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Estabelecimento e caracterização de spheroids do tumor neuroendócrino das entranhas pequenas

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DOI:

10.3791/60303

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14 de outubro de 2019

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1Department of Surgery, University of Iowa Carver College of Medicine, 2High Throughput Screening Facility, University of Iowa Carver College of Medicine, 3Department of Pathology, University of Iowa Carver College of Medicine

Neste artigo

Resumo

Os tumores neuroendócrinos (NETs) são originários de células neuroendócrinas da crista neural. Eles são lentos crescimento e desafiador para a cultura. Nós apresentamos uma estratégia alternativa para crescer redes das entranhas pequenas cultivando as como spheroids. Estes esferoides têm marcadores líquidos das entranhas pequenas e podem ser usados para o teste de droga.

Resumo

Os tumores neuroendócrinos das entranhas pequenas (SBNETs) são os cancros raros que originam das pilhas enterochromaffin do intestino. A pesquisa neste campo foi limitada porque muito poucas linhas de pilha derivadas paciente do SBNET foram geradas. As células SBNET bem diferenciadas são de crescimento lento e são difíceis de propagar. As poucas linhas celulares que foram estabelecidas não estão prontamente disponíveis, e após o tempo na cultura pode não continuar a expressar características de células NET. A geração de novas linhas celulares pode levar muitos anos desde que as células SBNET têm um longo tempo de duplicação e muitas etapas de enriquecimento são necessárias para eliminar os fibroblastos associados ao câncer em rápida divisão. Para superar estas limitações, nós desenvolvemos um protocolo às pilhas de sbnet da cultura dos tumores cirùrgica removidos como esferoides na matriz extracelular (ECM). O ECM forma uma matriz tridimensional que encapsula as células SBNET e imita o microambiente tumoral para permitir que as células da SBNET cresçam. Aqui, nós caracterizamos a taxa de crescimento de esferoides de sbnet e métodos descritos para identificar marcadores de sbnet usando a microscopia da imunofluorescência e immunohistochemistry para confirmar que os esferoides são pilhas neuroendócrinas do tumor. Além, nós usamos esferoides de sbnet para testar a citotoxicidade do Rapamycin.

Introdução

Os tumores neuroendócrinos das entranhas pequenas (SBNETs) originam das pilhas enterochromaffin do intestino pequeno. Embora os sbnets sejam geralmente conhecidos para crescer lentamente, eles comumente metástase para o fígado1. Quando a remoção cirúrgica ou a ablação do tumor puder ser considerada em muitos casos, o retorno é quase universal, e, conseqüentemente, a terapia médica joga um papel importante na gerência. Esforços enormes foram investidos para gerar novas linhas de células SBNET para o teste de drogas. No entanto, houve muito pouco sucesso. Apenas 6 linhas de células sbnet (KRJ-I, CND2, GOT1, P-STS, L-MS, H-STS) foram relatadas2,3,4,5; e, infelizmente, uma linha celular não expressa mais marcadores NET6 e três outras linhas de células sbnet (KRJ-I, L-STS, H-STS) foram determinadas como derivadas de linfoblastos transformados em vez de redes7. A fim de acelerar a identificação de fármacos para a segmentação da SBNETs, são necessários métodos alternativos para o teste in vitro de fármacos.

Aqui, nós aproveitamos a disponibilidade de sbnets resected e estabelecemos uma maneira de cultivar estes sbnets paciente-derivados como esferoides que crescem no ECM. O objetivo geral deste manuscrito é descrever um método para cultura da SBNET como uma cultura tridimensional (3D) e delinear procedimentos para caracterizar esses esferóides para a retenção de marcadores da SBNET por imunofluorescência e imunohistoquímica.

Além, Nós demonstramos como estes esferoides de sbnet podem ser usados testando o efeito do Rapamycin, uma droga anticancerígena para redes8. A fundamentação subjacente a este protocolo é desenvolver um novo método para cultivar as células da SBNET in vitro e utilizá-las para testes de drogas. A vantagem desta técnica sobre o método tradicional de estabelecer uma linha de pilha de SBNET é que as culturas 3D de SBNETs podem ràpida ser obtidas e o teste de droga pode ser feito dentro de 3 semanas. Os esferoides de sbnet poderiam potencialmente ser usados como um modelo para executar telas in vitro da droga para identificar drogas novas para pacientes de sbnet. Uma vez que as linhas de células SBNET não estão amplamente disponíveis, as culturas 3D de esferóides SBNET podem servir como um novo modelo in vitro para estudar SBNETs e podem ser compartilhadas entre cientistas no campo.

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Protocolo

Todos os experimentos com amostras de tumores neuroendócrinos humanos foram aprovados pelo Comitê do hospital da Universidade de Iowa e clínicas IRB (protocolo número 199911057). Uma lista de todos os materiais e equipamentos é descrita na tabela de materiais. Uma lista de meios de crescimento e soluções-chave encontra-se na tabela 1.

1. tumor neuroendócrino das entranhas pequenas (SBNET) coleção e dissociação da pilha

  1. Obtenha amostras de SBNET paciente resected após a confirmação dos tecidos do tumor do núcleo cirúrgico da patologia.
  2. Corte SBNETs em cubos de 5 mm e armazene em 25 mL de meio DMEM/F12 em um tubo cônico para o transporte para o laboratório.
  3. Transfira os tumores em DMEM contendo 1% de FBS, 1% de penicilina/estreptomicina (Pen/Strep), 1% de glutamina (meio de lavagem) e incubar neste meio de lavagem por 15 min.
  4. Transfira tumores para um novo prato e mince tumores para menos de 1 mm peças usando estéril tesoura curvada.
  5. Transfira os tecidos triturados para um novo tubo de 50 mL contendo 25 mL de meio de lavagem.
  6. Centrifugue a amostra a 500 x g durante 15 min a 4 ° c.
  7. Descarte o sobrenadante e ressuspender as pelotas em 10 mL de meio de lavagem contendo colagenase (100 U/mL) e DNase (0,1 mg/mL).
  8. Permita que a digestão dos tumores triturados ocorra em uma incubadora de 37 ° c com agitação lenta (50 rpm) para 1,5 h.

2. cultura de sbnets como esferoides do tumor no ECM

  1. Depois que a digestão é terminada (etapa 1,8), Centrifugue em 500 x g por 15 minutos em 4 ° c, descarte o sobrenadante e resuma o pellet em 15 ml de meio de lavagem.
  2. Coloque um filtro de células de 70 μm em cima de um novo tubo de 50 mL e transfira 10 mL do meio de lavagem sobre o filtro da célula. Gire o meio de lavagem para cobrir o lado do tubo de plástico para evitar que as células líquidas aderem ao lado do tubo de plástico.
  3. Filtre a suspensão da célula através do filtro de células.
  4. Centrifugador a 500 x g durante 15 min a 4 ° c, descarte o sobrenadante, Ressuspender o pellet em 200 μL de meio de lavagem (o volume total é de ~ 250 μL) e colocá-lo no gelo.
  5. Transferir 5 μL de células para 500 μL de meio de lavagem (1/100 factor de diluição). Use as células diluídas para contagem de células usando um hemociômetro para obter o número de células por mililitro. Multiplicar por 100 para corrigir o fator de diluição.
  6. Multiplique o número de células por mL obtidas na etapa 2,5 pelo volume total de células em suspensão obtidas na etapa 2,4 (~ 250 μL).
  7. Centrifugar a 500 x g durante 15 min a 4 ° c, descartar o sobrenadante e suspender as células em ECM líquido (1 x 106 células/ml) e manter o gelo.
  8. Transfira 5-20 μL de esferoides de sbnet no ECM a uma placa de 96 poços e permita que o ECM líquido solidificar coloc a placa em uma incubadora de 37 ° c por 5 minutos.
  9. Adicionar 200 μL de meio de cultura SBNET (DMEM/F12 + 10% FBS + 1% PEN/STREP + 1% de glutamina + 10 mM de nicotinamida + 10 μg/mL de insulina) a cada poço da placa 96-well contendo os esferóides da SBNET no ECM.
  10. Alternativamente, os organóides da cultura sbnet em meios da pilha de haste similares a o que foi descrito previamente para crescer o fígado humano ou os organóides pancreatic9 e alistados na tabela dos materiais.
  11. Mude a mídia a cada 5-7 dias.

3. quantificação do tamanho do esferóide de sbnet usando ImageJ

  1. Tome 5-10 retratos de esferoides de sbnet no dia 1, 4, 7, 14, 23 e 97 da cultura usando um objetivo 10x.
  2. Abra imagens salvas no ImageJ. Vá para a guia analisar , selecione a opção definir medições e coloque uma verificação na opção área .
  3. Use a ferramenta de seleção oval da barra de ferramentas para gerar um elipsóide ou círculo em torno de um spheroid bem focado.
  4. Vá para a guia Analyze e selecione a opção Measure . Repita as etapas 3,4 e 3,5 a fim começ a medida da área de 25-50 spheroids de SBNET. Os valores são fornecidos em pixel Square.
  5. Converta a área de pixel para μm2 dividindo o tamanho de cada pixel com o comprimento de cada pixel para o fator de conversão μm das imagens de microscopia.
    Nota: as células sbnet crescem principalmente como esferoides e, em algum momento como elipsóides.

4. caracterização de esferóides da SBNETS por imunofluorescência

  1. Transfira os organóides cultivados em ECM para um tubo de 1,5 mL usando uma pipeta P1000.
  2. Centrifugue a 1.500 x g durante 1 min e retire o sobrenadante.
  3. Lave a cultura organóide adicionando 1 mL de PBS, misture, Centrifugue a 1.500 x g durante 1 min e retire o sobrenadante.
  4. Fixar os organóides adicionando 500 μL de paraformaldeído a 4% e incubar por 15 min.
  5. Lave a cultura duas vezes com 1 mL de PBS.
  6. Permeabilize a cultura adicionando 500 μL de PBS + 3% BSA + 0,1% Triton X 100 por 5 min.
  7. Em seguida, lave por três vezes com 1 mL de PBS + 3% BSA.
  8. Incubar por 1 h com anticorpos primários contra A Sinaptofisina (SYP)10 a 1/600 de diluição ou cromogranina A (CGA)11 e receptor de SOMATOSTATINA 2 (SSTR2)12 a 1/400 diluição em tampão de anticorpo (2,5% de albumina sérica bovina, 0,1% de sódio azida, 25 mM TRIS pH 7,4, 150 mM cloreto de sódio).
    Nota: utilizar 300 μL ou mais de solução de anticorpos por tubo.
  9. Lave três vezes com 1 mL de PBS + 3% de BSA.
  10. Incubar com anticorpos secundários acoplados a FITC a 1/500 diluição em tampão de anticorpo durante 1 h. utilizar 300 μL ou mais de solução de anticorpos por tubo.
  11. Lave 3 vezes com 1 mL de PBS + 3% de BSA. Certifique-se de aspirar e descartar todo o sobrenadante.
  12. Adicionar 5 μL de meio de montagem contendo a mancha nuclear DAPI.
  13. Use uma pipeta P20 para transferir 5 μL dos esferóides SBNET da etapa 4,12 para um slide de vidro e vedação com um deslizamento de cobertura.
  14. Tome imagens usando um microscópio fluorescente usando os objetivos 10x, 20x ou 40x.

5. caracterização de esferóides da SBNET por imunoistoquímica (IHC)

  1. Transfira esferoides sbnet da placa de cultura para um tubo de 1,5 ml usando uma pipeta P1000.
  2. Centrifugue a 1.500 x g durante 1 min e retire o sobrenadante.
  3. Fix esferoides sbnet adicionando 500 μL de formalina 10% para o tubo da etapa 5,2 e incubar à temperatura ambiente para 2-5 dias antes da incorporação de parafina e corte 4 μm de espessura esferóide seções.
  4. Desparaffinize, rehidrate, e use a recuperação calor-induzida do epítopo na solução da recuperação do antígeno em pH 9 aquecendo ao ° c 97 por 20 minutos usando a estação de processamento de corrediça 3-in-1 automatizada para preparar corrediças para a incubação do anticorpo.
  5. Bloqueie as lâminas e incubar com anticorpos primários contra SYP10 a uma diluição de 1/100 por 15 min, CGA11 a uma diluição de 1/800 por 15 min, e SSTR212 a uma diluição de 1/5000 por 30 min.
  6. Incubar com o sistema secundário da deteção do anticorpo por 15 minutos para a mancha de anti-SYP e de CgA e 30 minutos para a mancha SSTR2. Tire fotos usando um objetivo 400x.

6. tratamento de organoides da SBNET com rapamicina

  1. Dissolva a rapamicina no DMSO para obter uma solução de estoque de 10 mM.
  2. Prepare o meio de cultura SBNET com DMSO (por exemplo, 1 mL de meio de cultura SBNET + 1 μL de DMSO) e meio de cultura SBNET com 10 μM de rapamicina (por exemplo, 1 mL de meio de cultura SBNET + 1 μL de solução de 10 mM de rapamicina).
  3. Transfira 200 μL de mídia com meio de cultura SBNET com DMSO ou 10 μM de rapamicina para culturas de esferóide SBNET.
  4. Incubar esferóides SBNET por 5 dias em incubadora de 37 ° c.
  5. Adicionar 1 μm de etidium homodímero e incubar por 30 min. Retire o meio contendo etidium homodímero, lave com 200 μL de PBS e transfira 200 μL de PBS para cada poço.
  6. Tome imagens da microscopia de esferoides de sbnet com e sem tratamento da droga usando o cubo vermelho do filtro com os objetivos 10x, 20x, ou 40x de um microscópio fluorescente.
    Nota: as células mortas coradas com ethidium homodímero aparecem como vermelhas usando o cubo de filtro vermelho G de um microscópio disponível comercialmente (tabela de materiais). Alternativamente, o sinal pode ser capturado usando um espectrofotômetro em 535 de excitação nm e emissão de 624 nm.

7. rachar esferoides sbnet

Observação: isso é feito para expansão e para compartilhamento com outros pesquisadores.

  1. Use uma pipeta P1000 para quebrar mecanicamente o ECM e aspirar o ECM com esferoides de sbnet a um tubo estéril de 1,5 ml.
  2. Centrifugador em 1.000 x g em 4 ° c, remova todo o sobrenadante e coloc o tubo no gelo.
  3. Adicione 2-4x o volume de ECM novo ao pellet. Misture o ECM novo com os esferoides velhos do ECM e do sbnet pipetando acima e para baixo 10x. Evitando a introdução de bolhas de ar.
  4. Transfira 5-20 μl do ECM e da mistura dos esferoides de sbnet a uma placa nova e permita que o ECM solidify.
  5. Cubra com o novo meio SBNET e transfira para a incubadora. A taxa de recuperação é de aproximadamente 95 a 100%.
  6. Para o envio de esferoides sbnet para outro laboratório, transferir esferoides sbnet com ECM novo para um balão T25 e permitir ECM para solidify.
  7. Encha o balão T25 com o meio esferóide de sbnet, parafuse na tampa firmemente, e prepare o pacote da expedição.
  8. Ao receber uma cultura esferóide sbnet, remova o meio de cultura e execute a etapa 7,1 para 7,5 para colocar esferoides sbnet volta na cultura.

8. cryostorage e recuperação de esferoides sbnet

  1. Transfira esferoides de sbnet de 5-10 poços pequenos a um tubo de 15 ml. Centrifugador em 500 x g por 15 minutos em 4 ° c, remova o sobrenadante, ressuscitem no meio de congelação (90% FBS + 10% DMSO), armazene em um recipiente de congelação da pilha, e coloc este em-80 ° c.
  2. Transferência para o nitrogênio líquido para maior armazenamento.
  3. Para recuperar os esferóides da SBNET, coloque o frasco congelado no gelo e aguarde até que o conteúdo seja completamente thawed. Inverta o tubo e reposicione no gelo para acelerar o processo de descongelar.
  4. Uma vez que a amostra é descongelada, colocada dentro de uma centrífuga pré-refrigerada e girar em 1.000 x g por 10 min.
  5. Retire o sobrenadante e ressuscitem os esferóides no ECM. Mantenha o tubo no gelo, transfira 20 μL para uma placa nova e aguarde que o ECM se solidifique.
  6. Transferência 200 μL de meio de cultura SBNET com 10 μM de inibidor de rocha (Y-27632)13 e transferência para a incubadora.
  7. Permita que os esferoides de sbnet recuperem e cresçam por 1 semana. Retire o meio de cultura antigo, reabasteça com 200 μL de meio de cultura SBNET e retorne à incubadora.
  8. Permita que os esferoides de sbnet continuem a crescer.
    Nota: é preciso pelo menos 1 semana para que os esferóides de crescimento rápido comecem a se recuperar após a criopreservação13. Os esferoides de sbnet tomam um mínimo de 2-4 semanas para começar crescer. Muitas pilhas de SBNET morrerão dentro das primeiras 2 semanas e a taxa de sobrevivência é menos de 10%. Uma vez que este é um processo muito demorado e de baixo rendimento, é melhor compartilhar com outros pesquisadores esferoides sbnet em frascos de cultura (como descrito na etapa 7). Cryostorage e recuperação só deve ser usado como um plano de backup em caso de uma contaminação bacteriana ocorre.

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Resultados

Existem atualmente apenas 2 linhas de células sbnet estabelecidas e publicadas2,3,4,5 e elas não estão prontamente disponíveis para muitos pesquisadores. Aqui, propomos a cultura sbnet como esferoides em ECM e usar isso como um modelo alternativo para estudar a sensibilidade à droga sbnet. O tumor derivado do paciente de um sbnet que metástase ao fígado foi coletado, digerido para liberar pilha...

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Discussão

As culturas do tumor 3D tornaram-se um recurso valioso para o teste de droga pré-clínico15. Os vários e biobancos organoid do tumor foram estabelecidos recentemente dos tumores16,17do cancro da mama e de próstata. Neste estudo, nós fornecemos um protocolo detalhado à cultura sbnet como esferoides e um método simples e rápido para validar as culturas do esferóide para marcadores líquidos pela imunofluorescência e pela sensibilidade do teste...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo NIH concede P50 CA174521 (a J.R. Howe e A.M. Bellizzi). P.H. Ear é um receptor do prêmio P50 CA174521 programa de aprimoramento de carreira.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Anti-coelho FITCJackson ImmunoResearch11-095-152Acoplamento de anticorpos secundários a um fluoróforo verde
Solução de recuperação de antígenosAgilent DakoS2367Solução em pH 9 para preparação de lâminas para IHC
Autostainer Link 48Agilent DakoNão disponívelSistema automatizado para coloração de anticorpos
Recipiente de congelamento de célulasThermo Scientific5100-0001Recipiente para congelar células
CellSenceOlympus Versão 1.18Software de computador para usar microscópio fluorescente
Anticorpo de cromogranina AAbcam-45179RB-9003-POAnticorpos para IF
Anticorpo de cromogranina A (clone LK2H10)Thermo ScientificMA5-13096Anticorpos para IHC
CollagenaseSigmaC0130Enzima para digestão de tecido tumoral
DMEMGibco11965-092Meio para preparação de tecidos
DMEM/F12Gibco11320-033Meio para culturas organoides
DMSOSigmaD8418Solvente para dissolução de droga
DNAseSigmaDN25Enzima para digestão de tecido tumoral
Etídio HomodímeroChemodexCDX-E0012-T1ECorante de ligação de DNA e RNA
FBSGibco16000044Reagente para meios de cultura
Microscópio fluorescenteMicroscópio OlympusCKX35para tirar fotos de esferóides SBENT
GlutaminaGibcoA2916801Reagente para meios de cultura
ImageJNational Institutes of HealthVersão 1.51Software de computador para imagem análise
InsulinaSigmaI0516Reagente para meios de cultura
MatrigelCorning356235Matriz para incorporar e ancorar organoides
Meio de montagem (VECTASHIELD)Vector LaboratoriesH-1200Fixador para células marcadas com coloração nuclear
NicotinamidaSigma72340Reagente para meios de cultura
Microscopia Eletrônica de ParaformaldeídoSciences15710Reagente para fixar células
PEN/STREPGibco15140-122Reagente para meios de cultura
PT LinkAgilent DakoNão disponívelSistema automatizado para preparar lâminas para coloração IHC
RapamicinaAlfa AesarJ62473Medicamento que pode inibir o crescimento NET
Anticorpos secundários para IHCAgilent DakoK8000Anticorpos secundários para IHC usando anticorpo SSTR2 do sistema EnVision FLEX à base de polímero
GeneScritpA01591Anticorpos para
anticorpo IF SSTR2 (clone UMB1)Abcamab134152Anticorpos para
IHC Anticorpo sinaptofisinaAbcam32127Anticorpos para IF
Anticorpo sinaptofisina (clone DAK-SYNAP)Agilent DakoAnticorpos M7315para IHC
TritonXMallinckrodt3555 KBGEReagente para permeablizar células
Y-2763 Inibidor de ROCKAdipogenAG-CR1-3564-M005Para melhorar a viabilidade do esferóide SBNET após o congelamento e descongelamento

Referências

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Esferoides SBNETProtocolo de Cultura 3DMatriz ExtracelularMicroscopia de Imunofluoresc nciaIsolamento CelularDigest o de TecidosCitotoxicidade da RapamicinaMarcador de SinaptofisinaCromogranina A

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