Silenciando a faísca: Edição do genoma CRISPR/Cas9 em peixes fraca elétricos

A eletrorecepção e a eletrogênese mudaram na história evolutiva dos vertebrados. Duas linhagens de peixes teleost, osteoglossiformes e siluriformes, evoluíram o electroreception em paralelo, e cinco linhagens de teleosts (gymnotiformes, mormyrids, e os Astros generacopus, Malapterurus, e Synodontis) evoluiu a eletrogênese em paralelo. Há um grau impressionante de convergência nestes fenótipos derivados independentemente, que compartilham uma arquitetura genética comum^1,2,3.

Isto é talvez melhor exemplificado pelas numerosas características convergentes de gymnotiformes e mormyrids, dois folheados teleost ricos em espécies, que produzem e detectam campos elétricos fracos e são chamados de peixes fracamente elétricos. Nos 50 anos desde a descoberta de que os peixes fracamente elétricos usam eletricidade para sentir seu entorno e comunicar⁴, uma crescente comunidade de cientistas ganhou enormes insights sobre a evolução do desenvolvimento^{1,5 ,6}, sistemas e circuitos neurociência^7,8,9,10, fisiologia celular^11,12, ecologia e energéticos^{13 ,14,15,16,17}, comportamento^18,19,e macroevolução^3,20,21 .

Mais recentemente, houve uma proliferação de recursos genômicos, transcriptômicos e proteômicos para peixes elétricos^{1,22,23,24,25,26, 27,28.} O uso desses recursos já produziu importantes insights sobre a conexão entre genótipo e fenótipo nessas espécies^{1,2,3,28,29 30}de ano. Um grande obstáculo à integração de dados genômicos com dados phenotípicos de peixes elétricos fracos é a falta atual de ferramentas de genômica funcional³¹.

Uma dessas ferramentas é a recém-desenvolvida técnica Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic, emparelhada com a técnica de endonuclease Cas9 (CRISPR/Cas9, CRISPR). CRISPR/Cas9 é uma ferramenta de edição do genoma que entrou em uso generalizado em ambos os^{modelos 32,33,34} e organismos não-modelo^35,36,37 iguais. A tecnologia CRISPR/Cas9 progrediu a um ponto onde um laboratório capaz da biologia molecular básica possa facilmente gerar as pontas de prova gene-específicas chamadas RNAs curtos do guia (sgRNAs), a um baixo custo usando um método non-cloning^38. Crispr tem vantagens sobre outras estratégias de nocaute / knockdown, como morpholinos^39,40, ativador de transcrição como nucleases efetores efetos (TALENs), e nucleases de dedo de zinco (ZFNs), que são caros e demorado para gerar para cada gene alvo.

O sistema CRISPR/Cas9 funciona para criar nocautes genéticos, visando uma região específica do genoma, dirigida pela sequência sgRNA, e causando uma quebra dupla. A ruptura dupla encalhada é detectada pela célula e desencadeia mecanismos de reparo de DNA endógenos preferencialmente usando a via de junção final não-homólogo (NHEJ). Esta via é altamente propensa a erros: durante o processo de reparo, a molécula de DNA muitas vezes incorpora inserções ou exclusões (indels) no local de ruptura duplamente encalhado. Estes indels podem conduzir a uma perda de função devido a ambos (1) deslocamentos no frame aberto da leitura, (2) inserção de um codon prematuro do batente, ou (3) deslocamentos na estrutura preliminar crítica do produto do gene. Neste protocolo, utilizamos a edição CRISPR/Cas9 para atingir mutações de pontos em genes-alvo usando o NHEJ em espécies de peixes fracamente elétricas. Embora mais simples e mais eficiente do que outras técnicas, espera-se que este método de mutagênese resulte em uma série de gravidades phenotípicas em F_0,que é atribuída ao mosaicismo genético^{41,42,43 ,44.}

Seleção de organismos
Para fins de facilitar futuros estudos sobre a genômica comparativa de peixes elétricos fracos, uma espécie representativa tanto para gymnotiforms quanto para mormyrids para desenvolvimento de protocolo saqueou. Após discussões durante a reunião de 2016 sobre Peixes Elétricos em Montevidéu, Uruguai, houve consenso da comunidade para utilizar espécies que já poderiam ser criadas em laboratório e que tinham recursos genômicos disponíveis. O gymnotiform Brachyhypopomus gauderio e o mormyrid Brienomyrus brachyistius foram selecionados como espécies que se encaixam nesses critérios. Em ambas as espécies, pistas naturais para induzir e manter condições de reprodução são fáceis de imitar em cativeiro. B. gauderio, uma espécie de gymnotiformena da América do Sul, tem a vantagem de baixos requisitos de criação: os peixes podem ser mantidos em densidade relativamente alta em tanques relativamente pequenos (4 L). B. gauderio também tem rotatividade geracional rápida em condições cativas. Em condições de laboratório, B. gauderio pode se desenvolver de ovo para adulto em cerca de 4 meses.

B. brachyistius, uma espécie de peixe mormyrid da África Central Ocidental, se reproduz prontamente em cativeiro. B. brachyistius está prontamente disponível através do comércio do aquário, tem sido amplamente utilizado em muitos estudos, e agora tem uma série de recursos genômicos disponíveis. Seu ciclo de vida abrange 1 a 3 anos, dependendo das condições de laboratório. Os requisitos de criação são um pouco mais intensivos para esta espécie, exigindo tanques de tamanho moderado (50 a 100 L) devido à sua agressão durante a reprodução.

Laboratórios que estudam outras espécies de peixes elétricos devem ser capazes de adaptar facilmente este protocolo, enquanto a espécie pode ser criada, e embriões unicelulares podem ser coletados e criados na idade adulta. Habitação, criação de larvas e taxas de fertilização in vitro (FIV) provavelmente mudarão com outras espécies; no entanto, este protocolo pode ser usado como ponto de partida para tentativas de reprodução em outros peixes fracamente elétricos.

Um alvo ideal do gene para a prova do conceito: scn4aa
Peixes mormitridas e gymnotiformes fracamente elétricos geram campos elétricos (eletrogênese) descarregando um órgão especializado, chamado órgão elétrico. As descargas de órgãos elétricos (EODs) resultam da produção simultânea de potenciais de ação nas células de órgãos elétricos chamadas eletrocitos. EODs são detectados por uma matriz de eletroreceptores na pele para criar imagens elétricas de alta resolução do ambiente do peixe⁴⁵. Os peixes fracamente elétricos também são capazes de detectar características das formas de onda EOD de suas coespecíficas^18, bem como suas taxas de descarga^46,permitindo que os EODs funcionem adicionalmente como um sinal de comunicação social análogo ao canto dos pássaros ou rã vocalizações⁴⁷.

Um componente principal da geração potencial de ação nos eletrocitos de peixes mormiridos e gymnotiformes fracamente elétricos é o canal de sódio nav1.4^2. Teleosts não elétricos expressam duas cópias de genes paralogous, scn4aa e scn4ab,codificando para o canal de sódio nav1.4^30. Em ambas as linhagens de peixes gymnotiformes e mormiridas fracamente elétricas, a scn4aa evoluiu rapidamente e passou por inúmeras substituições de aminoácidos que afetam suas propriedades cinéticas^48. Mais importante, scn4aa tornou-se compartimentado em ambas as linhagens para o órgão elétrico^2,3. A expressão relativamente restrita de scn4aa ao órgão elétrico, bem como seu papel fundamental na geração de EODs, faz com que seja um alvo ideal para experimentos de nocaute CRISPR/Cas9, pois tem efeitos pleiotrópicos deletérios mínimos. Porque os peixes fraca elétricos começam a descarregar seus órgãos elétricos larval 6-8 dias após a fertilização (DPF), alvejar do scn4aa é serido idealmente para a phenotyping rápida que segue a microinjeção do embrião.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Michigan State University.

1. Seleção de alvos sgRNA

Nota: Um protocolo é fornecido para o projeto manual de sgRNAs na etapa 1.1. Isso foi utilizado para a seleção de alvos scn4aa. Um protocolo adicional é fornecido para facilitar este processo (passo 1.2) usando o portal web EFISHGENOMICS. É aconselhável que os usuários selecionem o protocolo 1.2, que apresenta várias "verificações" automatizadas para garantir o sucesso na concepção de sgRNAs para alvos personalizados.

1. Design sgRNA alvos.
   1. Para gerar oligos guia sgRNA, é melhor alvo exon 1, ou outros exons 5'. O UTR 5' pode ser alvo; no entanto, é melhor segmentar a sequência de codificação de 5'. A utilização de informações genômicas é preferível, mas é possível desenvolver sgRNAs bem-sucedidos usando dados de transcriptoma. As anotações de limites de intron/exon (dados genômicos) ou limites de exon/exon são preferíveis.
   2. As sequências genômicas candidatas de 1,1 são pesquisadas por sequências de alvos putativos que correspondam ao padrão 5'-N (18)-NGG-3'. Isso pode ser executado automaticamente usando software de análise de sequência de desktop, scripts personalizados ou através de inspeção manual de sequências.
   3. As sequências podem ser priorizadas usando o método do Doench et al.⁴⁹ para a atividade no alvo. Além disso, as sequências de destino podem ser avaliadas por uma pesquisa BLAST contra bancos de dados genômicos/transcriptômicos para ligação fora do alvo.
   4. Certifique-se de que primers PCR padrão podem ser gerados que flanqueiam a seqüência de alvo. Primers deve ser de pelo menos 20 bp de ambos os lados do site de corte (três bases a montante da seqüência NGG). Idealmente, o produto PCR deve ser 150-200 pares de base (bp).
   5. Design oligomers atender aos critérios acima usando o modelo abaixo, que inclui um promotor T7 (5' de N₁₈) e uma região complementar (3' de N₁₈) para annealing ao oligomer constante (1.1.6): 5'-TAATACGACTCACTATAGG-N₁₈ -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3'
      Nota: A sequência N₁₈ não inclui a sequência de motivos adjacentes (PAM) do protospacer NGG. Não inclua isso no oligomer.
   6. Peça o oligomer constante(Tabela 1)que será usado para sintetizar todos os sgRNAs, oligomers para alvos sgRNA (passo 1.1.5) e primers PCR (passo 1.1.4) como oligomers dessalgados padrão de um serviço de produção de oligonucleotídeos. Oligomers e primers PCR podem ser encomendados como oligomeros dessalgados padrão, nenhuma purificação adicional é necessária.
2. Realize o design automatizado de alvos sgRNA.
   1. Usando dados genômicos, selecione um gene alvo. Os dados de transcriptoma podem ser usados quando os limites exon/intron são conhecidos. Os alvos podem ser identificados através do portal EFISHGENOMICS (http://efishgenomics.integrativebiology.msu.edu). O alvo ideal será dentro do exon 1; no entanto, outros exons de 5' e o 5' UTR podem ser considerados.
   2. Uma vez que a sequência de alvos é identificada, carregue a ferramenta web EFISHGENOMICS CRISPR (http://efishgenomics.integrativebiology.msu.edu/crispr_tool/) disponível gratuitamente. Esta ferramenta web usa uma versão personalizada do algoritmo CRISPOR para geração-alvo^50,51.
   3. Na caixa para o Passo 1,digite o nome da seqüência e digite a seqüência do alvo na caixa apropriada.
3. Selecione o genoma apropriado do que a sequência deriva. Atualmente, os dados genômicos estão disponíveis para B. brachyistius e B. gauderio. As sequências do genoma não são necessárias para o uso desta ferramenta, mas são úteis na avaliação de potenciais efeitos não desejados fora do alvo.
4. Selecione o PAM apropriado. Recomenda-se o PAM de 20 bp-NGG, embora existam vários motivos adicionais de PAM para escolher, dependendo da proteína Cas9 utilizada.
5. Um relatório será gerado com a localização da seqüência de alvo no genoma com sequências de guia sugeridas. Selecione três alvos com efeitos fora do alvo baixos previstos, altas pontuações de especificidade e altas pontuações de eficiência. As sequências de guias de maior pontuação são destacadas com verde no lado esquerdo. As sequências de guias com destaque amarelo e vermelho devem ser evitadas, se possível.
6. Clicar em sequências de destino selecionadas gera um relatório CRISPOR abrangente. As principais informações desses relatórios são para "Expressão in vitro T7 de oligonucleotídeos sobrepostos". A partir deste relatório, extraia as seguintes informações: oligos sgRNA recomendados, primers PCR para o local alvo e um oligomer constante que será usado para sintetizar todos os sgRNAs.
7. Encomende os oligomeros selecionados (passo 1.6) de um serviço de produção de oligonucleotídeos. Oligomers e primers PCR podem ser encomendados como oligomeros dessalgados padrão, nenhuma purificação adicional é necessária.

2. Gerar sgRNA

1. Oligomers anneal no tubo PCR: adicionar 1 μL de 100 μM oligomer constante, 1 μL de 100 μM sgRNA oligomer específico, e 8 μL de nuclease-livre H₂O
2. Oligomeros anneal em um termociclocom o seguinte programa: calor a 95 °C por 5 min, fresco a 85 °C em -2 °C/s, fresco a 25 °C em 0.1 °C/s, e prenda em 4 °C.
3. Para gerar modelo de sgRNA, adicione 2,5 μL de mistura dNTP (10 mM), 2 μL de buffer 10x, 0,5 μL de polimererase de DNA T4 e 5 μL de H₂O livre de nuclease aos oligomeros lacrados do passo 2.2. Incubar por 20 min a 12 °C.
4. Purifique o modelo usando uma coluna de limpeza PCR por instruções do fabricante.
5. Elute em 20-30 μL. Use um espectrômetro para estimar a concentração e pureza. O modelo deve ser 100-200 ng/μL e 1.8-1.9 A_260/280.
6. Verifique através de um gel agarose executando 1-5 μL. A banda dominante deve ser 120 bp. Veja a Figura 1A para obter resultados representativos.
7. Armazenar modelo sgRNA verificado em gel a -20 °C (longo prazo) ou 4 °C (curto prazo, 1-4 semanas).
8. Transcrever sgRNA usando kit de transcrição De RNA T7 adicionando a um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL à temperatura ambiente 8 μL de mistura dNTP (volumes iguais de dA, dT, dG, dC), 2 μL de buffer 10x (temperatura ambiente), 2 μL de polímero T7 RNA, 100-200 ng de modelo de sgRNA e h₂o sem nuclease a um volume total de 20 μL. Spin para recolher na parte inferior. Incubar por 2-4 h a 37 °C.
9. Adicione 1 μL de DNase e incubar um adicional de 15 min a 37 °C.
   1. Limpe sgRNA adicionando 1 μL de glicogênio, 30 μL de H₂O livre de nuclease, 30 μL de 5 M acetato de amônio e 180 μL de 100% EtOH para sgRNA transcrita. Misture bem e incubar pelo menos 20 min a -80 °C (até congelado) ou a -20 °C durante a noite. Centrífuga a 4 °C por 15 min em velocidade máxima.
10. Retire e descarte supernatant sem perturbar a pelota, e lave com 1 mL de RNase-livre 70% EtOH refrigerados a -20 °C. Gire um adicional de 5 min na velocidade máxima a 4 °C.
11. Retire e descarte o supernatant sem perturbar a pelota, e seque o pelota por 5 min.
12. Resuspenda em 30 μL de H₂O livre de nuclease e determine pureza e rendimento usando espectroscopia UV (rendimento mínimo de 200 ng/μL).
13. Verifique a presença de sgRNA em um gel sem RNase. O sgRNA aparece entre 50 e 150 bp como duas bandas devido à estrutura secundária(Figura 1B).
14. Aliquot em 3 μL e armazenar a -80 °C.

3. Validar a eficiência de corte in vitro

1. Extraia DNA genômico das espécies-alvo usando um kit comercial de extração de DNA. Recortes de barbatanas ventrais podem ser usados sem ter que sacrificar os peixes, porque os tecidos são regenerados.
2. Amplifique a região de DNA alvo usando as cartilhas projetadas conforme descrito nas etapas 1.6 e 1.7 usando PCR padrão. Verifique o produto por eletroforese gel. Sequenciar o fragmento para garantir que a região adequada está sendo amplificada é sugerido, mas não necessário. Os resultados representativos do modelo scn4aa são mostrados na Figura 2.
3. Limpe o fragmento pcr com um laboratório estabelecido ou protocolo da empresa.
4. Guarde o DNA amplificado a -20 °C. Considere separá-lo em alíquotas para reduzir os ciclos de congelamento-degelo.
5. Determine os valores e volumes necessários de cada componente. Considere a execução de controles negativos (excluindo sgRNA ou Cas9) e um controle positivo (um sgRNA previamente testado que cede seu DNA amplificado pcr alvo) se disponível, bem como uma série de concentração do sgRNA.
6. Configure a mistura de reação abaixo na ordem especificada em um tubo PCR à temperatura ambiente, adicionando a proteína sgRNA e Cas9 por último para obter melhores resultados: 50-100 ng do produto PCR de DNA alvo, 1 μL de 10x buffer 3, 1 μL de 10x BSA (0,1 g/mL) , 50-200 ng de proteína Cas9 (1 mg/mL, 150 ng sugerido), e 30-200 de ng sgRNA (100 ng sugerido).
   1. Incubar a reação em 37 °C para 1 h e, em seguida, em 65 °C por 10 min para inativar a proteína Cas9.
   2. Executar toda a amostra em um gel agarose 2%-3% (tamanhos esperados banda entre 30-200 bp), juntamente com controles positivos e negativos. Clivagem bem sucedida pode mostrar alguns dos produtos PCR, mas também terá duas bandas menores. Os resultados representativos são mostrados na Figura 2.

4. Obtenção de embriões

Nota: A obtenção de embriões de peixes fracamente elétricos pode ser um desafio. Monitoramento cuidadoso da qualidade da água, tempo adequado para cuidados com os peixes e alimentação regular são fundamentais para um programa de reprodução bem-sucedido. Os peixes devem primeiramente ser condicionados por diversas semanas para a reprodução⁵² como descrito na etapa 4.1 do protocolo. Em seguir, um protocolo que aumenta a gametogênese natural (4,2) para uso no comportamento natural de desova (4,3), uma alternativa recentemente desenvolvida técnica in vitro para a obtenção de embriões precisamente cronometrados (4,4) são apresentados. Protocolo 4.3 é igualmente eficaz para B. brachyistius e B. gauderio, e protocolo 4.4 é superior em B. gauderio.

1. Condicionado
   1. Mantenha B. brachyistius em casais/pequenos grupos (tanques L 100-150) ou em tanques muito grandes (2 machos e 5-6 fêmeas em aproximadamente 475 L tanque), como eles se tornam muito agressivos em condições de reprodução. Deve haver pelo menos 1-2 tubos de PVC por peixe para ser usado como abrigo (Figura 3A,B).
   2. B. gauderio pode ser criado em densidade muito maior. Mantenha até oito indivíduos em um tanque 100 L (2 machos e 6 fêmeas). Deve haver pelo menos 1 tubo de PVC por peixe para ser usado como abrigo. Adicionar fios emaranhados aumenta o enriquecimento e esconderijos. Adicione 50 tubos de centrífuga mL com buracos de 1 cm de diâmetro perfurados neles até o topo do tanque para permitir que os adultos desovam naturalmente nos tubos(Figura 3C).
   3. Durante a época de reprodução, alimentar peixes diariamente blackworms frescos complementados com vermes congelados. Os alimentos podem ser enriquecidos com vitaminas e suplementos, se desejar.
   4. Peixes domésticos normalmente em uma condutividade relativamente alta (300-600 μS), pH solução equilibrada. Durante a época de reprodução, diminuir gradualmente a condutividade em pelo menos metade ao longo de 1-3 semanas para induzir recrudescência gonad e desova. Menor condutividade por adições diárias de água reversa de osmose (RO), mantendo muita atenção ao pH quando a condutividade é baixa (pH <6).
   5. As condições de reprodução podem ser mantidas por cerca de 3 a 5 meses, com a produção de ovos diminuindo ao longo do tempo. Após este tempo, devolver peixes à alta condutividade lentamente ao longo de 1-3 semanas. Mantenha mais 3 meses em alta condutividade antes de ser exposto a condições de reprodução novamente.
2. Use injeções de agente de desova (SGnRHa + Domperidona).
   1. Identificar peixes fêmeas em condições de reprodução que aparecem gravid(Figura 4). Em B. gauderio a fêmea terá gonads inchadoapenas caudal para o respiradouro. B. brachyistius fêmeas terão barrigas inchadas e aparecem profundamente corpo(Figura 4A). Os machos geralmente não têm uma edição que produz o esperma. Entretanto, os machos maiores são preferidos devido ao volume maior do esperma coletado.
      Nota: O agente de desova é uma mistura comercial da hormona que facilite a maturação dos gametas e coordene a desova. Se o peixe foi injetado com agente de desova no passado, permitir >4 semanas de descanso e ampla alimentação entre as injeções. Sugerimos injetar pelo menos 2 machos e 4-5 fêmeas para garantir algumas embreagens de ovos e muito esperma.
   2. Peixe anestesa em MS-222 (0,4 g/3 L) por alguns minutos, até que o peixe não seja capaz de manter sua postura, é imóvel, mas continua a ter movimento opercular (Estágio II^53).
   3. Pese o peixe (g) para calcular a quantidade de agente de desova, (0,5 μL/ g) + 0,5 μL. O extra de 0,5 μL é responsável por erros de pipetting.
   4. Adicione o agente de desova aos volumes de 4x de buffer (1x PBS ou DPBS) em um tubo PCR e misture bem. A solução ficará nublada. Ele ajuda a dispensar o agente de desova em termoplástico e, em seguida, usar uma pipeta para medir a dose calculada. O agente de desova é viscoso, por isso não se esqueça de dispensar toda a dose e ter cuidado com pipetting.
   5. Pipeta a solução de injeção em termoplástico e desenhar em uma seringa de vidro de precisão, evitando bolhas de ar. Recomendamos uma agulha de 28 G, 19-25 mm de comprimento, com um bisma.
   6. Injete a solução no músculo dorsal do tronco em uma taxa lisa. Deixe a agulha sentar-se por 2-4 s e, em seguida, retire. Imediatamente coloque os peixes na água do sistema fresco para a recuperação.
   7. Após aproximadamente 24 h prepare-se para a coleta de embriões (ver 4,3 ou 4,4). Reúna todos os materiais necessários, incluindo o que é necessário para a microinjeção de célulaúnica (ver seção 5).
3. Obter embriões através da desova natural.
   1. Casa de sovanagem agente injetado adultos (4,2) em um grande 450 L tanques. As proporções sexuais mais eficazes têm sido tipicamente 1-2 machos e 3-4 fêmeas com esconderijos adequados feitos de tubos de PVC e substrato de mármore escuro no fundo do tanque para evitar o consumo de ovos. Os mármores são tipicamente mais importantes para B. brachyistius do que B. gauderio,que preferem depositar seus ovos pegajosos nas fendas ou nos tubos de centrífuga de 50 mL como descrito acima.
   2. Coloque os peixes em um ciclo de luz reversa para combinar de desova noturna com o horário regular de trabalho em laboratório. Usando um sistema de segurança de grau de consumo pronto para uso, monitore os peixes usando iluminação infravermelha para minimizar a perturbação de um PC(Figura 3)conectado remotamente.
   3. O peixe vai espantariamente desovar durante o fotoperíodo escuro aproximadamente 24 h após a injeção de agente de desova.
   4. Quando a desova começa, coletar ovos por hora, enquanto o comportamento de desova ocorre. Em B. brachyistius, coletar ovos usando um sifão de pequeno diâmetro sobre uma rede de malha de algodão fino para minimizar os danos aos ovos recém-gerados. Coletar ovos B. gauderio de tubos de centrífuga de 50 mL ou substrato do tanque. Trabalhe eficientemente com o mínimo de perturbação para desova de peixes usando uma lâmpada de cabeça com uma luz vermelha de baixa intensidade. Como a primeira clivagem ocorre aproximadamente 1 h após a fertilização (HPF), uma grande porção de ovos será adequada para microinjeção de célulaúnica.
   5. Proceda imediatamente à microinjeção (ver seção 5).
4. Esprema os machos para fertilização in vitro de B. gauderio.
   1. Prepare a solução de extensor de espermatozóides (SES), conforme descrito no The Zebrafish Book^54:10 mM HEPES, 80 mM KCl, 45 mM NaCl, acetato de sódio de 45 mM, 0,4 mM CaCl₂e 0,2 mM MgCl₂.
      1. Use ddH₂O para trazer ao volume e ajustar o pH a 7.7 com 1 M NaOH.
      2. Guarde na geladeira.
      3. Filtrar através de um filtro de 0,22 μm antes de usar.
   2. Peixe anestesa em MS-222 (0,4 g/3 L) por alguns minutos, até que o peixe não seja capaz de manter sua postura, é imóvel, mas continua a ter movimento opercular (Estágio II^53). Coloque 500 μL alíquotas de SES em gelo.
   3. Mãos secas e peixes completamente, especialmente em torno da cabeça e ventilação. Coloque o lado ventral para cima, anterior à esquerda (para indivíduos destros) em uma espuma de poliestireno / suporte de esponja coberto com um MS-222 encharcado, toalha de papel úmido. A cabeça deve ser tão paralela com a tabela como possível.
      Nota: Passos 4.4.4-4.4.6 deve ser feito o mais rapidamente possível, e os peixes só devem estar fora de água para 30-60 s.
   4. Aplique pressão na direção caudal para rostral com luz espremendo medialmente sobre as gônadas em direção ao respiradouro. Os peixes podem expelir resíduos. Tenha cuidado para limpar o respiradouro com uma limpeza tarefa delicada se algum desperdício é expulso. Não coletar resíduos com esperma. Dependendo do tamanho do macho, 10-60 μL é comum.
   5. Usando um micropipetter com uma ponta, coletar cuidadosamente o esperma, uma vez que é espremido do macho em incrementos de 50 μL. Coloque o esperma diretamente em 500 μL alíquotas de SES no gelo. Pode ser útil ter um outro investigador ajuda em coletar o esperma quando os outros apertos. O esperma deve ser usado o mais cedo possível, mas permanece viável para pelo menos 1 h.
   6. Imediatamente após a coleta, coloque os peixes na água do sistema fresco para a recuperação. O peixe só deve ficar fora de água por 30-60 s.
5. Esprema as fêmeas para fertilização in vitro de B. gauderio.
   1. Peixe anestesa em MS-222 (0,4 g/3 L) por alguns minutos, até que o peixe não seja capaz de manter sua postura, é imóvel, mas continua a ter movimento opercular (Estágio II^53). Coloque a folha de politetrafluoroethene na estação de trabalho.
      Nota: Seções 4.5.1-4.5.5 deve ser feito o mais rapidamente possível e os peixes só deve estar fora de água para 30-60 s.
   2. Mãos secas, ferramentas, folha de politetrafluoroethene, e peixes completamente, especialmente ao redor da cabeça e ventilação. Coloque do lado com a cabeça voltada para o anterior (para indivíduos destros).
   3. Aplique pressão na direção caudal para rostral com luz espremendo medialmente sobre as gônadas em direção ao respiradouro. Os peixes podem expelir resíduos. Tenha cuidado para limpar o respiradouro com uma limpeza tarefa delicada se algum desperdício é expulso. Dependendo do tamanho do peixe, 20-150 ovos é comum. Usando uma espátula/ferramenta revestida de politetrafluoroethene coleta cuidadosamente ovos à medida que são espremidos da cloaca. Mova rapidamente os ovos para uma pequena placa de Petri e cubra. Certifique-se de que os ovos permaneçam secos durante este processo. Alternativamente, depois de apertar, tocar a massa de ovos para a base de uma pequena placa de Petri ou para a folha de politetrafluoroethene como eles são expulsos da fêmea.
   4. Imediatamente após a coleta, coloque o peixe na água do sistema fresco para a recuperação.
6. Realizar fertilização de ovos para fertilização in vitro de B. gauderio.
   1. Adicione 100 μL de esperma toque bem misturado na SES (ver passo 4.4) diretamente sobre a massa do óvulo.
   2. Adicione 1 mL de água do sistema (filtrada através de um filtro de 0,22 μm) e misture bem para 30-60 s.
   3. Adicione uma água adicional do sistema de 1-2 mL (deixe algum espaço na placa de Petri) e coloque na incubadora. Tempo recorde de fertilização in vitro na placa de Petri e passar para uma incubadora de 29 ° C. Defina um tempora de 50 minutos para verificar o progresso do desenvolvimento (por exemplo, a formação da célula única no pólo animal, ver Figura 6). Durante este tempo, preparar materiais para microinjeção.

5. Microinjeção de célulaúnica

1. Puxe agulhas de microinjeção antes das injeções de agente de desova (passo 4.2) ou desova natural (passo 4.3). Use um capilar de vidro borosilicato com filamento (O.D. 1.0 mm, I.D. 0.58 mm, 10 cm de comprimento) e um puxador de agulhas para puxar agulhas de microinjeção. Prepare 2-4 agulhas por injeção de tratamento planejada.
   Nota: As agulhas de backloading com um filamento são preferidas, porque o filamento pavio a solução para a ponta e elimina bolhas. No entanto, agulhas sem filamento podem ser usadas e frontloading não deve ter efeito sobre o resultado. A agulha deve ter um taper longo, mas resistente. Use o programa de puxar agulha com as seguintes especificações como ponto de partida: calor = 500; Puxe = 70; Velocidade = 70; e Tempo = 100. Morfologias representativas da agulha são mostradas na Figura 5A.
2. Prepare a solução de injeção e prepare a agulha.
   1. Adicione 0,9 μL de sgRNA e 0,9 μL de enzima Cas9 (1 mg/mL) a 0,2 μL de 10% ou 100% de fenol vermelho (por 1% e 10% de concentração vermelha fenol final, respectivamente) em tubo PCR. Misture bem e deixe descansar no gelo 2-5 min para permitir que sgRNA e Cas9 complexo. Calcule a concentração final de sgRNA, Cas9 e fenol vermelho na solução de injeção.
      Nota: Se houver problemas com entupimento de agulhas ou eficiência de corte usando a receita acima, pode ser útil usar uma mistura de sal/tampão de concentração final de 1x para estabilizar cas9 e evitar entupimento de agulhas.
   2. Use uma ponta de pipeta microcarregater para suportar o 2 μL de solução na agulha de microinjeção. Expela o líquido o mais próximo possível da ponta.
   3. Carregue agulha em micromanipulador e ajuste ajustes da pressão (comece com 775 p_i,0.1-0.2 s, e 8-12 p_c).
   4. o escopo, use um par de fórceps finos para quebrar a ponta da agulha em um ângulo de beveled. Quebrar para onde o taper da agulha começa a ter rigidez. É melhor quebrar mais perto da ponta, testar o tamanho da solução de injeção e, em seguida, quebrar ainda mais, se necessário. O furo da agulha deve permanecer tão pequeno quanto possível, mantendo um taper rígido (Figura 5A).
   5. Use óleo mineral e um micrômetro para medir o tamanho da solução de injeção. 1-2 nL é normalmente usado; 0,1 mm de diâmetro é de 0,5 nL.
   6. Ajuste as configurações de ponta ou pressão da agulha para obter um volume de injeção dentro das especificações.
3. Identificar o desenvolvimento de zigotos e preparar o estágio de injeção. Monte a fase de injeção. Pegue uma placa de Petri de 100 mm de diâmetro. Inverter o fundo e coloque a parte superior invertida. Coloque um microscópio de vidro deslizar dentro da parte superior invertida. Dependendo de como seu micromanipulador é montado ao espaço, a altura adicionada da base invertida pode ser desnecessária.
   1. Olhe para os ovos em desenvolvimento e identificar palgotos fertilizados presumido 50-60 min após a fertilização in vitro. O pólo animal começará a se formar e haverá um excesso de pequenas gotículas de gordura em torno da interface gema / célula animal (Figura 6).
   2. Colete 10-20 ovos com o mínimo de água possível usando uma pipeta de transferência de plástico (corte a ponta ligeiramente para permitir que os ovos passem) e coloque na borda do slide. A água será perversa o slide e puxar áureos contra a borda.
   3. Use uma limpeza delicada da tarefa e pressione delicadamente a corrediça para remover a água adicional e permita que os ovos aderem firmemente à borda da corrediça. Deve haver apenas bastante água para manter os ovos húmidos ao manter pouca umidade ereta para evitar o movimento do ovo durante a injeção.
4. Injete diretamente em uma única célula.
   1. Alinhar os ovos contra o slide verticalmente, perpendicular à agulha se aproximando(Figura 5B).
   2. Usando o micromanipulador, posicione a agulha contra o chorion. Em aproximadamente um ângulo de 45°, insira a agulha no chorion, e então na única pilha. Pode ser útil para entrar na única célula através da gema. Mover tanto a fase de injeção com a mão livre quanto o micromanipulador pode fornecer mais controle sobre o processo de injeção(Figura 5B).
   3. Injete sgRNA/Cas9/phenol solução vermelha na única célula. Retire cuidadosamente a agulha. Siga para o próximo ovo e repita os passos 5.4.1-5.4.3 até que todos os ovos sejam injetados.
   4. Retire todos os ovos quebrados durante a injeção com fórceps finos. Use 0,22 μm de água do sistema filtrado em uma garrafa de esguicho para remover suavemente os ovos da fase de injeção em uma nova placa de Petri de 100 mm de diâmetro.
   5. Repita os passos 5.3.3-5.4.6 até que todos os ovos tenham sido injetados ou tenham se desenvolvido para o estágio de duas células. Certifique-se de reservar cerca de 20 ovos fertilizados presumidos como um controle de não-injeção para determinar as taxas de fertilização e sucesso da injeção. Para embreagens maiores, use embriões não injetados que se desenvolveram até o estágio de duas células, e para embreagens menores reservem supostos ovos fertilizados.
   6. Além disso, considere um controle de sgRNA/injeção injetando 15-25 embriões com Cas9 complexocom um sgRNA contra um gene que não está presente no genoma. O gene GFP recomendado para embriões do tipo selvagem. Registre o número de ovos, pais, tempo de fertilização in vitro, e data em cada placa de Petri. Inclua o alvo ou o rótulo sgRNA como não injetado. Mova-se para uma incubadora de 29 °C.

6. Pecuária

1. Cuide dos ovos.
   1. Verifique a viabilidade do ovo 4-6 h após injeções.
   2. Registre o número de ovos mortos, bem como qualquer um que não são fertilizados. Os ovos não fertilizados vão prender em torno do estágio de oito células e ter um padrão de roseta das células no pólo animal(Figura 6). Dependendo do número de ovos mortos e da quantidade de detritos de ovos na água, retire pelo menos 50%-80% da água e substitua por água filtrada do sistema. Pode ser útil para esfregar o fundo da placa de Petri se um filme de detritos celulares ou formas de biofilme.
   3. Para os próximos 2-3 dias, verifique os ovos 1-2x diariamente. Repita os passos 6.1.2-6.1.3 cada vez que os ovos são verificados.
   4. Após 2 a 3 dias, as larvas eclodirão. Retire todas as cápsulas de ovos enquanto eclodem. Pipetting suave pode ajudar a libertar larvas semi-eclodidas.
2. Cuidar de larvas.
   1. Verifique os ovos 1-2x diariamente. Repita os passos 6.1.2-6.1.3 cada vez que as larvas são verificadas.
   2. De 6-14 DPF, alimentar enguias vinagre para as larvas. Um ligeiro excesso de comida é bom, porque as enguias vinagre permanecerá vivo no prato. Adicione as enguias vinagre cada vez que o prato é verificado e limpo.
   3. De 11-14 DPF, adicione 5-10 artemia recém-nascido por larvas, além de enguias vinagre. Durante este tempo as larvas aprenderão comer a natação livre Artemia.
   4. Em 15 DPF, mova larvas aos copos do ovo (veja a seção 6.2.5) em um tanque com água de fluxo, filtração, e aeração. Não deve haver mais de aproximadamente 25 embriões por copo. Os copos do ovo são copos plásticos com uma rede da malha na parte inferior. Uma placa de Petri de 100 mm superior /inferior pode ser adicionado ao fundo do copo de ovo para ajudar a parar os alimentos de cair através da malha. Os copos do ovo permitem que os peixes sejam abrigados em um volume maior de água para razões da qualidade da água, ao manter grupos discretos. Continue a adicionar tanto enguias de vinagre quanto artemia recém-eclodido por larvas dos dias 15-18. Clean Petri prato peça diariamente e usar uma pipeta para remover massas de Artemiamortos .
   5. Dos dias 18-30, alimentar apenas artemiarecém-chocado . Aumentar a quantidade de alimentação como o peixe crescer e se a cauda mordendo é visto.
   6. Após aproximadamente 30 dias, mova peixes para tanques de 10 L (2,5 galões), aproximadamente 25 indivíduos por tanque. Certifique-se de que há filtração, adoração e lugares para se esconder. Considere a mídia de biofiltração cilíndrica e tubos de PVC de pequeno diâmetro.
   7. Alimentar Artemia recém-chocado e blackworms de aproximadamente 30-45 dias em diante. Manter a limpeza padrão e as mudanças de água para o tanque (ou seja, no mínimo ~ 10%-20% de mudança de água por 1 semana).
   8. Depois de ~ 45 DPF, alimentar apenas blackworms até ~ 60 DPF.
   9. Depois de ~ 60 DPF, mover coortes de aproximadamente 15 peixes para 40 L (10 galões) tanques e iniciar procedimentos de criação de adultos. Adicione tubos de PVC e um fio "esfregão" (uma massa de fios marrons amarrados em torno de uma rolha) para esconderijos(Figura 3C). Os peixes devem estar se aproximando do tamanho da reprodução (10 a 12 cm) após aproximadamente 3 a 4 meses após a fertilização.

7. Criação adulta

1. Alimente os peixes diariamente com vermes negros suficientes para que uma pequena quantidade de vermes negros estejam presentes na próxima alimentação. Esta alimentação do libitum do anúncio permite o crescimento máximo.
2. Algumas vezes por semana, pode ser útil para complementar a alimentação blackworm com vermes.
3. Tanques limpos a cada 2-4 semanas com uma mudança de água de 20% a 30%. Se o esfregão de fios ficar cheio de biofilme / algas, esfregue-o limpo a água RO.

Os locais-alvo sgRNA foram identificados dentro do exon 1 de scn4aa em B. gauderio e B. brachyistius como descrito na Seção 1. Os sgRNAs foram gerados conforme descrito na Seção 2. Após a seleção e síntese bem sucedida sgRNA (Figura 1), clivagem in vitro foi testado(Figura 2). Os sgRNAs que demonstram o corte in vitro foram selecionados então para microinjections da única pilha.

Os peixes adultos foram condicionados para reprodução (Seção 4.1), injetados então com um agente spawning (seção 4.2) e espremido subseqüentemente(B. gauderio)para IVF como descrito na seção 4.4 ou permitido spawn naturalmente (B. brachyistius)como descrito na Seção 4.3. Estes esforços produziram embriões unicelulares para microinjeção em ambas as espécies. Conforme descrito na Seção 5, 1,5-2,0 nL do complexo vermelho scn4aa sgRNA/Cas9/phenol (65-190 ng/uL sgRNA, 450 ng/uL Cas9, 1%−10% fenol vermelho, concentrações finais) foi injetado no estágio de uma célula. Ovos da mesma embreagem foram usados como controles não injetados. Todos os embriões foram atendidos conforme descrito na Seção 6. Após a FIV, 40%-90% dos ovos foram fertilizados, e 70%-90% dos embriões sobreviveram à incubação após a injeção.

Cerca de 75% dos peixes sobreviveram a 6-11 DPF e, em seguida, foram fenotipados. Peixelarval foram colocados em uma placa de Petri de 35 mm embutida em um prato maior com Sylgard imobilizado Eletrodos de gravação Ag / Cl (Figura 7A). O movimento embrionário foi restrito por meio de 3% de moldes de agarose feitos com água do sistema e cortados para caber o embrião(Figura 7B). A mesma câmara de gravação foi utilizada para ambas as espécies e o mesmo molde de agarose foi usado entre comparações de espécies. Os embriões foram registrados para 60 s, o que é suficiente para capturar centenas de EODs. Os controles não injetados de idade e tamanho combinados foram selecionados para comparação. Neste momento, 10%-30% dos embriões sobreviventes mostram uma amplitude reduzida EOD. Embriões que apresentam uma redução na amplitude do EOD sem defeitos morfológicos óbvios e embriões inteiros de controle não injetados foram digeridos para extração de DNA e PCR subseqüente do local alvo scn4aa. Havia muitas vezes uma gama de penetração do fenótipo, com alguns indivíduos tendo uma redução mais forte na amplitude de EOD do que outros.

Após a limpeza e clonagem do PCR, mais de 30 clones de cada embrião foram selecionados para sequenciamento de Sanger. Mutações induzidas por CRISPR/Cas9 foram identificadas em B. gauderio (Figura 8A,B) e B. brachyistius (Figura 9A,B)indivíduos com forte redução da amplitude do EOD (Figura 8C e Figura 9C , respectivamente), onde os controles não injetados tinham apenas genótipos de referência. A visualização da amplitude do EOD entre mutantes confirmados ("CRISPR") e controles não injetados de idade/tamanho demonstrou que tanto o mutante scn4aa B. brachyistius (Figura 10A)e B. gauderio (Figura 10B ) os embriões tiveram amplitude de EOD significativamente menor do que os controles (p < 2,2 x 10-16,Welch t-test de duas amostras). Crispr/Cas9 segmentação de scn4aa foi bem sucedida em ambos B. brachyistius e B. gauderio e implicam scn4aa na descarga de eletrocitolarva/ precoce em ambas as espécies.

Figura 1: síntese e transcrição do modelo sgRNA. (A)Imagem gel de síntese modelo sgRNA. Os rótulos correspondem a diferentes sgRNAs para miod (MYO2, MYO1) e três sgRNAs para scn4aa (S1-S3). Depois de annealing os oligomeros, um modelo de ~ 120 bp é produzido. (B) Imagem de gel de transcrição sgRNA para três sgRNAs para B. gauderio (bg2017) e dois para B. brachyistius (bb2016, 2017). O sgRNA aparecerá como duas bandas devido à estrutura secundária e ficará entre 50 e 150 bp ao usar uma escada dsDNA. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 2: Imagem representativa do gel de sucesso (sg1) e mal sucedido (sg2) in vitro CRISPR ensaios. Uma quantidade equivalente de modelo sem componentes CRISPR é mostrada na pista scn4aa. Observe as bandas duplicadas em sg1 que mostram que o corte ocorreu. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 3: Configurações de tanques de reprodução para peixes fracos elétricos. (A)Esquemático da configuração típica para monitoramento de vídeo sem fio do comportamento de desova. Três câmeras cctv comercialmente disponíveis (Swann, Inc.) capazes de produzir luz infravermelha são destinadas ao topo da água e conectadas a um gravador de vídeo digital (DVR). O vídeo é monitorado em tempo real para o comportamento de desova em uma sala adjacente a partir de um computador conectado à rede (PC). (B) Comportamento de desova capturado com tal configuração em B. brachyistius. (C)Uma configuração típica de reprodução para B. gauderio com tubos de pVC escondendo e esfregões de fios. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 4: Criação de machos e fêmeas. (A) B. brachyistius e (B) B. gauderio. Ambas as espécies são sexualmente dimórficas e facilmente distinguidas visualmente quando sexualmente maduras. Ambas as fêmeas são gravidas nestas fotos, exibindo barrigas caracteristicamente inchadas que estão cheias de ovos maduros. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 5: Microinjeção. (A)As pontas capilar de vidro da agulha devem ser quebradas para entregar um volume apropriado da microinjeção. A ponta da esquerda está ininterrupta. As pontas média e direita são quebradas com um bisumo ligeiramente angular para perfurar o chorion do ovo. (B) Os ovos são forrados contra um slide de vidro (1%-10% fenol vermelho é incluído como um traçador para visualizar a entrega da injeção) e injetado com agulhas capilares de vidro. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 6: Estágios de desenvolvimento. (A) B. gauderio e (B) B. brachyistius. Todos os ovos são assumidos fertilizados e o desenvolvimento é monitorado até 24 HPF. Entre 12-24 embriões de FPH são visíveis em ovos viáveis, caso contrário, os ovos apresentam degradação. Várias divisões parecem ocorrer na ativação do ovo, independentemente da fertilização. Ovos não fertilizados apresentam padrões incomuns de clivagem que são muito mais simétricos em ovos fertilizados. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 7: Fotografia da câmara de gravação larval usada neste estudo. (A) Os eletrodos estão embutidos dentro sylguard mas estender para o prato de 35 milímetros contendo um embrião restrito através de um molde de agarose 3%. (B) Imagem de ampliação mais elevada destacando o movimento restrito do embrião devido à agarose. Observe os pedaços de agarose que podem ser removidos à medida que o embrião muda de tamanho. B. embrião gauderio está enfrentando o eletrodo positivo. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 8: Mutações induzidas por CRISPR/Cas9 em B. gauderio. (A) Trinta e duas sequências de clones de DNA genômico de mutações induzidas por Cas9 em uma única scn4aa alvejou o embrião f0B. gauderio (11 DPF). A sequência de referência é sublinhada com o local alvo sgRNA destacado em cinza, o motivo protospacer-adjacente (PAM) seqüência destacada em vermelho, eo site de corte Cas9 marcado com "|". A mudança da sequência do tipo selvagem esperada é dada e o número de clones para cada sequência é dado entre parênteses. (Abreviaturas: + = inserção, - = exclusão, ± = indel) Qualquer sequência não associada crispr dessemelhanças são ousadas. Figura modelada após Jao et al.60. (B) Amino acid seqüência prevista a partir de clones seqüeciados de scn4aa knockdown B. gauderio de (A). As mudanças induzidas por Cas9 da sequência do tipo selvagem são destacadas em vermelho e o número de alteração induzida por nucleotídeos é dado. (C)Vinte segundos de gravações elétricas de cinco larvas combinadas de tamanho, todas gravadas 6 DPF na mesma câmara de gravação. As configurações de ganho são idênticas para todos os vestígios. Traços em vermelho são de larvas de B. gauderio com mutações confirmadas (um indivíduo mostrado na Figura 8A, B acima), traços em preto são de larvas não injetadas de B. gauderio. No geral, crispr/cas9 edição de scn4aa mostrou uma redução na amplitude eod, embora o efeito foi heterogêneo. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 9: Mutações induzidas por CRISPR/Cas9 em B. brachyistius. (A) Quarenta e duas sequências de clones de DNA genômico de mutações induzidas por Cas9 em um único scn4aa alvejado EmbriãoBraquiistius F0B (11 DPF). A sequência de referência é sublinhada com o local alvo sgRNA destacado em cinza, o motivo protospacer-adjacente (PAM) seqüência destacada em vermelho, eo site de corte Cas9 marcado com "|". A mudança da sequência do tipo selvagem esperada é dada e o número de clones para cada sequência é dado entre parênteses. (Abreviaturas: + = inserção, - = exclusão, ± = indel) Qualquer sequência não associada crispr dessemelhanças são ousadas. Figura modelada após Jao et al.60. (B) Amino acid seqüência prevista a partir de clones seqüenciados de scn4aa knockdown B. brachyistius em (A). As mudanças induzidas por Cas9 da sequência do tipo selvagem são destacadas em vermelho e o número de alteração induzida pelo nucleotídeo é dado. (C)Dez segundos gravações elétricas de quatro larvas combinadas de tamanho, todas registradas 10 DPF na mesma câmara de gravação. As configurações de ganho são idênticas para todos os vestígios. Traços em vermelho são de larvas de B. braquiistius com mutações confirmadas (um indivíduo mostrado em A, B acima), traços em preto são de larvas não injetadas de B. brachyistius. No geral, crispr/cas9 edição de scn4aa mostrou uma redução na amplitude eod, embora o efeito foi heterogêneo. EODs invertidos são da orientação de mudança de peixe durante a gravação. Nenhuma diferença é discernível entre peixes experimentais e controles, apesar disso. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 10: Parcelas de caixa de amplitude média de EOD de CRISPR e tamanho/idade não injetados correspondidos aos irmãos. (A)Amplitude de EOD de larvas de B. brachyistius em 10 DPF. Gravado com um ganho de 100, CRISPR n = 56 EODs de dois indivíduos, n não injetados = 114 EODs de três indivíduos. (B) Amplitude de EOD de larvas de B. gauderio em 6 DPF. Gravado com um ganho de 500, CRISPR n = 34 EODs de dois indivíduos, n não injetados = 148 EODs de três indivíduos. Amplitude de peixeCRISPR foi significativamente menor do que os controles não injetados (p < 2,2 x 10-16, Welch t-teste de duas amostras). Todos os indivíduos foram gravados com a câmara de gravação descrita na Figura 7. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Tabela 1: Oligonucleotídeos necessários para o protocolo.

Os autores não têm nada a divulgar.