A imagem latente de nanoscale de amostras clínicas do tecido pode melhorar a compreensão da patogénese da doença. A patologia de expansão (ExPath) é uma versão da microscopia de expansão (ExM), modificada para compatibilidade com amostras de tecido clínico padrão, para explorar a configuração de nanoescala de biomoléculas usando microscópios limitados de difração convencional.
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Artigo de método
Imagem nanoscópica de seções do tecido humano através da expansão física e isotropic
Neste artigo
Resumo
Resumo
Na patologia moderna, a microscopia óptica desempenha um papel importante no diagnóstico da doença, revelando estruturas microscópicas de espécimes clínicos. No entanto, o limite de difração física fundamental impede a interrogação da anatomia de nanoescala e alterações patológicas sutis ao usar abordagens de imagem óptica convencionais. Aqui, nós descrevemos um protocolo simples e barato, chamado patologia da expansão (expath), para a imagem latente ótica nanoescala de tipos comuns de espécimes preliminares clínicos do tecido, incluindo o tecido fixo-congelado ou formalin-fixo da parafina incorporado (ffpe) Seções. Este método contorna o limite ótico da difração quimicamente transformando as amostras do tecido no híbrido do tecido-Hydrogel e expandindo-os fisicamente isotropicamente através das escalas múltiplas na água pura. Devido à expansão, moléculas previamente inresolvíveis são separadas e, portanto, podem ser observadas usando um microscópio óptico convencional.
Introdução
Investigar a organização molecular dos tecidos em um contexto tridimensional (3D) pode proporcionar uma nova compreensão das funções biológicas e do desenvolvimento da doença. No entanto, esses ambientes de nanoescala estão além das capacidades de resolução de microscópios limitados de difração convencional (200 − 300 nm), onde a distância mínima resolvível, d é definida por d α λ/na. Aqui λ é o comprimento de onda da luz e na é a abertura numérica (na) do sistema de imagem. Recentemente, a visualizaç....
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Protocolo
1. preparação de reagentes e soluções de estoque
-
Prepare os componentes da solução de gelificação.
Nota: as concentrações da solução são dadas em g/ml (w/v por cento).- Faça as seguintes soluções de estoque: 38% (w/v) acrilato de sódio (SA), 50% (w/v) acrilamida (AA), 2% (w/v) N, N′-metilenebisacrilamida (BIS), e 29,2% (w/v) cloreto de sódio (NaCl). Dissolva os compostos em água duplamente desionizada (ddH2o). Use os montantes na tabela 1 como referência; as soluções preparadas podem ser dimensionadas para cima ou para baixo em volume conforme necessário. Por exemplo, para fazer 10 mL de uma solução de ....
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Resultados
Se o protocolo tiver sido realizado com sucesso (Figura 1), as amostras aparecerão como um gel liso e transparente após a homogeneização mecânica (Figura 3a) e podem se expandir por um fator de 3 − 4,5 x em água (Figura 3B), proporcionando uma resolução efetiva de ~ 70 nm, dependendo do fator de expansão final e do sistemade imagemutilizado 5,16
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Discussão
Aqui, nós apresentamos o protocolo16de expath, uma variação de proExM5 que pode ser aplicado aos tipos os mais comuns de amostras clínicas da biópsia usadas na patologia, incluindo ffpe, H & e espécimes manchados, e fresco-congelados em corrediças de vidro. A conversão do formato, a recuperação do antígeno, e a imunomarcação dos espécimes seguem os protocolos comumente usados que não são específicos a ExPath. Diferentemente do protocolo proExM original9
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Divulgações
YZ e OB são dois dos inventores que preencheram e obtiveram proteção de patentes em um subconjunto das tecnologias descritas aqui (patentes dos EUA US20190064037A1, WO2018157074A1 e WO2018157048A1).
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo fundo de start-up da faculdade da Universidade de Carnegie Mellon (YZ) e do prêmio novo Inovator do diretor de NIH (DP2 OD025926-01 a YZ).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 4-hidroxi-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inibidor |
| Placa de fundo de vidro de 6 poços (# 1,5 lamínula) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acetona | Fischer Scientifc | A18-500 | |
| Acrilamida | Sigma Aldrich | A8887 | |
| Acriloyl-X, SE (AcX) | Invitrogen | A20770 | |
| Agarose | Fischer Scientifc | BP160-100 | |
| Persulfato de amônio (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | |
| Anti-ACTN4 anticorpo iniciador produzido em coelho | Sigma Aldrich | HPA001873 | |
| anticorpo anti-colágeno IV produzido em camundongo | Santa Cruz Biotech | sc-59814 | |
| anticorpo anti-vimentina produzido em frango | Abcam | ab24525 | |
| Aqua Hold II caneta hidrofóbica | Dispositivo Científico | 980402 | |
| Matriz de Tecidos de Doenças Comuns da Mama | Abcam | ab178113 | |
| DAPI (1 mg / mL) | Thermo Scientific | 62248 | Mancha nuclear |
| Faca de diamante nº 88 CM | Ferramentas Gerais | 31116 | |
| Etanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 0,5 M | VWR | BDH7830-1 | |
| FFPE Amostra | de rim USBiomax | HuFPT072 | |
| Fórceps | |||
| de cabra anti-frango IgY (H+L), CF488A altamente adsorvido | Biotium | 20020 | |
| IgY anti-frango de cabra (H+L), CF633 de alta adsorção cruzada | Biotium | 20121 | |
| IgG anti-coelho de cabra (H+L) Altamente adsorvido Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11010 | |
| MAXbind Staining Medium | Active Motif | 15253 | Pode ser substituído por tampão de suporte não comercial de escolha. |
| MAXblock Blocking Medium | Active Motif | 15252 | Pode ser substituído por um buffer de bloqueio não comercial de sua escolha. |
| MAXwash Meio de Lavagem Active | Motif | 15254 | Pode ser substituído por um tampão de lavagem não comercial de sua escolha. |
| Micro vidro de cobertura #1 (24 mm x 60 mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro vidro de cobertura #1.5 (24 mm x 60 mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetrametiletilenodiamina (TEMED) | Sigma Aldrich | T9281 | Acelerador |
| N,N′-Metilenobisacrilamida | Sigma Aldrich | M7279 | |
| Soro | de cabra normalJackson Immunoresearch | 005-000-121 | Para preparar o tampão de bloqueio. Dependente do hospedeiro animal de anticorpos secundários. |
| Placa de Cultura de Células Multi-Well Nunclon 4-Well x 5 mL Placa de Cultura de Células Multi-Well | Thermo Fisher | 167063 | Placa de Cultura de |
| Células Nunclon de 6 Well | Thermo | Fisher 140675 | |
| Nunc 15 mL Garrafa Térmica Cônica | Fisher 339651 | ||
| Nunc 50 mL Escova de | |||
| Orbital Shaker | |||
| Medidor | |||
| Tampolado com Fosfato Salino (PBS), Solução 10x | de Plástico Fischer Scientifc | BP399-1 | |
| (100 mm) | Fischer Scientifc | FB0875713 | |
| Grau de Biologia Molecular) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Lâmina de barbear | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Tubos de microcentrífuga Safelock 1,5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Tubos de microcentrífuga Safelock 2,0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Acrilato de sódio | Sigma Aldrich | 408220 | |
| Cloreto de sódio | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Citrato de sódio tribásico di-hidratado | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Tris Base | Fischer Scientifc | BP152-1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Aglutinina de gérmen de trigo marcada com CF640R | Biotium | 29026 | |
| Xilenos | Sigma Aldrich | 214736 |
Referências
- Hell, S. W. Far-Field Optical Nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79 (1), 2.1.1-2.1.25 (2017).
- Schermelleh, L., Heintzmann,....
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Reimpressões e permissões
