Aqui, apresentamos um método usando suportes de membrana permeáveis para facilitar o estudo da sinalização paracrina sem contato usada pelas células tumorais para suprimir a resposta imune. O sistema é passível de estudar o papel dos fatores tumorados no amortecimento da ativação do macrófago.
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Artigo de método
Estudando os efeitos dos ligantes paracrinos tumorais na ativação do macrófago usando a co-cultura com suportes permeáveis da membrana
Neste artigo
Resumo
Resumo
A sinalização paracrina derivada do tumor é um componente negligenciado da imunossupressão local e pode levar a um ambiente permissivo para o crescimento contínuo do câncer e metástase. Sinais paracrinos podem envolver contato célula-célula entre diferentes tipos de células, como PD-L1 expressa na superfície de tumores interagindo diretamente com PD-1 na superfície das células T, ou a secreção de ligantes por uma célula tumoral para afetar uma célula imune. Aqui descrevemos um método de co-cultura para interrogar os efeitos dos ligantes tumorais na ativação de células imunes (macrófago). Este procedimento direto utiliza suportes permeáveis de membrana de policarbonato de 0,4 μm disponíveis comercialmente e placas padrão de cultura de tecido. No processo descrito, os macrófagos são cultivados na câmara superior e as células tumorais na câmara inferior. A presença da barreira de 0,4 μm permite o estudo da sinalização intercelular sem a variável de confusão do contato físico, pois os dois tipos de células compartilham o mesmo meio e exposição a ligantes paracrinos. Essa abordagem pode ser combinada com outras, como alterações genéticas do macrófago (por exemplo, isolamento de camundongos knock-out genéticos) ou tumor (por exemplo, alterações mediadas pela CRISPR) para estudar o papel de fatores e receptores secretos específicos. A abordagem também se presta a análises biológicas moleculares padrão, como a reação em cadeia de transcrição reversa quantitativa (qRT-PCR) ou a análise de borrões ocidentais, sem a necessidade de triagem de fluxo para separar as duas populações celulares. Os ensaios imunosorventes ligados a enzimas (ELISAs) podem ser utilizados da mesma forma para medir ligantes secretados para entender melhor a interação dinâmica da sinalização celular no contexto do tipo de célula múltipla. A duração da cocultura também pode ser variada para o estudo de eventos temporalmente regulamentados. Este método de co-cultura é uma ferramenta robusta que facilita o estudo de sinais tumorais no contexto imunológico.
Introdução
Estudos recentes têm se concentrado na capacidade das células cancerosas para evitar a detecção por células imunes, suprimir a ativação imunológica local, ou para produzir um ambiente tolerogênico tumor-permissivo no microambiente tumoral. Duas classes largas de interações do tumor e da pilha imune foram descritas que facilitam estes efeitos: interações contato-mediadas ou ligands tumor-secretados. Um dos mecanismos mais bem estudados e clinicamente tratável de inibição imunológica mediada por contato utilizada por tumores é a expressão de PD-L1, que interage com PD-1 em células T para inibir sua ativação e função1,2. Em resposta ao interferon-gama (IFNγ), que é expressa por um número de células imunes ativadas, as células tumorais podem aumentar a expressão de PD-L1 para induzir a exaustão de células T ativadas por PD-1, impedindo-as de erradicar efetivamente as células tumorais3. O uso de anticorpos para bloquear a interação entre PD-L1 e PD-1 é usado atualmente para tratar vários tipos de câncer em seres humanos4. À luz desse sucesso clínico e de outros, a identificação e a segmentação de mecanismos imunossupressores derivados do tumor tem recebido cada vez mais atenção.
Além da supressão da imunidade adaptativa, os tumores também são conhecidos por secretar fatores que suprimem as respostas pró-inflamatórias das células imunes inatas. Secreções induzidas por tumores ou induzidas por tumor, incluindo IL-6, IL-10, VEGF, IL-23 e fator estimulante da colônia (CSF-1), têm sido mostrados para inibir as respostas antitumorais de células assassinas naturais (NK), gringócitos e células dendríticas no microambiente tumoral5,6,7. As células tumorais também podem secretar fatores que distorcem o recrutamento e diferenciação de células derivadas de mieloide no microambiente tumoral para promover a supressão da ativação de células T8,9.
Um tipo de célula imune inata que tem um efeito profundo sobre a progressão do tumor é o macrófago. Por muitos anos, a presença de macrófagos associados ao tumor (TAMs) tem sido usada como prognóstico negativo da sobrevida do paciente10. O conceito de que os TAMs imunossupressores amortecem a liberação de tumores mediada por células imunes foi introduzido há mais de 40 anos há11. Mais recentemente, tem sido demonstrado que o macrófago resposta pró-inflamatória pode ser desregulada, enquanto um fenótipo pró-tumor pode ser induzido no microambiente tumoral. Estes macrófagos imunossupressores podem contribuir para uma resposta tolerogênica, impulsionando a progressão do tumor e resistência à quimioterapia e imunoterapia12. Dado que os macrófagos são muitas vezes um dos leukócitos mais abundantes com o tumor, a restauração de sua atividade imunológica específica do tumor representa um alvo potencial para a terapêutica anticâncer13.
Embora as interações mediadas pelo contato entre células tumorais e macrófagos possam ser modeladas por meio da cocultura direta, o uso de suportes permeáveis da membrana pode elucidar quais fatores secretados por tumor são imunomodulatórios sem a influência potencialmente confusa do contato celular-imune ao tumor. Usando métodos um pouco semelhantes, outros demonstraram o potencial de identificar fatores secretos em interações microglia / neuronal14, bem como células tumorais com células mesoteliais15. Também usamos com sucesso essa técnica de cocultura para caracterizar o papel de uma proteína secretada por tumor, Pros1, como supressora da expressão gênica pró-inflamatória após a estimulação dos macrófagos peritoneal com LPS e interferon-gama16. Aqui descrevemos uma metodologia direta que pode ser usada para interrogar como fatores secretados por tumor podem afetar a ativação do macrófago.
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Protocolo
Todos os procedimentos relacionados à colheita e uso de macrófagos peritoneal murine foram realizados na Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill (UNC) e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da UNC (IACUC).
1. Cultura do macrófago
NOTA: Este procedimento pode utilizar macrófagos peritoneal primários (descritos em detalhes abaixo), macrófagos derivados de medula óssea ou linhas celulares de macrófagos, como J774 (ATCC) ou RAW264 (ATCC).
- Macrófagos peritoneal da colheita como descrito previamente16,17 e placa diretamente na câmara superior (s) de uma membrana do poliéster de 0.4 μm inserem a co-cultura 6 placa de poço(figura 1A).
NOTA: O rendimento aproximado dos macrófagos de cada isolamento é de 1 x 106 células no total, de modo que o número médio de células por poço é de ~1,5-1,6 x 105 células em uma placa de 6 poços. - Cultura os macrófagos colhidos no Modificado Méxio águia de Dulbecco (DMEM)/F12, 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 1x penicilina/estreptomicina, 20 ng/mL macrophage colony stimulating factor (M-CSF) por 3 dias a 37 °C, 5% CO2.
NOTA: A câmara superior contém 1 mL de meio de cultura, enquanto a câmara inferior é preenchido com 1,5 mL. O meio deve ser adicionado a cada câmara.
2. Cocultura de células tumorais com macrófagos
- Antes do uso, as pilhas comercialmente disponíveis do tumor da cultura em seus métodos médios respectivos da cultura do tecido DO ATCC-recomendado.
- Lave células tumorais aderentes uma vez com soro soro lógico amortecida de fosfato (PBS), adicione 0,05% de trippsina + ácido etilediatriáptico (EDTA) e incubada a 37 °C até que as células se seseparem. Resuspenda as células em FBS contendo médio, quantidade o número total de células usando um hemocytometer ou contador de células, e depois centrífuga por 5 min em 220 x g para pelota.
- Durante a centrífugação, aspirar o meio das câmaras superior e inferior das placas de suporte permeáveis contendo macrófagos de membrana e substituir por meio fresco.
- Para câmaras inferiores, onde as células tumorais serão banhadas, preencha com 1 mL de médio em vez de 1,5 mL para permitir o volume suficiente para adição celular.
- Aspiruais médios de células tumorais pelleted e células resuspendem no DMEM/F12 com 10% FBS, 1x penicilina/estreptomicina e 20 ng/mL M-CSF a uma concentração de 3 x 105 células/mL.
- Adicione 0,5 mL de 3 x 105 células/mL células tumorais para a câmara inferior dos poços desejados (Figura 1B).
NOTA: As células podem ser tratadas imediatamente.
3. Tratamento de células co-cultivadas
- Para induzir a expressão genética pró-inflamatória do macrófago, trate macrófagos com singly ou co-cultivadas adicionando 100 ng/mL IFNγ e 50 NG/mL LPS.
- Variar a duração dos tempos de tratamento na cultura, conforme necessário. A ativação do macrófago ocorre dentro de 2 h e alguma supressão tumor-mediada ocorre por 8 h. Co-culture para 24 h rende a supressão tumor-derivada robusta e consistente.
NOTA: Alternativamente, macrófagos podem ser induzidos a adotar um fenótipo de cura pró-ferida através da adição de fatores como interleucina-10 (IL10), e o efeito do ligand tumoralmente-secretado avaliado.
- Variar a duração dos tempos de tratamento na cultura, conforme necessário. A ativação do macrófago ocorre dentro de 2 h e alguma supressão tumor-mediada ocorre por 8 h. Co-culture para 24 h rende a supressão tumor-derivada robusta e consistente.
- Como um controle negativo, macrófagos cultura singly e deixar sem tratamento. Como um controle positivo, trate macrófagos singly cultivados com 100 ng/mL IFNγ e 50 ng/mL LPS.
4. Análise a jusante de células co-cultivadas
- Após o tempo de incubação desejado ter decorrido, isolar o lysate celular ou o meio de cultura condicionada, conforme desejado, dependendo das necessidades de teste.
- Para isolar o lysate celular para análise quantitativa de reação em cadeia de polimerase (qPCR), assaa a mídia de ambas as câmaras do poço e lave uma vez com 2 mL de PBS. Aplique o amortecedor da lyse do RNA à câmara superior que contem os macrófagos. Raspe delicadamente a membrana para liberar a lysate da pilha, e transfira a um tubo da coleção para processar mais de acordo com o protocolo do fabricante do fabricante do jogo da isolação do RNA.
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Resultados
Para determinar o efeito dos ligands tumor-secretados na polarização do macrófago, o procedimento descrito foi utilizado. Macrófagos peritoneal cultivados na ausência de células tumorais foram utilizados como negativos (não tratados = extrema esquerda) e positivo (IFNγ e LPS estimulados = 2nd da esquerda) controles (Figura 2A). Alternativamente, os macrófagos peritoneal foram co-cultivados com células tumorais de melanoma B16F10 (ATCC) (Figura 1A). Im...
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Discussão
O ensaio co-cultural apresentado aqui é uma modificação de ensaios previamente estabelecidos que permite o estudo de fatores tumorados na ativação de células imunes. Enquanto o contato célula-célula é conhecido por induzir alterações na atividade imunológica, a capacidade de ligantes tumorais para modular a ativação imunológica é menos bem compreendida. Descrevemos um método que, ao contrário da cocultura direta, pode ser usado para interrogar como fatores secretos derivados do tumor afetam a ativação de células imunes s...
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Eric Ubil foi financiado, em parte, pela American Cancer Society Postdoctoral Fellowship (128770-PF-15-216-01-LIB). O trabalho foi apoiado por uma doação do NIH (R01-CA205398) e de um prêmio da Breast Cancer Research Foundation (BCRF-18-041) ao HSE.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| B16-F10 | ATCC | ATCC CRL-6475 | |
| kit de síntese de cDNA | Promega | A3500 | |
| DMEM / F12 mídia | ThermoFisher Scientific- Gibco | 11320033 | |
| Soro Bovino Fetal | Millipore | TMS-013-B | |
| J774A.1 | ATCC | ATCC TIB-67 | |
| Lipopolissacarídeos de Escherichia coli O111: B4 | Sigma-Aldrich | L5293-2ML | |
| Murine M-CSF | Prospec | CYT-439 | |
| Penicilina-Estreptomicina (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific- Gibco | 15140122 | |
| Pros1 ELISA | MyBioSource | MBS2886720 | |
| RAW264.7 | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| Recombinante Mouse IFNγ | BioLegend | 575302 | |
| Sensimix SYBR Low-ROX kit | Bioline | QT625-05 | |
| Transwell permeável suporta | Fisher Scientific | 07-200-170 | |
| Tripsina-EDTA | ThermoFisher Scientific- Gibco | 25200056 |
Referências
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Reimpressões e permissões
