Aqui, nós apresentamos um protocolo para a geração reprodutível de organóides testicular suínos com a arquitetura específica do tecido do testis usando o sistema comercialmente disponível da cultura do de micropoços.
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Artigo de método
Geração de organóides testicular porcina com a arquitetura específica do testis usando a cultura de micropoços
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os organóides são estruturas tridimensionais compostas de múltiplos tipos de células capazes de recapitular a arquitetura do tecido e as funções dos órgãos in vivo. A formação de organóides abriu diferentes avenidas de pesquisa básica e translacional. Nos últimos anos, os organóides testicular têm ganhou interesse no campo da biologia reprodutiva masculina. Os organóides testiculares permitem o estudo de interações célula-célula, desenvolvimento tecidual, e o microambiente de nicho de células germinativas e facilitam a triagem de drogas e toxicidade de alta taxa de transferência. Um método é necessário para gerar de forma confiável e regerível organóides testiculares com o testículo tecido específico arquitetura. O sistema da cultura do de micropoços contem uma disposição densa de micropoços pirâmide-dados forma. As pilhas testicular derivadas dos testículos pre-pubertal são centrifugadas nestes micropoços e cultivadas para gerar organóides testicular com a arquitetura testis-específica do tecido e as associações da pilha. Milhares de organóides homogêneos podem ser gerados através deste processo. O protocolo aqui relatado será de grande interesse para os pesquisadores que estudam a reprodução masculina.
Introdução
Nos últimos anos, houve um ressurgimento do interesse em três-dimensional (3D) organóides. Os órgãos diferentes tais como o intestine1, o estômago2, o pâncreas3,4, ofígado5, eo cérebro6 foram derivados com sucesso em sistemas organoid 3D. Estes organóides têm semelhanças arquitetônicas e funcionais com os órgãos in vivo e são mais biologicamente relevantes para o estudo do microambiente tecidual do que os sistemas de cultura monocamada7. Como resultado, os organóides testicular começaram a an....
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Protocolo
Nota: os testículos de leitões de 1 semana de idade foram obtidos de uma fazenda de suínos comercial como subproduto da castração de suínos comerciais. O sourcing de testículos foi aprovado pelo Comitê de cuidados com animais da Universidade de Calgary.
1. preparação de soluções enzimáticas para digestão tecidual
Nota: são necessárias três soluções enzimáticas diferentes, que incluem duas soluções diferentes de colagenase IV (solução A, B) e uma solução de desoxirribonuclease I (DNase I).
- Para preparar a solução a, dissolver 20 mg de colagenase IV S (tabela de materiais) e 40 mg de cola....
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Resultados
Células isoladas de 1 semana de testes porcina de idade que foram cultivadas nos micropoços autoorganizados em esferóides (Figura 1A, Figura 2), com exterior delineado e distinto (epitélio seminífero) e compartimentos interiores ( interstício) (Figura 1B, Figura 2). Os dois compartimentos foram separados por um colágeno IV+ ve.......
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Discussão
Estabelecemos um método simples que permite a geração consistente e repetível de um grande número de organóides testiculares com arquitetura tecidual que é semelhante ao testis in vivo12. Quando a aproximação foi desenvolvida usando pilhas do testis suínos, é mais extensamente aplicável também ao rato, ao primata não-humano e ao testis humano12. Um número de métodos diferentes foi relatado para produzir organóides testicular8,
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Divulgações
Dr. Ungrin tem um interesse financeiro na tecnologia AggreWell como um inventor.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por NIH/NICHD HD091068-01 a Dr. ina Dobrinski.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placa de cultura de tecidos de ultra baixa fixação de 100 mm | Corning | #CLS3262 | |
| Placa de cultura de tecidos de 100 mm | Corning | #353803 | |
| Aggrwell 400 | Stemcell Technologies | #34411 | |
| Solução de enxágue antiaderente | Stemcell Technologies | #07010 | |
| Colagenase tipo IV de Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | #C5138 | denominada colagenase IV S |
| colagenase tipo IV Worthington | Worthington-Biochem | #LS004189 | denominada colagenase IV W |
| desoxirribonuclease I do pâncreas bovino | Sigma-Aldrich | #DN25 | |
| Dulbecco» s Águia Modificada' s Médio/F12 | Gibco | #11330-032 | |
| Dulbecco' s Águia Modificada' s Média - alta glicose | Sigma-Aldrich | #D6429 | |
| Dulbecco' s Fosfato tamponado solução salina | Sigma-Aldrich | #D8537 | |
| Fator de crescimento epidérmico | R & D Systems | #236-EG | |
| Filtros de Células Falcon 70 µ m | FisherScientific | #352350 | |
| Filtros de Células Falcon 40 µ m | FisherScientific | #352340 | |
| Soro Fetal Bovino | ThermoFisher Scientific | #12483-020 | |
| Insulina-Transferrina-Selênio | Gibco | #41400-045 | |
| Penicilina-Estreptomicina | Sigma-Aldrich | #P4333 | |
| Tecido testicular suíno | Sunterra Farms Ltd (Alberta, Canadá) | ||
| Steriflip-GP Unidade de filtro superior de tubo de centrífuga estéril | Millipore | #SCGP00525 | |
| tripsina-EDTA | Sigma | #T4049 |
Referências
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the ....
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Reimpressões e permissões
