Artigo de método

Preparação da superfície coclear no mouse adulto

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DOI:

10.3791/60299

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6 de novembro de 2019

 ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 2MOE Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Institute of Life Sciences, Southeast University

Neste artigo

Resumo

Este artigo apresenta um método de preparação da superfície coclear modificado que requer decaltificação e uso de um adesivo de células e tecidos para aderir aos pedaços de epélia coclear a 10 mm de cobertura redonda para imunohistoquímica em córquia de camundongo adulto.

Resumo

O processamento auditivo na cóconlea depende da integridade das células ciliadas mecanosensorias. Ao longo da vida, a perda auditiva pode ser adquirida a partir de inúmeras etiologias, como exposição ao ruído excessivo, o uso de medicamentos ototóxicos, infecções bacterianas ou virais no ouvido, lesões na cabeça e o processo de envelhecimento. A perda de células ciliadas sensoriais é uma característica patológica comum das variedades de perda auditiva adquirida. Além disso, a sinapse da célula ciliada interna pode ser danificada por insultos leves. Portanto, as preparações superficiais da epitélia coclear, em combinação com técnicas de imunorotulagem e imagens confocais, são uma ferramenta muito útil para a investigação de patologias cocleares, incluindo perdas de sinapses de fita e células ciliadas sensoriais, alterações nos níveis de proteína nas células ciliadas e células de apoio, regeneração de células ciliadas e determinação da expressão gênica do relatório (ou seja, GFP) para verificação de transdução e identificação bem-sucedidas de tipos de células transinduzidas. A cócrolea, uma estrutura óssea em forma de espiral no ouvido interno, contém o órgão auditivo da extremidade sensorial, o órgão de Corti (OC). Células ciliadas sensoriais e células de apoio circundantes no OC estão contidas no duto coclear e descansam na membrana basilar, organizada de forma tonotópica com detecção de alta frequência ocorrendo na base e baixa frequência no ápice. Com a disponibilidade de informações moleculares e genéticas e a capacidade de manipular genes por nocaute e técnicas de knock-in, os ratos têm sido amplamente utilizados em pesquisas biológicas, inclusive na ciência auditiva. No entanto, a cócroes de camundongo adulto é minúscula, e o epitélio coclear é encapsulado em um labirinto ósseo, dificultando a microdissecção. Embora as técnicas da dissecação foram desenvolvidas e usadas em muitos laboratórios, este método modificado da microdissecção usando o adesivo da pilha e do tecido é mais fácil e mais conveniente. Ele pode ser usado em todos os tipos de cócroes de camundongoadulto após a decalcificação.

Introdução

A cóconlea é dedicada à detecção de som e responsável pela audição. O duto coclear é enrolado em forma espiral no labirinto ósseo e contém o órgão auditivo da extremidade sensorial, o órgão de Corti (OC). O OC repousa sobre a membrana basilar, tornando-se o epitélio coclear, com um comprimento de cerca de 5,7 mm quando desenrolado em adultos CBA / CaJ ratos1,2. Como o OC é organizado tonotópicamente com altas frequências detectadas na base e baixas frequências no ápice, o epitélio coclear é muitas vezes dividido em três partes para comparações analíticas: as voltas apical, média e basal correspondentes a baixa, detecção média e de alta frequência, respectivamente. Além de uma variedade de células de apoio, o OC é composto por uma fileira de células ciliadas internas (IHCs) localizadas medialmente e três fileiras de células ciliadas externas (OHCs) localizadas lateralmente no que diz respeito à espiral coclear.

O processamento auditivo correto depende da integridade das células ciliadas sensoriais na cóconlea. Danos ou perda de células ciliais sensoriais é uma característica patológica comum da perda auditiva adquirida, causada por inúmeras etiologias, como exposição ao ruído excessivo, o uso de medicamentos ototóxicos, infecções bacterianas ou virais no ouvido, lesões na cabeça e o envelhecimento processo3. Além disso, a integridade e função da célula ciliada interna / sinapses nervosas auditivas podem ser prejudicadas por insultos leves4. Com a disponibilidade de informações moleculares e genéticas e manipulação de genes por nocaute e técnicas de knock-in, os ratos têm sido amplamente utilizados na ciência auditiva. Embora a cócrolea de camundongo adulto seja minúscula e o epitélio coclear seja cercado por uma cápsula óssea, resultando em microdisseses tecnicamente difíceis, preparações superficiais do epitélio em combinação com imunorotulagem ou imunohistoquímica e imagens confocais têm sido amplamente utilizadas para investigação de patologias cocleares, incluindo perdas de sinapses de fita e células ciliadas, alterações nos níveis de proteínas nas células ciliadas sensoriais e células de apoio, e regeneração de células ciliadas. As preparações da superfície coclear também têm sido usadas para determinar o padrão de expressão de genes de repórter (ou seja, GFP) e confirmar a transdução bem-sucedida e identificar tipos de células transinduzidas. Essas técnicas têm sido usadas anteriormente para o estudo de mecanismos moleculares subjacentes à perda auditiva induzida pelo ruído usando camundongos ADULTOS CBA/J5,6,7,8,9.

Ao contrário da imunohistoquímica usando seções de parafina ou criosecção para obter pequenas porções transversais da córcia que contêm três células ciliadas externas (OHCs) e uma célula ciliada interna (IHC) em cada seção, as preparações da superfície coclear visualização de todo o comprimento do OC para a contagem de células ciliadas sensoriais e sinapses de fita e imunorotulagem de células ciliadas sensoriais correspondentes a freqüências funcionais específicas. A Tabela 1 mostra o mapeamento das frequências auditivas em função da distância ao longo do comprimento da espiral coclear em camundongo adulto CBA/J de acordo com estudos de Muller1 e Viberg e Canlon1,2. As preparações da superfície coclear têm sido amplamente utilizadas para investigação de patologias cocleares4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15. O método de dissecção coclear de montagem inteira foi originalmente descrito em um livro editado por Hans Engstrom em 196616. Esta técnica foi posteriormente refinada e adaptada a uma variedade de espécies descritas na literatura por um número de cientistas na ciência auditiva10,11,12,13, 15,17 e pelos Laboratórios Eaton-Peabody em Massachusetts Eye and Ear18. Recentemente, outro método de dissecção coclear foi relatado por Montgomery et al.19. A microdissecção da cóconlea é um passo essencial e crítico para as preparações da superfície coclear. No entanto, dissecar cócroes de rato é um desafio técnico e requer uma prática considerável. Aqui, um método de preparação de superfície coclear modificado é apresentado para uso em cócroes de camundongos adultos. Este método requer decalcificação e uso de adesivo celular e tecido (ou seja, Cell-Tak) para aderir aos pedaços de epitélio coclear para 10 mm cobres redondos para imunorotulagem. O adesivo da pilha e do tecido foi amplamente utilizado para a imunohistoquímica20. Este método modificado de microdissese coclear é relativamente simples em comparação com os relatados anteriormente18,19.

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Protocolo

Todos os protocolos de pesquisa envolvendo camundongos CBA/J adultos do sexo masculino com idades entre 10 e 12 semanas e camundongos C57BL/6J com idades entre 6 e 8 semanas foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Universidade Médica da Carolina do Sul (MUSC). O cuidado animal estava a supervisão da divisão de recursos animais do laboratório em MUSC.

Nota: Para os procedimentos apresentados abaixo, os camundongos são anestesiados com cetamina (100 mg/kg) e xilamina (10 mg/kg) através de injeções intraperitoneal. Os ratos são decapitados depois que o animal já não responde aos estímulos dolorosos, tais como uma pitada do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo.

1. Extração de Ossos Temporais

  1. Decapite o rato imediatamente após a morte com tesoura cirúrgica (17 cm de comprimento) e corte o osso do crânio com uma tesoura do aspecto posterior para a frente ao longo da linha central do crânio depois de expor o osso do crânio, puxando a pele anteriormente.
  2. Retire o tecido cerebral usando fórceps e remover manualmente os ossos temporais com o polegar eo dedo indicador para ratos três meses de idade ou mais. Use pequenas tesouras cirúrgicas (11 cm de comprimento) para cortar o osso temporal de camundongos com menos de três meses de idade.
  3. Coloque o osso temporal em uma placa de Petri (30 mm de diâmetro) contendo solução de paraformaldeído fresco de 4% (PFA) esfriada em fosfato, pH 7.4.
    Nota: Prepare a nova solução PFA de 4% e ajuste o pH para 7,4 pouco antes de fixar os ossos temporais, pois o equilíbrio inadequado de pH da solução PFA diminuirá a qualidade da imunorotulagem.

2. Fixação e Perfusão

  1. Retire as fitas da janela oval e perfurar a membrana da janela redonda com tamanho #5 fórceps. um microscópio estéreo da dissecação faz um furo pequeno no ápice do cochlea usando uma agulha de 27 G conectada a uma seringa de 1 mL.
  2. Perfuse delicadamente e lentamente o cochlea com a solução de PFA de 4% através das janelas redondas e ovais até que a solução lave fora do furo pequeno no ápice. Transfira a cóconlea (uma ou duas córdeias por frasco) para frascos de cintilação de volume de 20 mL contendo 10 mL de solução PFA de 4%.
  3. Agita delicadamente os frascos da cintilação na temperatura ambiente (RT) por 2 h e deixe durante a noite em um refrigerador (4 °C) em um rotator.
    Nota: O tempo de fixação pode ser ajustado dependendo do anticorpo usado. Por exemplo, limitar a fixação a 1,5 h permitirá a imunorotulagem bem-sucedida de terminais pós-sinápticos ao usar o anticorpo GluA 2.

3. Decalcificação do Osso Temporal

  1. Retire a solução PFA e lave a cócona com PBS 3x fresco para 5 min cada.
  2. Adicione 20 mL de 4% de etilediáceoss solução de sal disódio (EDTA) solução (pH 7.4) para os frascos de clinização e manter em uma geladeira por 48-72 h em um rotador com agitação suave. Mude a solução EDTA diariamente até que as cócones sejam descalcificadas. Verifique se as cólicas são descalcificadas tocando a porção vestibular óssea com fórceps para avaliar a elasticidade ou simplesmente cortar um pequeno pedaço da borda da porção vestibular. Se tal corte resultar em uma peça esmagada, a cóclea não é descalcificada.
    Nota: A solução EDTA pode interferir com a imunoreação dos anticorpos primários, dependendo da concentração da solução. Prepare 4% EDTA na PBS e ajuste o pH para 7,4. Para decalqueificação consistente de ossos temporais, a solução EDTA fresca é usada.
  3. Mude a solução para PBS para microdissese após a decalcificação estiver completa.
    Nota: Se as cómas não forem suficientemente descalcificadas, a dissecação das cócones não pode ser realizada.

4. Microdissese do Epitélio Coclear

Nota: Uma vez que a decalcificação esteja completa, a microdissese do epitélio coclear para imunorotulagem precisa ser realizada o mais rápido possível. Em uma placa de Petri limpa de 30 mm contendo PBS, a orelha interna é orientada da seguinte maneira: em referência à parte superior da placa de Petri (tampa) e inferior, as janelas coclearas redondas e ovais e voltas à parte superior. Em referência ao dessetor, a porção coclear é orientada para a frente (longe do dessetor) e porção vestibular em direção à parte de trás (quase dessetor). O seguinte descreve as etapas em detalhe.

  1. Segure a porção vestibular do osso temporal com fórceps e corte a curva apical com o bisturi em um ângulo de 45°, conforme indicado pela linha vermelha(Figura 1a).
  2. Corte verticalmente ao longo da tênue linha entre a janela redonda e a janela oval, como indicado pela linha vermelha(Figura 1b)para separar a cóconlea da porção vestibular (Figura 1c).
    Nota: Esta porção coclear contém as porções médias, basais e de gancho do epitélio.
  3. Coloque a porção coclear com a volta basal em direção ao fundo e a volta do meio em direção ao topo da placa de Petri e corte a cápsula óssea e a parede lateral da curva do meio em direção ao final do qual a seção apical foi removida, como indicado pela linha vermelha (Figu re 1d,e).
  4. Continue cortando para separar completamente a parte média das regiões basal e do gancho(figura 1f,g).
    Nota: A região do gancho da cóconlea é o fim do epitélio coclear correspondente à sensibilidade aos tons 48 kHz e mais elevado em camundongos.
  5. Coloque a porção basal e gancho com o local da membrana basilar orientada para a parte inferior do prato e verticalmente cortar o modiolus fora da região do gancho para remover o modiolus como indicado pela linha vermelha vertical (Figura 1g).
    Nota: O modiolus é o eixo central cônico da córdia que consiste em osso esponjoso e nervo coclear, bem como o gânglio espiral. Pode ser preferível realizar este corte com tesoura.
  6. Corte as regiões basal e gancho como a outra linha vermelha indica na Figura 1g para separar a porção de gancho(Figura 1h).
    Nota: A cócrolea foi separada em porções apical, médias, basais e de gancho. Os próximos passos serão a dissecação final de cada uma das voltas individuais, usando a curva do meio como exemplo.
  7. Corte as porções relativamente grandes de cápsula óssea e tecido de parede lateral da curva do meio, como indicado pela linha vermelha (Figura 1i).
    Nota: A parede lateral do duto coclear é formada pelo ligamento espiral e pela stria vascularis.
  8. Segure a parede lateral com fórceps para alinhar a cápsula óssea e parede lateral com o fundo da placa de Petri e cortar esses tecidos do lado da membrana basilar. Em seguida, achatar o espécime para orientar o lado da superfície da célula do cabelo sensorial para cima. Aparar o resto da cápsula óssea e parede lateral(Figura 1j).
  9. Retire a membrana tectorial usando fórceps para separar completamente a região média(Figura 1k).
  10. Repita os passos 4,7-4,9 para as dissecções finais das voltas ou regiões restantes, como mostrado na Figura 1l.
  11. Prepare um coverslip redondo de 10 mm para a adesão do epitélio sensorial. Use uma pipeta para espalhar à mão 0,5 μL de adesivo celular e tecido no centro do coverslip redondo. Depois de secar (3-5 min em RT), coloque os coverslips em PBS em placas de Petri.
  12. Coloque todos os quatro pedaços do epitélio sensorial no coverslip redondo de 10 mm na placa de Petri. Em seguida, segure uma borda do coverslip para transferi-lo para um prato de quatro poços para imunorotulagem ou imunohistoquímica (Figura 1m).
    NOTA: Figura 2 ilustra a localização dos grandes cortes.

5. Imunorotulagem para Sinapses Coclear

Nota: O protocolo de imunorotulagem para sinapses cocleares seguidoneste estudo foi previamente descrito13. Fitas pré-sinápticas foram rotuladas com um anticorpo CtBP2 (proteína de ligação anti-carboxílica-terminal de camundongos 2 IgG1, rotulando o domínio B da proteína de andaimeRIBEYE). Terminais pós-sinápticos foram rotulados com anticorpoglu2 (receptor anti-glutamato de camundongo 2 IgG2a, rotulando subunidades do receptor AMPA).

  1. Lave o epitélio sensorial com PBS 3x para 5 min cada lavagem em um prato de quatro poços e, em seguida, adicione 2 mL de 2% surfactante nonionic (ou seja, Triton-X 100) no prato por 30 minutos em RT em um rotador.
  2. Retire a solução surfactante nonionic do prato usando uma pipeta e adicione 100 μL de solução de bloqueio contendo 10% de soro de cabra normal para cada bem para 1 h em um rotador com agitação suave no RT.
  3. Remova a solução de bloqueio de cada poço, lave com PBS 3x por 5 min cada lavagem agitação suave no RT.
  4. Adicione 100 μL dos anticorpos primários diluídos com PBS a cada poço: mouse anti-GluA2 IgG2a (1:2,000), mouse anti-CtBP2 IgG1 (1:400). Cubra cada prato de quatro poços com sua tampa e coloque em um grande recipiente umidificado que protege da luz. Incubar a 37 °C para 24 h.
    Nota: Como opção, coelho anti-miosina VIIa (1:400) para imunorotulagem células ciliadas sensoriais podem ser adicionados.
  5. Lave 3x com PBS por 5 min cada lavagem com agitação suave em RT.
  6. Adicione 100 μL dos anticorpos secundários Alexa 594 cabra anti-mouse IgG1a (1:1,000), Alexa 488 cabra anti-mouse IgG2a (1:1,000) diluído com PBS para cada poço. Cubra cada prato de quatro poços com sua tampa e coloque em um grande recipiente umidificado que protege da luz. Incubar a 37 °C para 2 h.
    Nota: Se a miosina VIIa for usada, adicione Alexa 350 cabra anti-coelho (1:200).
  7. Lave 3x com PBS por 5 min. Em seguida, transfira o coverslip redondo de 10 mm para um slide com as amostras por cima.
  8. Adicione cuidadosamente 8 μL de Fluoro-Gel com Tris buffer no centro do coverslip. Em seguida, segure a borda de outro coverslip rodada de 10 mm com fórceps para montar em cima, imprensando os dois coverslips juntos.
  9. Use esmalte para selar os slides, colocá-los em uma pasta de papelão slide, e armazenar na geladeira.
    Nota: Se algum Fluoro-Gel vazar entre os lábios durante a montagem, limpe as bordas dos lábios antes de selar o slide com esmalte. As imagens confocal precisam ser tiradas dentro de 7 dias.

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Resultados

As preparações superficiais do epitélio coclear, em combinação com imunorotulagem e imagem confocal, têm sido amplamente utilizadas na ciência auditiva para a investigação de patologias cocleares, como quantificação de sinapses de fita, células ciliadas sensoriais, e expressão de proteína em células ciliadas sensoriais5,6,7,8. Embora a dissecação de cóciqueiros de camundongos adultos para a pre...

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Discussão

A microdissecção coclearde de preparações de superfície de montagem inteira em combinação com imunorotulagem fornece uma ferramenta básica para a investigação de patologias do ouvido interno e mecanismos moleculares. Este método de dissecção coclear adulto modificado do rato usando o adesivo da pilha e do tecido simplifica este procedimento difícil.

Embora este método de preparação coclear modificado da superfície seja relativamente fácil e acessível, ainda exige a prática a fim conseguir a pr...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

O projeto de pesquisa descrito foi apoiado pela concessão R01 DC0009222 do Instituto Nacional de Surdez e Outros Distúrbios da Comunicação, Institutos Nacionais de Saúde. Este trabalho foi realizado no Edifício WR no MUSC em espaço renovado apoiado pela concessão C06 RR014516. Os animais foram alojados em instalações animais MUSC CRI apoiadas pela concessão C06 RR015455 do Programa de Instalações de Pesquisa Extramural do Centro Nacional de Recursos de Pesquisa. Os autores agradecem ao Dr. Jochen Schacht por seus comentários valiosos e Andra Talaska pela revisão do manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
de lamínulas Rund de 10 mmpara ciência e indústria260367
Alexa Fluor 488 Goat Anti-mouse IgG2Thermo Fisher ScientificA-21131
Alexa Fluor 488 PhalloidinThermo Fisher ScientificA12379
Alexa Fluor 594 Goat Anti-mouse IgG1Thermo Fisher ScientificA-21125
Alexa Fluor 594 Cabra Anti-coelho IgG (H+L)Thermo Fisher ScientificA11012
Bandejas Micro Slide de CarboardFisher Scientific12-587-10
Cell-TakBD Biosciences354240
Placas de Petri CorningFisher Scientific353004
DAPIThermo Fisher Scientific62247
Dumont #5 FórcepsFerramentas de ciência fina FST11251-20
EDTA Sal dissódicoSigma-AldrichE5134
Fluoro-gel com Tris BufferMicroscopia Eletrônica Ciências17985-10
Placas de cultura de células de quatro poçosGreiner Bio-One627170
Anticorpo antimiosina VIIa de cabraProteus Biosciences25-6790
Lâminas de microscópioFisher Scientific12-544-7
Camundongo Anti-CTB2 AnticorpoBD Biosciences#612044
Camundongo Anticorpo Anti-Glu2RMilliporeMAB397
Soro de Cabra NormalThermo Fisher Scientific31872
ParaformaldeídoSigma-Aldrich441244
Fosfato Tamponado SalinoFisher ScientificBP665-1
BisturiVWR100491-038
Triton X-100Sigma-AldrichX100-500ML
Vannas Tesoura de MolaFerramentas de Ciência Fina15001-08
Produtos de microscopia

Referências

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