunofluorescência para a cadeia de luz reguladora de miosina atrial e ventricular 2 isoformes (MLC2A e MLC2V, respectivamente), a maioria das células geradas por este protocolo foi MLC2A-positivo no dia 30 após a indução de diferenciação cardíaca, enquanto MLC2V foi expressa em quantidades muito mais b.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Passos críticos para o uso de iPSC-CMs humanos como modelos experimentais são: 1) gerando cardiomiócitos de alta qualidade (CMs) que podem garantir o desempenho consistente e resultados reprodutíveis; 2) permitir que as células amadureçam na cultura por pelo menos 90 dias para avaliar adequadamente seu fenótipo; 3) realização de estudos eletrofisiológicos, por exemplo, medidas transitórias de cálcio (Ca2+),para fornecer uma caracterização funcional fisiologicamente relevante de iPSC-CMs humanos. Desenvolvemos .......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi apoiada pela AHA Scientist Development Grant 17SDG33700093 (F.S.); Mount Sinai KL2 Scholars Award for Clinical and Translational Research Career Development KL2TR001435 (F.S.); NIH R00 HL116645 e AHA 18TPA34170460 (C.K.).
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Anti-Actina, anticorpo de músculo liso, camundongo monoclonal | Sigma Aldrich | A5228 | |
| Alexa Fluor 488 cabra anti camundongo | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa Fluor 555 cabra anti coelho | Invitrogen | A21428 | |
| B27 Suplemento | Gibco | 17504-044 | |
| B27 (-) insulina | Suplemento Gibco | A18956-01 | |
| CHIR-99021 | Selleckchem | S2924 | |
| DAPI mancha nuclear | ThermoFisher | D1306 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1X) + L-Glutamina + 15mM Hepes | Gibco | 11330-032 | |
| Levantador de células de extremidade dupla, lâmina plana e gancho J | Celltreat | 229306 | |
| Placa de cultura de tecidos multipoços Falcon, 6 poços | Corning | 353046 | |
| Aquecedor em linha fluídico | Instrumento de célula viva | IL-H-10 | |
| Fura-2, AM | Invitrogen | F1221 | |
| matriz qualificada por hESC | Corning | 354277 | Matriz Matrigel |
| hPSC mídia | Gibco | A33493-01 | StemFlex Basal Medium |
| IWR-1 | Sigma Aldrich | I0161 | |
| Câmara de imagem de células vivas | Instrumento de célula viva | EC-B25 | |
| sistemas sinápticos | de anticorpos monoclonais de camundongo | 311011 | |
| sistema de cálcio e contratilidade de miócitos | Ionoptix | ISW-400 | |
| Anticorpo de cadeia leve de miosina 2, policlonal de coelho (MLC2V) | Proteintech | 10906-1-AP | |
| Unidades de filtro descartáveis estéreis de fluxo rápido Nalgene com membrana | PESThermoFisher | 124-0045 | |
| PBS com Cálcio e Magnésio | Corning | 21-030-CV | |
| PBS sem Cálcio e Magensium | Corning | 21-031-CV | |
| Lamelas de Cobertura de Vidro Premium | Lab Scientific | 7807 | |
| RPMI medium 1640 (-) D-glucose (1X) | Gibco | 11879-020 | |
| RPMI medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | |
| L-lactato de sódio | Sigma Aldrich | L7022 | |
| Suplemento StemFlex | Gibco | A33492-01 | |
| Tiazovivina | Tocris | 3845 | |
| Tripsina-EDTA (0,25%) | ThermoFisher | 25200056 | |
| solução de Tyrode | Boston Bioproducts | BSS-355w | Ajuste o pH em 7,2. Adicione cloreto de cálcio 1,2 mM |
Referências
- Karakikes, I., et al. Correction of human phospholamban R14del mutation associated with cardiomyopathy using targeted nucleases and combination therapy. Nature Communications. 6, 6955(2015).
- Moretti, A., et al.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
