In Vitro Reconstituição de Padrões de Contato celular espacial com caenorhabditis isolado elegans embrião blastômeros e contas adesivas de poliestireno

Resumo

As complexidades dos tecidos dos sistemas multicelulares confundem a identificação da relação causal entre pistas extracelulares e comportamentos celulares individuais. Aqui, apresentamos um método para estudar a ligação direta entre pistas dependentes de contato e eixos de divisão usando blastômeros de embriões c. elegans e contas de poliestireno adesivo.

Resumo

Em sistemas multicelulares, as células individuais são cercadas pelas várias pistas físicas e químicas provenientes de células vizinhas e do meio ambiente. Esta complexidade do tecido confunde a identificação da ligação causal entre sugestões extrínsecas e dinâmica celular. Um sistema multicelular reconstituído sinteticamente supera esse problema, permitindo que os pesquisadores testem uma sugestão específica, eliminando outros. Aqui, apresentamos um método para reconstituir padrões de contato celular com caltídeos elegans elegans isolados de Caenorhabditis e contas de poliestireno adesivas. Os procedimentos envolvem remoção de casca de ovo, isolamento blastômero interrompendo a adesão célula-célula, preparação de contas adesivas de poliestireno e reconstituição do contato célula-célula ou contas celulares. Finalmente, apresentamos a aplicação deste método para investigar a orientação de eixos de divisão celular que contribui para a regulação do padrão celular espacial e especificação do destino celular no desenvolvimento de embriões. Este método in vitro robusto, reproduzível e versátil permite o estudo de relações diretas entre padrões de contato de células espaciais e respostas celulares.

Introdução

Durante o desenvolvimento multicelular, os comportamentos celulares (por exemplo, eixo de divisão) de células individuais são especificados por várias pistas químicas e físicas. Para entender como a célula individual interpreta essa informação, e como eles regulam a montagem multicelular como uma propriedade emergente é um dos objetivos finais dos estudos de morgênese. O organismo modelo C. elegans contribuiu significativamente para a compreensão da regulação celular da morgênese, como a polaridade celular^1,a divisão celular padrão^1,a decisão do destino celular^2,e regulamentos em escala de tecido, como fiação neuronal³ e organogênese^4,5. Embora existam várias ferramentas genéticas disponíveis, os métodos de engenharia de tecidos são limitados.

O método de engenharia de tecidos mais bem sucedido no estudo de C. elegans é o isolamento clássico blastômero^6; como o embrião c. elegans é cercado por uma casca de ovo e uma barreira de permeabilidade^7,sua remoção é um dos principais procedimentos deste método. Embora este método de isolamento blastômero permita a reconstituição do contato célula-célula de forma simplificada, ele não permite a eliminação de pistas indesejadas; o contato celular ainda coloca pistas mecânicas (por exemplo, adesão) e químicas, limitando assim nossa capacidade de analisar completamente a relação causal entre a sugestão e o comportamento celular.

O método apresentado neste artigo usa contas de poliestireno modificadas carboxilaquela que podem se ligar covalentemente a quaisquer moléculas reativas de amina, incluindo proteínas como ligantes. Particularmente, usamos uma forma reativa amina de Rhodamine Red-X como um ligante para fazer contas visualmente rastreáveis e adesivos para a célula. Os grupos de carboxyl de superfície de contas e grupos primários de amina de molécula de ligand são acoplados por carbodiimide solúvel em água 1-etil-3-(dimetilaminopropyl) carbodiimide (EDAC)^8,9. As contas adesivas obtidas permitem os efeitos da sugestão mecânica na dinâmica celular^10. Usamos esta técnica para identificar pistas mecânicas necessárias para a orientação da divisão celular^10.

Protocolo

1. Preparação de contas de poliestireno adesiva

NOTA: Este protocolo não requer técnica asséptica.

1. Pese 10 mg de contas de poliestireno modificadas carboxila em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
2. Para lavar as contas, adicione 1 mL de 2-(N-morpholino) ácido ethanesulfonic (MES) buffer no tubo. Uma vez que o tampão mes não contém fosfato e acetato, o que pode reduzir a reatividade da carbodiimida, é adequado para uso na reação de acoplamento de proteínas. Vortex o tubo para misturar as contas.
3. Gire o tubo para 60 s em 2.000 x g através de uma centrífuga bancada.
4. Descarte o supernatant com cuidado pipetting para fora o amortecedor.
5. Lave as contas novamente com 1 mL de buffer MES seguindo etapas 1.2-1.4.
6. Adicione 1 mL de buffer MES contendo 10 mg de EDAC no tubo para ativar os grupos de carboxyl superfície. Vortex o tubo para misturar as contas.
7. Gire e incubar o tubo por 15 min à temperatura ambiente.
8. Desça as contas para 60 s em 2.000 x g.
9. Descarte o supernatant com cuidado pipetting para fora o amortecedor.
10. Para lavar as contas, adicione 1 mL de soline tampão de fosfato (PBS) no tubo. Vortex o tubo para misturar as contas.
11. Desça o tubo para 60 s em 2.000 x g.
12. Descarte o supernatant com cuidado pipetting para fora o amortecedor.
13. Lave as contas novamente com 1 mL de PBS, seguindo etapas 1.10-1.12.
14. A concentração final de Rhodamine usado dependerá da tensão que está sendo imaged. Prepare 1 mL de 1-, 10-, 100-, e 1000 vezes série de diluição de Rhodamine Red-X a partir da solução de estoque 0,65 mM Rhodamine Red-X.
15. Pipeta 20 μL de contas em cada tubo de diluição serial.
16. Gire e incubar o tubo por 5 min à temperatura ambiente.
17. Lave as contas duas vezes com 1 mL de PBS, repetindo passos 1.10-1.12.
18. Adicione 1 mL de PBS no tubo e armazená-lo em 4 °C por até 6 semanas. Verifique a intensidade da fluorescência das contas um microscópio usado para imagens vivas. A concentração adequada do esulênio succinimidyl Rhodamine é dependente das condições de imagem (Figura 1).
    NOTA: Contas sem tratamento Rhodamine Red-X não aderem à célula. Rhodamine Red-X serve como marcador de fluorescência, bem como molécula adesiva. A interação eletroestática entre rhodamine Red-X carregada positivamente e membrana plasmática carregada negativamente é uma causa putativa de adesão.

2. Montagem da pipeta da boca

1. Corte de largura (6,35 mm de diâmetro interno) e estreito (3.175 mm de diâmetro interno) tubos Tygon para cerca de 25 cm e 40 cm de comprimento, respectivamente (Figura 2).
2. Conecte os tubos Tygon com um filtro de politetrafluoroetileno (PTFE) (0,2 μm tamanho poros) (Figura 2).
3. Desmonte um tubo aspirador comercialmente disponível e anexe seu suporte capilar e porta-voz ao final dos tubos Tygon estreitos e largos, respectivamente (Figura 2).
   NOTA: Ptfe filtro foi usado para evitar a inalação de fumos de solução de hipoclorite via pipeta boca.

3. Isolamento de blastômeros embriões

NOTA: Use luvas e jaleco para evitar o corte e contato com a solução de branqueamento.

1. Segure cada extremidade de um microcapilar (capacidade; 10 μL) com a mão direita e esquerda.
2. Puxe o microcapilar para ambas as extremidades para aplicar tensão e trazer o centro do capilar sobre um queimador para fazer dois capilares puxados à mão (Figura 3A).
3. Apare as pontas dos capilares puxados à mão com fórceps o microscópio dissecando e coloque o capilar puxado em um aparelho de pipetting boca (Figura 2). Prepare dois tipos de pipetas. Os tamanhos de abertura da ponta para as pipetas devem ser de aproximadamente 2x e 1x o comprimento curto do eixo dos embriões c. elegans (30 μm) para a transferência de embriões e remoção de casca de ovo, respectivamente Figura 3B-D).
4. Pipeta 45 μL de solução de sal de ovo em um poço de um slide multiwell(Figura 4A; inferior).
5. Coloque 5-10 c. elegans adulto em uma solução de sal de ovo bem contendo.
6. Para obter embriões adiantados de C. elegans, corte adultos em partes posicionando duas agulhas à direita e à esquerda do corpo de C. elegans e deslizando as agulhas após se (Figura 4A;esquema superior).
7. Pipeta 45 μL de solução de hipoclorocto em um poço ao lado do bem contendo solução de sal ovo(Figura 4B).
8. Pipette 45 μL do meio de crescimento de Shelton para os três poços subsequentes ao lado do poço contendo solução hipoclorite (Figura 4B).
9. Transfira embriões em estágio de 1 célula e estágio inicial de 2 células para a solução de hipocloro, atubulaçando a boca com o capilar desenhado à mão para transferência de embriões (Figura 4B).
10. Aguarde 40-55 s.
11. Lave os embriões transferindo os embriões da solução de hipoclorocto para o meio de crescimento de Shelton por tubulação bucal com o capilar desenhado à mão para transferência de embriões (Figura 4B).
12. Lave os embriões novamente, transferindo os embriões para um novo poço do meio de crescimento de Shelton por tubulação bucal com o capilar desenhado à mão para transferência de embriões (Figura 4B).
13. Transfira os embriões lavados para um novo poço do meio de crescimento de Shelton pela boca tubulação com o capilar desenhado à mão para transferência de embriões. Usando o capilar desenhado à mão para remoção de casca de ovo, repita cuidadosamente o pipetting (Figura 4C; esquema médio). Se a casca de ovo for removida com sucesso, as células embrionárias se tornarão mais esféricas(Figura 4C;à direita).
14. Separe os blastômeros embrionários em estágio de 2 células, tubulação suave e continuamente com o capilar desenhado à mão para remoção de casca de ovo (Figura 4D).

4. Reconstituição de padrões de contato com blastômero e contas

NOTA: Trabalhe o microscópio de imagem para evitar a dissociação de uma célula de uma conta e para facilitar a aquisição oportuna de imagem.

1. Para observar usando um microscópio invertido, prepare uma câmara de imagem como na Figura 5.
   1. Coloque um coverslip em um titular coverslip(Figura 5A).
   2. Fita as bordas do coverslip para estabilizá-lo. O lado com fita é o lado 'de trás' (Figura 5A,B).
   3. Vire o suporte coverslip para o lado 'frente' e desenhar um círculo no coverslip com uma caneta hidrofóbica (Figura 5C).
      NOTA: Qualquer prato com fundo de vidro também funciona, desde que os embriões são manipuláveis pela pipeta da boca.
2. Adicione o meio de crescimento de Shelton dentro do círculo desenhado pelo marcador hidrofóbico(Figura 5D).
3. Transfira o blastômero isolado para a câmara de imagens.
4. Dispense um pequeno volume de contas quimicamente funcionalizadas usando o capilar desenhado à mão para transferência de embriões.
5. Controle a posição das contas de poliestireno soprando no capilar desenhado à mão até que a conta se apega ao blastômero isolado.
6. Monte um coverslip para evitar a evaporação do meio (Figura 5E). Realizar imagens ao vivo.

5. Preparação de importantes reagentes

1. Solução de sal ovo (10 mL): Combine 235 μL de 5 M NaCl e 240 μL de 2 M KCl com 9525 μL de dH₂O.
2. Solução de Hipocloroto (10 mL): Combine 7,5 mL de Clorox (contendo aproximadamente 7,5% hipoclorite de sódio) com 2,5 mL de 10 N NaOH (concentração final de hipoclorite de sódio é de aproximadamente 5,625%).
   NOTA: Embora muitos métodos publicados tenham usado chitinase para digerir cascas de ovos chitinosos, adotamos um método usando a solução de hipoclororia¹¹. Ao evitar as variações lote-a-lote das atividades de chitinase, acreditamos que este método é uma abordagem mais reproduzível e econômica.
3. 0,81 m Inulin Solution (40 mL)
   1. Adicione 0,2 g de Inulin a 40 mL de dH₂O.
   2. Autoclave para dissolver.
      NOTA: Mantém por 1 mês a 4 °C.
4. 0,5 M MES Buffer (500 mL)
   1. Dissolva 48,81 g de MES em 400 mL de água destilada (dH₂O).
   2. Ajuste o pH para 6,0.
   3. Elevá-lo ao volume total para 500 mL com dH₂O.
5. Solução PBS (1 L)
   1. Para fazer a solução 10 vezes PBS, dissolva 1 pacote de pó pré-mix PBS em 1 L de dH₂O.
   2. Combine 100 mL de 10 vezes solução PBS com 900 mL de dH₂O.
6. 5% Polyvinylpyrrolidone (PVP) Solução (4 mL)
   1. Em condições estéreis, dissolva 0,2 g de PVP em 4 mL do Medium de Drosophila Schneider.
      NOTA: Abra sempre o estoque médio de Schneider na capa da cultura do tecido (TC). Mantenha por 1 mês a 4 °C.
7. 0,65 mM Rhodamine Solução de ações Red-X (2 mL)
   1. Pese 1 mg de Rhodamine Red-X.
   2. Adicione 2 mL de dimetil sulfoxida (DMSO) para dissolver.
   3. Aliquot e armazenar a -20 °C.
8. Shelton's Growth Medium (SGM) (10,25 mL)
   1. Em condições estéreis, combinar 8 mL de Drosophila Schneider's Medium, 1 mL de solução PVP, 1 mL de solução inulina, 1 mL de Basal Medium Eagle (BME) Vitaminas, 50 μL de Penicilina-Estreptomicina, e 100 μL de concentrado lipídico juntos.
   2. Aliquot 325 μL de SGM em microtubos de 1,5 mL.
      NOTA: Mantenha por cerca de 1 mês a 4 °C.
   3. No dia do isolamento blastômero, adicione 175 μL de Fetal Bovine Serum (FBS) ao SGM (para volume total de 500 μL).
      NOTA: Armazenar FBS em -20 °C e descongelá-lo antes do uso. Fbs não precisa ser morto pelo calor.

Resultados

Para a preparação de contas, determinamos a quantidade ideal de rhodamine Red-X succinimidyl éter para a cepa transgênica expressando GFP-miosina II e mCherry-histone (Figura 1A-D). Usamos o mCherry marcado histona como um marcador de progressão do ciclo celular. Como tanto rhodamine Red-X quanto mCherry serão iluminados por um laser de 561 nm, a intensidade ideal do sinal Rhodamine Red-X é comparável à de histona para permitir imagens simultâneas de células e contas. Por ex...

Discussão

A reconstituição de padrões simplificados de contato celular permitirá que os pesquisadores testem os papéis de padrões específicos de contato celular em diferentes aspectos da morfogênese. Usamos essa técnica para mostrar que o eixo da divisão celular é controlado pelo contato físico com contas adesivas^10. Como a especificação do eixo de divisão é crucial para o desenvolvimento multicelular, contribuindo para a morfogênese^14,divisão de células-tronco^15,

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cloridrato de 1-(3-Dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida	Alfa Aesar	AAA1080703	Para a preparação do cordão
Conjunto do tubo do aspirador	Drummond	21-180-13	Para o isolamento dos blastômeros.
Cepa Caenorhabditis elegans: N2, tipo selvagem	Caenorhabditis Genetics Center	N2	Cepa usada neste estudo
Cepa Caenorhabditis elegans: KSG5, genótipo: zuIs45; itIs37	em casa	KSG5	Cepa usada neste estudo
Mircopipets calibrados, 10 µ L	Drummond	21-180-13	Para o isolamento de blastômeros
Contas de poliestireno modificadas com carboxilato (30 µ m diâmetro)	KISKER Biotech	PPS-30.0COOHP	Para a preparação do grânulo
CD Lipid Concentrate	Life Technologies		11905031 Para o isolamento do blastômero. Trabalhe na coifa de cultura de tecidos.
Clorox	Clorox	N. A.	Para o isolamento do blastômero. Abra um novo frasco quando o tratamento com hipoclorito não funcionar bem.
Porta-lamínula	In house	N.A.	Para o isolamento do blastômero.
Microscópio de dissecação: Zeiss Stemi 508 com suporte M. A fonte de luz é LED embutido. A ampliação da ocular é de 10X.	Carl Zeiss	Stemi 508	Para o isolamento dos blastômeros.
Soro bovino fetal, qualificado One Shot, origem canadense	Gibco	A3160701	Para o isolamento do blastômero. Trabalhe na coifa de cultura de tecidos.
Uso geral e agulhas hipodérmicas de deslizamento de precisão, calibre 25	BD	14-826AA	Para o isolamento dos blastômeros
	Inulina Alfa Aesar	AAA1842509	Para o isolamento dos blastômeros
MEM Vitamin Solution (100x)	Gibco	11120052	Para o isolamento dos blastômeros.
MES (Cristais Brancos Finos)	Fisher BioReagents	BP300-100	Para a preparação do grânulo
Multitest Slide 10 Well	MP Biomedicals	ICN6041805	Para o isolamento do blastômero
PBS, Phosphate Buffered Saline, 10 x Pó	Fisher BioReagents	BP665-1	Para a preparação do grânulo
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)	Gibco	15140148	Para o isolamento de blastômeros.
Polivinilpirrolidona	Fisher BioReagents	BP431-100	Para o isolamento do blastômero
Cloreto de potássio	Bioshop	POC888	Para o isolamento do blastômero
Rodamina Red-X, éster succinimidílico, 5 isômeros	Sondas moleculares	R6160	Para a preparação do grânulo
Schneider' s Drosophila Sterile Medium	Gibco	21720024	Para o isolamento dos blastômeros. Trabalhe na coifa de cultura de tecidos.
Cloreto de Sódio	Bioshop	SOD001	Para o isolamento de blastômeros
Solução de hidróxido de sódio, 10 N	Fisher Chemical	SS255-1	Para o isolamento de blastômeros
Microscópio confocal de disco giratório: Yokogawa CSU-X1, Zeiss Axiovert osciloscópio invertido, câmera Quant EM 512, lente objetiva apocromática plana 63X NA 1.4. O sistema era controlado pelo Slidebook 6.0.	Inovação em Imagem Inteligente	N.A.	Para imagens ao vivo
Filtros de seringa, PTFE,	13100115 Basix		Para o isolamento dos blastômeros.
Tubulação do laboratório de Tygon S3, formulação E-3603, diâmetro interno 3,175 milímetros	Saint Gobain Performance Plastics	89403-862	Para o isolamento do blastômero.
Tubulação do laboratório de Tygon S3, formulação E-3603, diâmetro interno 6,35 milímetros	Saint Gobain Performance Plastics	89403-854	Para o isolamento do blastômero.

não estéreis