Os tumores neuroendócrinos (NETs) são originários de células neuroendócrinas da crista neural. Eles são lentos crescimento e desafiador para a cultura. Nós apresentamos uma estratégia alternativa para crescer redes das entranhas pequenas cultivando as como spheroids. Estes esferoides têm marcadores líquidos das entranhas pequenas e podem ser usados para o teste de droga.
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Artigo de método
Estabelecimento e caracterização de spheroids do tumor neuroendócrino das entranhas pequenas
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os tumores neuroendócrinos das entranhas pequenas (SBNETs) são os cancros raros que originam das pilhas enterochromaffin do intestino. A pesquisa neste campo foi limitada porque muito poucas linhas de pilha derivadas paciente do SBNET foram geradas. As células SBNET bem diferenciadas são de crescimento lento e são difíceis de propagar. As poucas linhas celulares que foram estabelecidas não estão prontamente disponíveis, e após o tempo na cultura pode não continuar a expressar características de células NET. A geração de novas linhas celulares pode levar muitos anos desde que as células SBNET têm um longo tempo de duplicação e muitas etapas de enriquecimento são necessárias para eliminar os fibroblastos associados ao câncer em rápida divisão. Para superar estas limitações, nós desenvolvemos um protocolo às pilhas de sbnet da cultura dos tumores cirùrgica removidos como esferoides na matriz extracelular (ECM). O ECM forma uma matriz tridimensional que encapsula as células SBNET e imita o microambiente tumoral para permitir que as células da SBNET cresçam. Aqui, nós caracterizamos a taxa de crescimento de esferoides de sbnet e métodos descritos para identificar marcadores de sbnet usando a microscopia da imunofluorescência e immunohistochemistry para confirmar que os esferoides são pilhas neuroendócrinas do tumor. Além, nós usamos esferoides de sbnet para testar a citotoxicidade do Rapamycin.
Introdução
Os tumores neuroendócrinos das entranhas pequenas (SBNETs) originam das pilhas enterochromaffin do intestino pequeno. Embora os sbnets sejam geralmente conhecidos para crescer lentamente, eles comumente metástase para o fígado1. Quando a remoção cirúrgica ou a ablação do tumor puder ser considerada em muitos casos, o retorno é quase universal, e, conseqüentemente, a terapia médica joga um papel importante na gerência. Esforços enormes foram investidos para gerar novas linhas de células SBNET para o teste de drogas. No entanto, houve muito pouco sucesso. Apenas 6 linhas de células sbnet (KRJ-I, CND2, GOT1, P-STS, L-MS, H-STS) foram relatadas
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Protocolo
Todos os experimentos com amostras de tumores neuroendócrinos humanos foram aprovados pelo Comitê do hospital da Universidade de Iowa e clínicas IRB (protocolo número 199911057). Uma lista de todos os materiais e equipamentos é descrita na tabela de materiais. Uma lista de meios de crescimento e soluções-chave encontra-se na tabela 1.
1. tumor neuroendócrino das entranhas pequenas (SBNET) coleção e dissociação da pilha
- Obtenha amostras de SBNET paciente resected após a confirmação dos tecidos do tumor do núcleo cirúrgico da patologia.
- Corte SBNETs em cubos de 5 mm e armazene em 25 mL de ....
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Resultados
Existem atualmente apenas 2 linhas de células sbnet estabelecidas e publicadas2,3,4,5 e elas não estão prontamente disponíveis para muitos pesquisadores. Aqui, propomos a cultura sbnet como esferoides em ECM e usar isso como um modelo alternativo para estudar a sensibilidade à droga sbnet. O tumor derivado do paciente de um sbnet que metástase ao fígado foi coletado, digerido para liberar pilha.......
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Discussão
As culturas do tumor 3D tornaram-se um recurso valioso para o teste de droga pré-clínico15. Os vários e biobancos organoid do tumor foram estabelecidos recentemente dos tumores16,17do cancro da mama e de próstata. Neste estudo, nós fornecemos um protocolo detalhado à cultura sbnet como esferoides e um método simples e rápido para validar as culturas do esferóide para marcadores líquidos pela imunofluorescência e pela sensibilidade do teste.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo NIH concede P50 CA174521 (a J.R. Howe e A.M. Bellizzi). P.H. Ear é um receptor do prêmio P50 CA174521 programa de aprimoramento de carreira.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Anti-coelho FITC | Jackson ImmunoResearch | 11-095-152 | Acoplamento de anticorpos secundários a um fluoróforo verde |
| Solução de recuperação de antígenos | Agilent Dako | S2367 | Solução em pH 9 para preparação de lâminas para IHC |
| Autostainer Link 48 | Agilent Dako | Não disponível | Sistema automatizado para coloração de anticorpos |
| Recipiente de congelamento de células | Thermo Scientific | 5100-0001 | Recipiente para congelar células |
| CellSence | Olympus Versão 1.18 | Software de computador para usar microscópio fluorescente | |
| Anticorpo de cromogranina A | Abcam-45179 | RB-9003-PO | Anticorpos para IF |
| Anticorpo de cromogranina A (clone LK2H10) | Thermo Scientific | MA5-13096 | Anticorpos para IHC |
| Collagenase | Sigma | C0130 | Enzima para digestão de tecido tumoral |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | Meio para preparação de tecidos |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | Meio para culturas organoides |
| DMSO | Sigma | D8418 | Solvente para dissolução de droga |
| DNAse | Sigma | DN25 | Enzima para digestão de tecido tumoral |
| Etídio Homodímero | Chemodex | CDX-E0012-T1E | Corante de ligação de DNA e RNA |
| FBS | Gibco | 16000044 | Reagente para meios de cultura |
| Microscópio fluorescente | Microscópio Olympus | CKX35 | para tirar fotos de esferóides SBENT |
| Glutamina | Gibco | A2916801 | Reagente para meios de cultura |
| ImageJ | National Institutes of Health | Versão 1.51 | Software de computador para imagem análise |
| Insulina | Sigma | I0516 | Reagente para meios de cultura |
| Matrigel | Corning | 356235 | Matriz para incorporar e ancorar organoides |
| Meio de montagem (VECTASHIELD) | Vector Laboratories | H-1200 | Fixador para células marcadas com coloração nuclear |
| Nicotinamida | Sigma | 72340 | Reagente para meios de cultura |
| Microscopia Eletrônica de Paraformaldeído | Sciences | 15710 | Reagente para fixar células |
| PEN/STREP | Gibco | 15140-122 | Reagente para meios de cultura |
| PT Link | Agilent Dako | Não disponível | Sistema automatizado para preparar lâminas para coloração IHC |
| Rapamicina | Alfa Aesar | J62473 | Medicamento que pode inibir o crescimento NET |
| Anticorpos secundários para IHC | Agilent Dako | K8000 | Anticorpos secundários para IHC usando anticorpo SSTR2 do sistema EnVision FLEX à base de polímero |
| GeneScritp | A01591 | Anticorpos para | |
| anticorpo IF SSTR2 (clone UMB1) | Abcam | ab134152 | Anticorpos para |
| IHC Anticorpo sinaptofisina | Abcam | 32127 | Anticorpos para IF |
| Anticorpo sinaptofisina (clone DAK-SYNAP) | Agilent Dako | Anticorpos M7315 | para IHC |
| TritonX | Mallinckrodt | 3555 KBGE | Reagente para permeablizar células |
| Y-2763 Inibidor de ROCK | Adipogen | AG-CR1-3564-M005 | Para melhorar a viabilidade do esferóide SBNET após o congelamento e descongelamento |
Referências
- Maxwell, J. E., Sherman, S. K., Howe, J. R. Translational Diagnostics and Therapeutics in Pancreatic Neuroendocrine Tumors. Clinical Cancer Research. 22, 5022-5029 (2016).
- Pfragner, R., et al. Establi....
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Reimpressões e permissões
