Imagem nanoscópica de seções do tecido humano através da expansão física e isotropic

Resumo

A imagem latente de nanoscale de amostras clínicas do tecido pode melhorar a compreensão da patogénese da doença. A patologia de expansão (ExPath) é uma versão da microscopia de expansão (ExM), modificada para compatibilidade com amostras de tecido clínico padrão, para explorar a configuração de nanoescala de biomoléculas usando microscópios limitados de difração convencional.

Resumo

Na patologia moderna, a microscopia óptica desempenha um papel importante no diagnóstico da doença, revelando estruturas microscópicas de espécimes clínicos. No entanto, o limite de difração física fundamental impede a interrogação da anatomia de nanoescala e alterações patológicas sutis ao usar abordagens de imagem óptica convencionais. Aqui, nós descrevemos um protocolo simples e barato, chamado patologia da expansão (expath), para a imagem latente ótica nanoescala de tipos comuns de espécimes preliminares clínicos do tecido, incluindo o tecido fixo-congelado ou formalin-fixo da parafina incorporado (ffpe) Seções. Este método contorna o limite ótico da difração quimicamente transformando as amostras do tecido no híbrido do tecido-Hydrogel e expandindo-os fisicamente isotropicamente através das escalas múltiplas na água pura. Devido à expansão, moléculas previamente inresolvíveis são separadas e, portanto, podem ser observadas usando um microscópio óptico convencional.

Introdução

Investigar a organização molecular dos tecidos em um contexto tridimensional (3D) pode proporcionar uma nova compreensão das funções biológicas e do desenvolvimento da doença. No entanto, esses ambientes de nanoescala estão além das capacidades de resolução de microscópios limitados de difração convencional (200 − 300 nm), onde a distância mínima resolvível, d é definida por d α λ/na. Aqui λ é o comprimento de onda da luz e na é a abertura numérica (na) do sistema de imagem. Recentemente, a visualização direta de moléculas etiquetadas cDNAs foi feita possível por técnicas de imagem latente recentemente desenvolvidas da super-definição^1,2,3, incluindo a depleção de emissão estimulada (sted), microscopia de Localização foto-ativada (PALM), microscopia de reconstrução óptica estocástica (STORM) e microscopia de iluminação estruturada (SIM). Embora essas técnicas de imagem tenham revolucionado a compreensão da função biológica na nanoescala, na prática, eles muitas vezes dependem de equipamentos caros e/ou especializados e etapas de processamento de imagem, podem ter um tempo de aquisição mais lento em comparação com a imagem latente ótica convencional, exige fluoróforos com características específicas (tais como a capacidade da foto-comutação e/ou o photostability elevado). Além disso, continua a ser um desafio para executar imagens 3D de super resolução em espécimes de tecido.

A microscopia de expansão (Exm), introduzida primeiramente em 2015⁴, fornece meios alternativos de características da nanoescala da imagem latente (< 70 nanômetro) fisicamente expandindo amostras preservadas encaixadas em um Hydrogel expansível do polyeletrólito. Aqui, as principais biomoléculas e/ou rótulos são ancorados in situ a uma rede de polímeros que pode ser isotopicamente expandida após o processamento químico. Como a expansão física aumenta a resolução efetiva total, as moléculas de interesse podem ser resolvidas usando sistemas convencionais de geração de imagens com limitação de difração. Desde a publicação do protocolo original, onde rótulos fluorescentes sintetizados personalizados foram ancorados à rede de polímeros⁴, novas estratégias têm sido usadas para ancorar diretamente as proteínas (retenção de proteínas Exm, ou proexm)^{5, 6,7,8,9} e RNA^9,10,11,12 ao Hydrogel, e aumentam a ampliação física com iterativo expansão¹³ ou adaptando a química do gel^8,14,15.

Aqui nós apresentamos uma versão adaptada de proExM, chamada patologia da expansão (ExPath)¹⁶, que foi aperfeiçoada para formatos clínicos da patologia. O protocolo converte amostras clínicas, incluindo o formalin-fixo parafina-encaixado (ffpe), o hematoxilina e a eosina (H & e) manchado, e os espécimes humanos fresco-congelados do tecido montados em corrediças de vidro, em um estado compatível com Exm. As proteínas são então ancoradas no hidrogel e a homogeneização mecânica é realizada (Figura 1)¹⁶. Com uma expansão linear de 4 dobras das amostras, as imagens multicolor da super-definição (~ 70 nanômetro) podem ser obtidas usando um microscópio confocal convencional que tem somente uma definição do ~ 300 nm e pode igualmente ser combinada com outras técnicas de imagem latente da super-definição.

Protocolo

1. preparação de reagentes e soluções de estoque

1. Prepare os componentes da solução de gelificação.
   Nota: as concentrações da solução são dadas em g/ml (w/v por cento).
   1. Faça as seguintes soluções de estoque: 38% (w/v) acrilato de sódio (SA), 50% (w/v) acrilamida (AA), 2% (w/v) N, N′-metilenebisacrilamida (BIS), e 29,2% (w/v) cloreto de sódio (NaCl). Dissolva os compostos em água duplamente desionizada (ddH₂o). Use os montantes na tabela 1 como referência; as soluções preparadas podem ser dimensionadas para cima ou para baixo em volume conforme necessário. Por exemplo, para fazer 10 mL de uma solução de SA 38% (w/v), adicione 1,9 g SA a um cilindro graduado de 10 mL e adicione ddH₂o a um volume de 5 ml.
   2. Prepare 9,4 mL de solução de monômero a uma concentração de 1,06 x, como mostrado na tabela 1.
      Nota: Isso resultará em uma concentração de 1x após a adição do iniciador, acelerador e inibidor. O estoque do monómero pode ser armazenado em 4 ° c por até 3 meses, ou em-20 ° c para o armazenamento a longo prazo.
   3. Prepare as seguintes soluções de estoque separadamente em ddH₂o: 0,5% (w/v) do inibidor 4-hydroxy-2, 2, 6, 6-tetrametilpiperidina-1-OXILO (4ht), que inibe a gelação para permitir a difusão da solução de geladura em tecidos, 10% (v/v) do tetrametilethylenediamine do iniciador (TEMED), que acelera a geração radical pelo persulfato do amónio (APS), e 10% (w/v) APS que inicia o processo gelificação.
      Nota: As soluções de stock de 4HT e TEMED podem ser preparadas em alíquotas de 1 mL e armazenadas a-20 ° c durante pelo menos 6 meses. O APS foi encontrado para perder a eficácia após o armazenamento a longo prazo e é preparado melhor em quantidades pequenas (< 0.1 mL) imediatamente antes de Gelling.
2. Prepare o tampão de digestão (50 mM TRIS pH 8,0, 25 mM EDTA, 0,5% [w/v] surfactante não iônico, 0,8 M NaCl) combinando 25 mL de 1 M Tris pH 8 (3, 3 g de base Tris em 25 mL de ddH₂O), 25 ml de EDTA (0,5 m pH 8) , 2,25 g de surfactante não iônico e 23,38 g de NaCl. Adicionar ddH₂O para um volume total de 500 ml.
   Nota: A solução pode ser dimensionada para cima ou para baixo conforme necessário e ser armazenada a 4 ° c. Proteinase K (ProK) será adicionado imediatamente antes da etapa de digestão.
3. Prepare solução de citrato de sódio a 20 mM combinando 2,941 g de citrato de sódio tribásico dihidratado com 500 mL de ddH₂O e ajustando o pH para 8,0 à temperatura ambiente (RT). Dimensione o volume de estoque conforme necessário.
4. Prepare uma solução de estoque de 6-((acryloyl) amino) hexanoic acid, grufo Ester (acryloyl-X, se; AcX), o composto de ancoragem. Dissolver AcX em 500 μL de dimetil sulfóxido anidro (DMSO) para uma concentração final de 10 mg/mL.
   Nota: A solução pode ser armazenada em um ambiente dessecado a-20 ° c em alíquotas de 20 μL.
5. Se não estiver usando buffers disponíveis comercialmente para imunomarcação, prepare o buffer de bloqueio. Use um amortecedor de bloqueio de 5% (v/v) soro animal normal e 0,1% (w/v) surfactante nonionic em 1x fosfato-tampão salino (PBS) e selecione o soro baseado no animal do anfitrião dos anticorpos secundários. Por exemplo, para preparar 500 mL de tampão de bloqueio para anticorpos levantados na cabra, combine 25 mL de soro de cabra, 0,45 g de surfactante não iônico, e 1X PBS a um volume de 500 mL.

2. preparação de slides de tecido clínico arquivados e recém-preparados para ExPath

1. Converta o tecido em um formato compatível com ExPath. Escolha uma das quatro etapas seguintes (2.1.1 − 2.1.4) com base no modo como a amostra foi preparada: lâminas de FFPE, lâminas de FFPE manchadas ou lâminas de tecido congelado fixas ou fixadas em uma solução de temperatura de corte ótima (OCT).
   Nota: estes são baseados em passos de recuperação padrão para amostras de patologia e não são específicos para o protocolo ExPath.
   1. Amostras clínicas de FFPE
      1. Prepare 30 mL de 95% de etanol, 70% de etanol e 50% de etanol. Medir 30 mL de xileno, 100% de etanol e ddH₂O.
      2. Coloque o slide com a amostra em um 50 mL cônico usando fórceps e adicione 15 mL de xileno. Tampe o tubo e posicione-o horizontalmente em um agitador orbital a aproximadamente 60 RPM e incubar em RT por 3 min para cada solução. Repita com os restantes 15 mL de xileno.
      3. Repita a etapa 2.1.1.2 com 100% de etanol, 95% de etanol, 70% de etanol, 50% de etanol e ddH₂O em lugar de xileno.
   2. Lâminas permanentes manchadas e montadas
      1. Coloque o slide em um prato de Petri de 100 mm e cubra com xileno. Retire cuidadosamente a lamínula com uma lâmina de barbear. Se a lamínula não for facilmente removida, devolva o slide ao xileno até que a lamínula se afrouxa.
      2. Processo que usa as etapas para amostras de FFPE (etapas 2.1.1.1 − 2.1.1.3).
         Nota: No caso de lâminas manchadas de H & E, as manchas são eliminadas durante o processo de expansão.
   3. Deslizamentos de tecido congelado não fixos na solução de OCT
      1. Fixar o tecido em acetona a-20 ° c durante 10 min.
      2. Lave as amostras com solução 1X PBS 3 vezes por 10 min cada na RT.
   4. Lâminas de tecido clínico previamente fixas e congeladas
      1. Incubar os slides por 2 min em RT para derreter a solução OCT.
      2. Lave a amostra com solução 1X PBS 3 vezes por 5 min cada na RT.
2. Realize o tratamento térmico para a recuperação do antígeno em todas as amostras após a conversão do formato.
   1. Adicione 20 mM de solução de citrato (pH 8 em RT) em um recipiente resistente ao calor, como um frasco de coloração de slides.
      Nota: Deve haver solução suficiente para cobrir o tecido montado na corrediça (50 mL para um frasco de coloração de slide padrão).
   2. Aqueça a solução de citrato a 100 ° c no microondas e coloque o slide na solução. Transfira imediatamente o recipiente para uma câmara de incubação e incubar a 60 ° c durante 30 min.
      Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. As lâminas podem ser colocadas em placas de Petri e cobertas em 1X PBS e armazenadas a 4 ° c.
3. Manchar a amostra usando protocolos de coloração padrão da imunofluorescência (se)/immunohistochemistry (IHC).
   Nota: as concentrações específicas de anticorpos primários e secundários e as durações de coloração dependem das concentrações sugeridas pelo fabricante ou pela otimização para o experimento específico.
   1. Use uma caneta hidrofóbica para desenhar um limite ao redor da seção (s) de tecido no slide para minimizar o volume de solução necessária para cobrir o tecido. Coloque o slide em um prato grande o suficiente para caber o slide. Para um slide de 3 polegadas padrão, use um prato de Petri de 100 mm.
      Nota: A caneta hidrofóbica não interfere na polimerização da amostra nem no processo de digestão.
   2. Incubar o tecido com tampão de bloqueio para 1 h a 37 ° c, 2 h em RT, ou 4 ° c durante a noite para reduzir a ligação não específica.
   3. Diluir os anticorpos primários à concentração desejada na quantidade adequada de tampão de bloqueio preparado (ou outro tampão de coloração preferido). Incubar os tecidos com a solução de anticorpo primário por pelo menos 3 h a RT ou 37 ° c, ou durante a noite a 4 ° c.
      Nota: As amostras devem ser colocadas em um recipiente humidificado (tal como uma placa de Petri com uma limpeza úmida) para impedir que o tecido seque para fora. Tipicamente, os anticorpos foram diluídos a 1:100 − 1:500 em 200 − 500 μL do tampão, dependendo do tamanho do tecido e do anticorpo usado.
   4. Lave o tecido com tampão de bloqueio preparado (ou outro tampão de lavagem preferido) 3 vezes por 10 min em RT.
   5. Diluir anticorpos secundários (e 300 nM 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole [DAPI] se desejado), em tampão de bloqueio preparado (ou outro tampão de coloração preferido) a uma concentração de aproximadamente 10 μg/mL. Incubar o tecido na solução de anticorpos secundários durante pelo menos 1 h a RT ou 37 ° c.
      Nota: O sincronismo pode ser ajustado dependendo dos anticorpos usados e da espessura do tecido. Os anticorpos secundários que contenham corantes de cianina (Cy3, Cy5, Alexa 647) não são compatíveis com o protocolo ExM quando aplicados pré-polimerização. Corantes sugeridos incluem Alexa 488 (verde), Alexa 546 (laranja/vermelho) e ATTO 647N ou CF633 (far-Red). DAPI deve ser reaplicado após a expansão, como ele é lavado durante o processo de expansão.
   6. Lave o tecido com tampão de bloqueio preparado (ou outro tampão de lavagem preferido) 3 vezes por 10 min cada no RT.
      Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. As lâminas podem ser colocadas em placas de Petri e cobertas em 1X PBS e armazenadas a 4 ° c.
   7. Realize a imagem latente fluorescente usando um microscópio convencional do largo-campo, um microscópio confocal, ou o outro sistema da imagem latente da escolha.
      Nota: Esta etapa é necessária para determinar o comprimento biológico usando o fator de expansão, comparando imagens pré e pós-expansão. Para facilitar a imagem latente da borne-expansão, as regiões de interesse facilmente identificáveis devem ser selecionadas e as imagens na ampliação baixa e elevada devem ser coletadas.

3. polimerização in situ de espécimes

1. Incubar a amostra na solução de ancoragem.
   1. Prepare a solução de ancoragem (tipicamente 250 μL é suficiente para cobrir a seção do tecido) diluindo a solução de estoque AcX em 1X PBS para uma concentração de 0, 3 mg/mL para amostras fixadas com fixadores não-aldeído ou 0,1 mg/mL para amostras fixadas com fixadores de aldeído , que têm menos aminas livres disponíveis para reagir com AcX.
   2. Coloque o slide em um prato de Petri de 100 mm e pipetar a solução de ancoragem sobre o tecido. Incubar por pelo menos 3 h na RT ou durante a noite a 4 ° c.
2. Incubar as amostras na solução gelificação.
   1. Prepare pelo menos 100 vezes o volume excedente de solução gelificação. Por 200 μL, combine o seguinte, em ordem: 188 μL de solução de monômero, 4 μL de solução de estoque de 0,5% 4HT (1:50 diluição, concentração final: 0, 1%), 4 μL de solução de estoque de 10% de TEMED (1:50 diluição, concentração final 0,2%) e 4 μL de solução de estoque de 10% APS (1:50 diluição, concentração final 0,2%).
      Nota: A solução de Gelling deve ser feita imediatamente antes do uso. A solução deve ser mantida a 4 ° c e a solução APS deve ser adicionada por último, para evitar a gelagem prematura.
   2. Remova a solução adicional da seção do tecido e coloc a corrediça em um prato de Petri de 100 milímetros. Adicione a solução fresca, gelificação fria à amostra e incubar a mistura no tecido por 30 minutos em 4 ° c, para permitir a difusão da solução no tecido.
3. Construa uma câmara na corrediça em torno da amostra (Figura 2a) sem perturbar a solução gelificação.
   1. Faça espaçadores para a câmara gelando por pedaços de corte fino de vidro de cobertura usando uma faca de diamante.
      Nota: Para facilitar a expansão do borne da imagem latente, os espaçadores devem ser próximos na espessura ao espécime do tecido para reduzir a quantidade de gel em branco acima do tecido. O vidro do número 1,5 pode ser usado para amostras clínicas padrão (5 − 10 μm). As partes de vidro da tampa podem ser empilhadas para amostras mais grossas.
   2. Fixe os espaçadores em ambos os lados do tecido usando gotas de água (~ 10 μL).
   3. Coloque cuidadosamente uma tampa de vidro sobre a lâmina, certificando-se de evitar a captura de bolhas de ar sobre o tecido (Figura 2B).
4. Incubar a amostra a 37 ° c num ambiente humidificado (como um prato de Petri fechado com uma limpeza úmida) durante 2 h.
   Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. A câmara deslizante pode ser armazenada dentro de um prato de Petri selado a 4 ° c.

4. digestão da amostra

1. Retire a tampa da câmara de gelificante deslizando suavemente uma lâmina de barbear a lamínula e levantando lentamente o lamínula da superfície do gel. Aparar o gel em branco em torno do tecido para minimizar o volume. Corte o gel assimetricamente para rastrear a orientação do gel após a homogeneização, uma vez que a amostra se tornará transparente.
   1. Diluir ProK por 1:200 no tampão da digestão (concentração final 4 U/mL) antes do uso. Prepare solução suficiente para submergir completamente o gel; um poço único de uma placa de cultura de células plásticas de quatro poços requer pelo menos 3 mL por poço.
   2. Incubar a amostra em um recipiente fechado contendo o tampão de digestão por 3 h a 60 ° c. Se a amostra não se desanexar do slide durante a digestão, use uma lâmina de barbear para remover suavemente a amostra.
      Nota: O espécime deve completamente ser submergido no amortecedor da digestão para impedir que a amostra seque para fora e coloc em um recipiente coberto (caixa pequena da corrediça, poço plástico, prato de Petri, etc.) que podem ser selados com película.

5. expansão e imagem latente da amostra

1. Use uma escova de pintura macia para transferir o espécime em 1X PBS em um recipiente compatível com o sistema de imagem desejado e grande o suficiente para acomodar o gel totalmente expandido. Certifique-se de que o tecido é coloc com o amostra-lado para baixo se imagem latente em um sistema invertido ou para cima se imagem latente em um sistema ereto para minimizar a distância do objetivo da imagem latente à amostra. Vire o gel usando uma escova de pintura macia, se necessário.
   Nota: O lado-iluminação de um diodo emissor de luz pode ser usado para fazê-los visíveis no líquido. Uma placa 6-well padrão pode acomodar as amostras que têm um diâmetro pre-expandido menos de 0,6 cm. Uma placa de poço inferior de vidro deve ser usada para a imagem latente em um sistema invertido.
2. Lave as amostras em 1X PBS em RT por 10 min. Se desejado, re-mancha a amostra com 300 nanômetro DAPI enquanto o processo da digestão lava afastado a mancha de DAPI. Remover PBS e mancha com 300 nM DAPI diluído em 1X PBS por 20 min em RT, seguido por uma lavagem de 10 min com 1X PBS em RT.
   Nota: As amostras podem ser cobertas com 1X PBS e armazenadas a 4 ° c antes de prosseguir para a próxima etapa.
3. Para expandir as amostras, substitua o PBS e lave com um volume excessivo de ddH₂o (pelo menos 10x o volume final do gel) 3 − 5 vezes por 10 min cada, no RT.
   Nota: Após o 3^RD ou 4^ª lavagem, a expansão do espécime deve começar a platô. Para o armazenamento, para evitar o crescimento bacteriano, o ddH₂o pode ser suplementado com a azida sódica de 0,002% − 0,01% (NaN₃). Neste caso, o fator de expansão final é reduzido reversivelmente em 10%.
4. Realize a imagem latente da fluorescência usando um microscópio convencional do largo-campo, um microscópio confocal, ou o outro sistema da imagem latente da escolha.
   Nota: Para evitar géis de deriva, o excesso de líquido pode ser removido do poço. Os géis podem igualmente ser imobilizados com o agarose do baixo-derretimento de 1.5 − 2%. Prepare o agarose do baixo-derretimento de 1.5 − 2% (w/v) na água em um recipiente 2 − 4 vezes o volume de solução. Aqueça a solução em um banho de água de 40 ° c ou em um microondas para 10 − 20 s para derreter a solução. Pipeta o agarose derretido em torno das bordas do gel. Depois de permitir que o agarose para endurecer a RT ou 4 ° c, adicione água à amostra para evitar a desidratação.

Resultados

Se o protocolo tiver sido realizado com sucesso (Figura 1), as amostras aparecerão como um gel liso e transparente após a homogeneização mecânica (Figura 3a) e podem se expandir por um fator de 3 − 4,5 x em água (Figura 3B), proporcionando uma resolução efetiva de ~ 70 nm, dependendo do fator de expansão final e do sistema^{de imagem}utilizado 5^,16

Discussão

Aqui, nós apresentamos o protocolo¹⁶de expath, uma variação de proExM⁵ que pode ser aplicado aos tipos os mais comuns de amostras clínicas da biópsia usadas na patologia, incluindo ffpe, H & e espécimes manchados, e fresco-congelados em corrediças de vidro. A conversão do formato, a recuperação do antígeno, e a imunomarcação dos espécimes seguem os protocolos comumente usados que não são específicos a ExPath. Diferentemente do protocolo proExM original⁹

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
4-hidroxi-TEMPO (4HT)	Sigma Aldrich	176141	Inibidor
Placa de fundo de vidro de 6 poços (# 1,5 lamínula)	Cellvis	P06-1.5H-N
Acetona	Fischer Scientifc	A18-500
Acrilamida	Sigma Aldrich	A8887
Acriloyl-X, SE (AcX)	Invitrogen	A20770
Agarose	Fischer Scientifc	BP160-100
Persulfato de amônio (APS)	Sigma Aldrich	A3678
Anti-ACTN4 anticorpo iniciador produzido em coelho	Sigma Aldrich	HPA001873
anticorpo anti-colágeno IV produzido em camundongo	Santa Cruz Biotech	sc-59814
anticorpo anti-vimentina produzido em frango	Abcam	ab24525
Aqua Hold II caneta hidrofóbica	Dispositivo Científico	980402
Matriz de Tecidos de Doenças Comuns da Mama	Abcam	ab178113
DAPI (1 mg / mL)	Thermo Scientific	62248	Mancha nuclear
Faca de diamante nº 88 CM	Ferramentas Gerais	31116
Etanol	Pharmco	111000200
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 0,5 M	VWR	BDH7830-1
FFPE Amostra	de rim USBiomax	HuFPT072
Fórceps
de cabra anti-frango IgY (H+L), CF488A altamente adsorvido	Biotium	20020
IgY anti-frango de cabra (H+L), CF633 de alta adsorção cruzada	Biotium	20121
IgG anti-coelho de cabra (H+L) Altamente adsorvido Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11010
MAXbind Staining Medium	Active Motif	15253	Pode ser substituído por tampão de suporte não comercial de escolha.
MAXblock Blocking Medium	Active Motif	15252	Pode ser substituído por um buffer de bloqueio não comercial de sua escolha.
MAXwash Meio de Lavagem Active	Motif	15254	Pode ser substituído por um tampão de lavagem não comercial de sua escolha.
Micro vidro de cobertura #1 (24 mm x 60 mm)	VWR	48393 106
Micro vidro de cobertura #1.5 (24 mm x 60 mm)	VWR	48393 251
N,N,N′,N′- Tetrametiletilenodiamina (TEMED)	Sigma Aldrich	T9281	Acelerador
N,N′-Metilenobisacrilamida	Sigma Aldrich	M7279
Soro	de cabra normalJackson Immunoresearch	005-000-121	Para preparar o tampão de bloqueio. Dependente do hospedeiro animal de anticorpos secundários.
Placa de Cultura de Células Multi-Well Nunclon 4-Well x 5 mL Placa de Cultura de Células Multi-Well	Thermo Fisher	167063	Placa de Cultura de
Células Nunclon de 6 Well	Thermo	Fisher 140675
Nunc 15 mL  Garrafa Térmica Cônica		Fisher 339651
Nunc 50 mL  Escova de
Orbital Shaker
Medidor
Tampolado com Fosfato Salino (PBS), Solução 10x	de Plástico Fischer Scientifc	BP399-1
(100 mm)	Fischer Scientifc	FB0875713
Grau de Biologia Molecular)	Thermo Scientific	EO0491
Lâmina de barbear	Fischer Scientifc	12640
Tubos de microcentrífuga Safelock 1,5 mL	Thermo Fisher	3457
Tubos de microcentrífuga Safelock 2,0 mL	Thermo Fisher	3459
Acrilato de sódio	Sigma Aldrich	408220
Cloreto de sódio	Sigma Aldrich	S6191
Citrato de sódio tribásico di-hidratado	Sigma Aldrich	C8532-1KG
Tris Base	Fischer Scientifc	BP152-1
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Aglutinina de gérmen de trigo marcada com CF640R	Biotium	29026
Xilenos	Sigma Aldrich	214736