Perfil de Ubiquitin e Ubiquitin-like Modificações pós-translacionais dependentes e identificação de alterações significativas

Mirna Swayden; Aurélie Dobric; Yolande Berthois; Hugo Villalba; Stéphane Audebert; Luc Camoin; Juan Iovanna; Philippe Soubeyran

doi:10.3791/60402

É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Perfil de Ubiquitin e Ubiquitin-like Modificações pós-translacionais dependentes e identificação de alterações significativas

5.3K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/60402

⸱

7 de novembro de 2019

Mirna Swayden¹ , Aurélie Dobric¹ , Yolande Berthois¹ , Hugo Villalba¹ , Stéphane Audebert¹ , Luc Camoin¹ , Juan Iovanna¹ , Philippe Soubeyran¹

¹Aix-Marseille Univ, INSERM, CNRS, Institut Paoli-Calmettes, CRCM

Neste artigo

Resumo

Este protocolo visa estabelecer proteomas específicos de ubiquitina (Ub) e ubiquitina (Ubls), a fim de identificar alterações desse tipo de modificações pós-translacional (PTMs), associadas a uma condição específica, como tratamento ou fenótipo.

Resumo

Ubiquitina (ub) e ubiquitina-like (ubl) modificações pós-translacionais dependentes de proteínas desempenham papéis fundamentais de regulamentação biológica dentro da célula, controlando a estabilidade de proteínas, atividade, interações e localização intracelular. Eles permitem que a célula responda aos sinais e se adapte às mudanças em seu ambiente. Alterações nesses mecanismos podem levar a situações patológicas graves, como doenças neurodegenerativas e cânceres. O objetivo da técnica descrita aqui é estabelecer perfis de PTMs dependentes ub/ubls, de forma rápida e precisa, a partir de linhas celulares cultivadas. A comparação de diferentes perfis obtidos de diferentes condições permite a identificação de alterações específicas, como as induzidas por um tratamento, por exemplo. A transdução de células mediadas lentivirais é realizada para criar linhas celulares estáveis expressando uma versão de duas tags (6His e Flag) do modificador (ubiquitina ou um ubl como SUMO1 ou Nedd8). Essas marcas permitem a purificação da ubiquitina e, portanto, de proteínas ubiquitinadas das células. Isso é feito através de um processo de purificação de duas etapas: O primeiro é realizado em condições de desestruturação usando a tag 6His, e o segundo em condições nativas usando a tag Flag. Isso leva a um isolamento altamente específico e puro de proteínas modificadas que são posteriormente identificadas e semiquantificadas por cromatografia líquida seguida saqueade sem espectrometria de massa (LC-MS/MS) tecnologia. A análise de informática fácil dos dados de EM usando o software Excel permite o estabelecimento de perfis PTM eliminando sinais de fundo. Esses perfis são comparados entre cada condição, a fim de identificar alterações específicas que serão estudadas mais especificamente, começando com sua validação por técnicas de bioquímica padrão.

Introdução

O método aqui proposto é dedicado ao estudo de PTMs mediados pelos membros da família ubiquitina de células de mamíferos cultivadas, a fim de identificar potenciais alterações associadas a uma condição específica (tratamento, diferenciação, etc). Os PTMs representam o último passo da regulação das funções das proteínas^1. De fato, uma vez produzido pelas máquinas translacionais, a maioria, se não todas as proteínas, passam por diferentes tipos de PTMs que modulam sua atividade, interações moleculares e localização intracelular^1. Entre a pletora de PTMs estão os mediados pela família ubiquitinde de proteínas, ubiquitina em....