Determinação da identidade celular imune e pureza usando PCR quantitativo baseado em epigenética

Summary

Aqui descrevemos um método robusto de determinar a identidade e a pureza das células imunes através de assinaturas epigenéticas detectadas usando PCR quantitativo (qPCR). A demetilação do DNA em um lócus específico serve como um identificador exclusivo para um determinado tipo de célula e permite a identificação de células CD8+, regulatóriaou ou Th17 T.

Abstract

As frequências populacionais do subtipo das células imunes podem ter um grande efeito na eficácia das terapias celulares T. Métodos atuais, como citometria de fluxo, possuem requisitos amostrais específicos, entrada amostral alta, são de baixo throughput e são difíceis de padronizar, todos prejudiciais à caracterização de produtos de terapia celular durante seu desenvolvimento e Fabricação.

Os ensaios descritos aqui identificam e quantificam com precisão tipos de células imunes em uma mistura heterogênea de células usando DNA genômico isolado (gDNA). Os padrões de metilação de DNA são revelados através da conversão de bisulfite, um processo no qual citosinas não metiladas são convertidas em uracis. Regiões de DNA não metiladas são detectadas através da amplificação qPCR usando primers visando áreas convertidas. Um lócus único por ensaio é medido e serve como um identificador preciso para um tipo de célula específico. Os ensaios são robustos e identificam células CD8+, regulatórias e Th17 T de forma alta. Esses ensaios otimizados podem potencialmente ser usados para testes de liberação e liberação de produtos em processo e liberação de produtos para o processo de terapia celular.

Introduction

O uso de células T na imunoterapia celular aumentou significativamente na última década, especialmente com o advento da tecnologia de células T receptor de antígeno quimérico (CAR)¹. Embora as terapias baseadas em células T tenham sido recebidas com grande sucesso clínico, elas são heterogêneas e as características celulares e as identidades podem variar significativamente entre os doadores². A heterogeneidade das populações de células T pode ter grandes impactos na eficácia terapêutica e complicar conclusões de ensaios clínicos. Por essa razão, é crucial entender a heterogeneidade celular T durante a fabricação e formulação do produto para determinar as formulações ideais das imunoterapias celulares T.

Em um sentido amplo, as células T podem ser divididas em dois grupos: células T auxiliares CD4+, que secretam citocinas imunomodulatórias, e células T citotóxicas CD8+, que diretamente apresentam o antígeno cognate nas principais moléculas do complexo de histocompatibilidade (MHC) I. As células T do ajudante CD4+ podem se diferenciar de uma miríade de subconjuntos específicos que produzem um conjunto único de citocinas. Alguns sugerem que uma proporção definida de células CD4+ para CD8+ T no produto celular final maximiza em eficácia e persistência vivo, mas poderia complicar a fabricação celular³. As células T reguladoras (Tregs), um subconjunto de células T CD4+, são imunossupressoras e diminuem a ativação de células imunes. As células T regulatórias foram implicadas na mediação da tolerância ao tumor e, se presentes durante a fabricação de células CAR T, podem inibir a resposta imune antitumoral das células CAR T^4,5,6. Outros subconjuntos CD4+, como células T helper 17 (Th17) T, promovem a liberação do tumor e podem ser aproveitados para aumentar a eficácia das terapias celulares T. Assim, o aumento das células T ThD4+ é de especial interesse em ambientes tumorais sólidos, onde o aumento da produção de interleucina 17 (IL-17) promove a resposta imune antitumoral^5,7,8,9. Entender a importância das células Th17 nas respostas tumorais tem provocado mais investigações sobre estratégias para gerar essas células in vitro^7,9. Portanto, os métodos para detectar esses subconjuntos de células T são cruciais para otimizar as terapias celulares T e devem ser robustos, fáceis, escaláveis e reprodutíveis.

A citometria de fluxo é o método mais comum para determinar a identidade de uma célula imune. No entanto, a citometria de fluxo requer células vivas e intactas que devem ser analisadas no mesmo dia em que são colhidas. Para a coloração intracelular de citocina (ICS), a inibição de secreção proteica é necessária para reter citocinas dentro das células T. No entanto, diferentes compostos inibidores têm efeitos diferenciais na secreção de citocinas específicas, forçando os usuários a criar coquetéis especializados para a detecção da citocina de interesse^10,11. Além disso, a fidelidade da citometria de fluxo depende de clones de anticorpos que se ligam especificamente e poderosamente ao seu alvo. O uso de diferentes clones de anticorpos pode causar resultados variados e levar a conclusões imprecisas, tornando o método difícil de padronizar¹². Além disso, a análise dos dados coletados via citometria de fluxo e, portanto, conclusões retiradas dos dados, pode variar muito entre os usuários com base em como os portões são definidos^13,14. Por essas razões, a citometria de fluxo não é ideal para um controle preciso de qualidade durante o desenvolvimento da terapia celular.

A avaliação da metilação genômica em loci genético específico é um método alternativo de determinação da identidade celular. A justificativa para o uso da metilação de DNA para identificar tipos de células específicas foi descrita em vários artigos e se baseia em padrões específicos de metilação presentes em uma determinada população celular^15,16,17. Nas células-alvo, certos locais contêm nucleotídeos não metilados, enquanto em células não-alvo esses locais são metilados. Esse padrão pode ser detectado através da conversão bisulfite, um processo que converte exclusivamente nucleotídeos citosina não metilados (C) em uracil (U). Primers e sondas podem ser projetados contra os sites convertidos, depois amplificados e detectados através do qPCR¹⁶.

O ensaio descrito aqui mede a frequência de subtipos de células imunes dentro de populações heterogêneas, quantificando o número de loci sem metilados específicos em comparação com um gene de limpeza. Cópias dos elementos regulatórios não metilados para o gene CD8 B são medidas no ensaio CD8, FoxP3 em Treg e IL-17 em Th17 neste ensaio. Esses loci foram identificados isolando a população específica de interesse celular (por exemplo, células CD8+ T) e realizando sequenciamento bisulfite para identificar loci que não são etilantes apenas naquela célula tipo¹⁵. Primers e sondas são desenvolvidas contra os loci unicamente não metilados e as amostras são analisadas via qPCR. Uma curva padrão de números de cópias conhecidos é criada a partir de diluições de um plasmídeo padrão de número de cópia alta, permitindo a conversão de um valor Ct para um número de cópia de transcrição.

Para avaliar o desempenho do ensaio, são necessárias amostras de controle, incluindo um gDNA de referência e um plasmídeo calibrador. O material genômico de referência é uma amostra de sangue agrupada de múltiplos doadores com frequências imunocelulares conhecidas e é usado para uma verificação de desempenho de ensaio de controle de qualidade (QC). A amostra calibradora é um plasmídeo sintetizado que contém as sequências genéticas CD8, FoxP3 e GAPDH em uma razão equimolar. É usado como medida da eficiência de conversão bisulfite, pois as conversões bisulfitas dentro de diferentes regiões genômicas variam em eficiência. A proporção da meta para GAPDH dentro do calibrador é de 1, mas devido às diferenças da eficiência de conversão bisulfite, a razão pode variar. Esse fator de calibração é aplicado aos ensaios CD8 e Treg. FoxP3, o gene usado no ensaio Treg, está localizado no cromossomo X. Como este ensaio mede apenas cópias não metiladas do FoxP3, e apenas uma cópia do FoxP3 é immetilada em Tregs, este ensaio é agnóstico sexual e pode ser usado com amostras masculinas e femininas¹⁸. O ensaio Th17 não utiliza uma amostra calibradora ou GAPDH como um gene de limpeza. Em vez disso, outro conjunto de primer visando os loci metilados presentes em células não-Th17 está incluído e o número total de células é refletido pela soma das cópias metiladas e não metiladas do IL-17. Os dados obtidos do qPCR são inseridos em um modelo de análise predefinido que realiza verificações de controle de qualidade nos dados e calcula o percentual da célula-alvo dentro da população inicial. Isso fornece análise de dados automatizada e imparcial, removendo assim a subjetividade do usuário e melhorando os recursos de padronização.

Este ensaio usa gDNA, que pode ser isolado por um procedimento de leukapherese usando células cultivadas ou fixas, ou pelotas de células congeladas. A baixa exigência amostral, flexibilidade no material inicial da amostra, alta precisão e análise padronizada abordam as limitações associadas à citometria do fluxo e são ideais para fins de controle de qualidade durante o desenvolvimento do processo de terapia celular.

Protocol

Todas as amostras humanas foram obtidas de uma fonte comercial seguindo suas diretrizes para a ética da pesquisa humana.

1. Isolamento de DNA genômico

NOTA: O isolamento de DNA genômico é realizado utilizando um kit comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais) de quaisquer células hematopoiéticas, como células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMCs), células T purificadas ou qualquer outro tipo de célula hematopoiética. Neste experimento, foram utilizadas células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMCs) e células T de três doadores humanos diferentes.

1. Coloque 1-2 x 10⁶ células hematopoiéticas em um tubo cônico e centrífuga sem 400 x g por 10 min.
2. Aspirar o supernatante completamente.
3. Adicione 350 μL de lyse/tampão de ligação à amostra e incuba raste por 10 min a 55 °C.
4. Adicione 50 μL de proteinase K (20 mg/mL) a 350 μL de suspensão celular e vórtice para 30 s.
5. Adicione 50 μL de contas paramagnéticas de ligação de DNA e 400 μL de 100% isopropanol e incubar por 3 minutos à temperatura ambiente (RT).
6. Coloque o tubo em um rack magnético por 2 min e remova o supernatante, tomando cuidado para não perturbar as contas. O DNA está ligado às contas magnéticas nesta etapa.
7. Adicione 950 μL de tampão de lavagem 1. Vórtice para 30 s e repetir passo 1.6.
8. Repita o passo 1.7.
9. Adicione 950 μL de tampão de lavagem 2. Vórtice para 30 s e repetir passo 1.6.
10. Adicione 100 μL de tampão de elusão e vórtice por 2 min. Coloque o tubo em uma posição magnética por 1 min e transfira o supernatante contendo o gDNA para um novo tubo.
11. Use 1 μL do gDNA isolado das células hematopoiéticas para medir a pureza do gDNA por espectrofotometria usando um fluorímetro obtendo o OD a 260 nm, 280 nm e 230 nm. Certifique-se de que a razão de densidade óptica (razão de OD) em 260 e 280 nm esteja entre 1,7-2,0 e a razão oD em 260 e 230 nm esteja entre 1,5-2,4.

2. Preparação de amostras

1. Pré-aqueça um termomixer a 56 °C.
2. Rotular 2 tubos de mL para todas as amostras, calibrador e material de referência.
3. Diluir as amostras e calibrador com o buffer de eluição (disponível com o kit utilizado para a etapa 1) na RT.
   1. Para todas as amostras experimentais, dilua o gDNA para um volume total de 142 μL. Por exemplo, diluir 4 μL de gDNA a 100 ng/μL em 138 μL de tampão de eluição.
      NOTA: 400-1.200 ng de gDNA pode ser usado para o ensaio.
   2. Diluir 75 μL do calibrador para um volume total de 142 μL.
   3. Verifique a concentração de referência gDNA com um espectrofotômetro, usando TE (pH = 8,0) em branco.
   4. Diluir 1.000-1.200 ng da referência gDNA para um volume total de 142 μL. Por exemplo, diluir 10 μL de gDNA de referência a 100 ng/μL em 132 μL de tampão de eluição.
4. Incubar os tubos a 56 °C por 5 min a 900 rpm em um termomixer. Brevemente, gire os tubos para coletar as amostras.

3. Conversão bisulfite

NOTA: Certifique-se de que os tempos de incubação durante a conversão bisulfite sigam os tempos recomendados. A incubação excessiva ou subincubação afetará os resultados do ensaio.

1. Coloque um termomixer a 80 °C.
2. Adicione 270 μL de bisulfite de amônio e 90 μL de álcool tetrahidrofurfuryl (THFA) a todos os tubos. Vórtice para misturar completamente e brevemente as amostras para coletar o líquido na parte inferior.
3. Incubar os tubos em um termomixer a 80 °C por 45 min a 900 rpm. Se usar um bloco de calor, vórtice os tubos para 1-2 s a cada 4,5 min durante a incubação.
4. Giro brevemente as amostras e deixe esfriar para RT por 3-5 min antes de continuar com o passo 4 ou 5. O volume final deve ser de ~500 μL.

4. Ensaios CD8 e Treg

1. Purificação de DNA após conversão bisulfite
   NOTA: Esta etapa é realizada usando um kit de purificação de DNA disponível comercialmente (ver Tabela de Materiais) em DNA convertido em bisulfito. Certifique-se de que os reagentes sejam aquecidos à RT antes do uso.
   1. Antes de iniciar a purificação, crie uma mistura homogênea das contas paramagnéticas de isolamento de DNA, orvórtices para 30 s. Adicione etanol e isopropanol aos tampões de lavagem, seguindo os volumes listados nas garrafas, e defina um bloco de calor a 65 °C.
   2. Na RT, adicione 870 μL de lysis/tampão de ligação e 105 μL de contas paramagnéticas de ligação de DNA a cada tubo a partir da etapa 3.4. Vórtice para misturar completamente e brevemente girar para baixo os tubos.
   3. Adicione 570 μL de 2-propanol e vórtice para misturar completamente.
   4. Incubar os tubos na RT por 7 min a 50 rpm em um termomixer ou um misturador rotativo padrão.
   5. Brevemente, gire os tubos. Coloque os tubos no rack magnético e incuba por 5 min.
   6. Com as amostras ainda no rack magnético, remova o supernatant sem perturbar as contas.
      NOTA: O DNA está ligado às contas.
   7. Remova os tubos do rack magnético e adicione 900 μL de tampão de lavagem 1. Vortex os tubos para resuspender completamente as contas e, em seguida, girar brevemente para baixo os tubos.
   8. Devolva os tubos ao rack magnético e incuba por 3 min.
   9. Com as amostras ainda no rack magnético, remova o supernatant sem perturbar as contas.
   10. Repita as lavhes (4.1.7-4.1.9), uma vez com tampão de lavagem 1, depois duas vezes com tampão de lavagem 2.
   11. Depois de remover o supernatant, gire brevemente pelos tubos e volte ao rack magnético por 3 min.
   12. Remova todo o tampão de lavagem residual 2 e remova os tubos do rack magnético.
   13. Seque as contas com as tampas do tubo abertas a 65 °C por 15 min.
   14. Adicione 60 μL de tampão de elusão a cada tubo e incuba r$ 7 min a 1.400 rpm. Alternativamente, vórtice a uma velocidade moderada usando um adaptador de espuma.
   15. Brevemente, gire os tubos e coloque no rack magnético por 2 min.
   16. Transfira 55 μL de eluate para um novo tubo sem perturbar as contas. O eluato contém o DNA convertido por bisulfite. Medir a concentração de DNA não é necessário.
2. Configurar e executar qPCR
   1. Ligue a máquina qPCR e o computador que opera seu software.
   2. Na interface de usuário do software criar um novo experimento e selecionar qual bloco está sendo usado para executar o experimento.
   3. Selecione a Curva Padrão como o tipo de experimento.
   4. Se aplicável, selecione qual química de detecção deseja usar. Este ensaio usa os reagentes do TaqMan. Caso contrário, selecione ROX como referência passiva.
   5. Se aplicável, selecione as propriedades do instrumento executadas como Padrão.
   6. Defina seu design experimental atribuindo alvos (por exemplo, GAPDH ou CD8 com FAM como repórter), e um quencher não fluorescente.
   7. Atribua nomes de amostras para os padrões, amostras e controles.
   8. Em seguida, atribuir cada posição bem de acordo com a placa qPCR. Cada poço requer um alvo, como CD8 ou GAPDH, e um nome amostral. Cada amostra é executada em triplicado e deve ser refletida no layout da placa para o instrumento.
   9. Atribua a cada padrão o padrão de tarefa e especifique os números finais da cópia de acordo com a Tabela 1.
   10. Atribua amostras, calibrador e faça referência à tarefa Desconhecido.
   11. Designe poços para nenhum controle de modelo como NTC ou N.
   12. Prepare as diluições em série do DNA lambda (10 ng/μL) para serem usadas como padrão (ver Tabela 1).
   13. Prepare coquetéis qPCR master mix, um para o tipo de célula alvo e um para GAPDH (ver Tabela 2). Execute todas as amostras, padrões e o controle ntc em triplicado.
       NOTA: GapDH é usado para quantificar o número total de células e é executado em paralelo com a amplificação de alvos. Cópias de elementos regulatórios não metilados para o gene CD8 B são medidas no ensaio CD8, FoxP3 em Treg e IL-17 em Th17.
   14. Use uma placa de poço 96 para qPCR. Carregue 3 μL de DNA de modelo nos poços primeiro. Em seguida, carregue 7 μL da mistura master.
   15. Selar a placa com uma película qPCR e girar brevemente para baixo a placa antes de colocá-la no instrumento qPCR.
   16. Execute o qPCR como mostrado na Tabela 3.
   17. Após a conclusão do execução, exporte os dados qPCR como um arquivo .txt ou .xlsx.
   18. Analise os dados utilizando os Modelos de Análise para o ensaio CD8 e o ensaio Treg (ver Tabela de Materiais) para calcular a Média do CT, o Desvio Padrão ct e o número de cópia.

Número inicial de cópia plasmóide/3 μL	Volume	DNA diluente [1]	Número final de cópia por 3 μL	Rótulo
31250	1000 μL	-	31250	DST #1
31250	200 μL	800 μL	6250	DST #2
6250	200 μL	800 μL	1250	DST #3
1250	200 μL	800 μL	250	DST #4
250	200 μL	800 μL	50	DST #5
1250	30 μL	1200 μL	30	STD #6 [2]
[1] 10 ng/μL DNA Lambda em TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0)
[2] Use std #3 para preparar STD#6

Tabela 1: Preparação das diluições padrão. Foram preparados os padrões de diluição de 4 log, abrangendo 31250-30 cópias, de acordo com a tabela usando o DNA TE/lambda como diluente. As mesmas diluições padrão foram utilizadas tanto para CD8 quanto para GAPDH. Os padrões foram armazenados a -20 °C.

Reagentes	Quantidade
DNA Lambda (50 ng/μL em TE, pH8.0)	1 μL
Ensaio taqman	0,5 μL
Água, Nuclease-free	0,5 μL
Mix Mestre	5 μL
Total	7 μL

Tabela 2: Preparação do coquetel qPCR. Prepare o mix mestre qPCR em dois tubos separados, um para CD8 e GAPDH, excluindo o DNA do modelo de acordo com a tabela.

Passo	Tempo	Temp	Ciclos
Pré-incubação	35 min.	95°C	1X
Amplificação	15 segundos	95°C	50X
	1 min	61°C
Cooldown	5 segundos	42°C	1X

Tabela 3: qPCR executar parâmetros para o ensaio CD8 e Treg. O qPCR foi executado de acordo com os parâmetros especificados na tabela.

5. Ensaio th17

1. Purificação de DNA após conversão bisulfite
   1. Realize as etapas de purificação conforme descrito na seção 4.1.
   2. Para elutar as amostras, adicione 25 μL de tampão de elusão a cada tubo e incubar na RT por 7 min a 1.400 rpm. Alternativamente, vórtice a uma velocidade moderada usando um adaptador de espuma.
   3. Brevemente, gire os tubos e coloque em um rack magnético por 2 min.
   4. Transfira 20 μL de eluate para um novo tubo sem perturbar as contas. O eluato contém o DNA convertido por bisulfite.
2. Pré-amplificação de DNA
   NOTA: A pré-amplificação de DNA é recomendada para alvos de baixa abundância para quantificação precisa via qPCR¹⁹. O ensaio de metilação Th17 foi projetado para exigir preamplificação por essa razão.
   1. Transfira 2 μL de DNA convertido em bisulfite nos tubos de tira pcr. Crie um tubo NTC com 2 μL de água.
   2. Crie o mix mestre de pré-amplificação para todas as amostras (ver Tabela 4).
   3. Adicione 23 μL da mistura mestre a cada tubo. Encapque os tubos, vórtice, e gire brevemente pelos tubos.
   4. Execute o protocolo de pré-amplificação em um termociclo usando uma tampa aquecida. (Tabela 5). Depois que a corrida estiver completa, gire brevemente pelos tubos.
   5. Transfira 2 μL do DNA amplificado para novos tubos e adicione 78 μL de água, diluindo as amostras 1:40.
3. qPCR configurar e executar
   1. Siga a seção 4.2 para configurar e executar o qPCR.
4. Analisar dados usando o modelo de análise para o ensaio Th17 (ver Tabela de Materiais) para calcular a Média ct, desvio padrão ct e número de cópia.

Reagente	Quantidade
Água, Nuclease-free	9,5 μL
Hot Start PCR Master Mix	12,5 μL
Th17 PCR Primer	1 μL
Total	23 μL

Tabela 4: Pré-amplificar o DNA para o ensaio Th17. A mistura de mestre de reação pré-amplificação foi preparada de acordo com a tabela.

Passo	Tempo	Temp	Ciclos
Pré-incubação	35 min.	95°C	1X
Desnaturação	1 min	95°C	12X
Recozimento	45 segundos	55°C
Alongamento	30 segundos	72°C
Alongamento final	10 min.	72°C	1X
Segurar	Indefinido	4°C

Tabela 5: Pré-amplificar O DNA th17. O DNA th17 foi pré-amplificado por 12 ciclos antes do qPCR real.

Results

Todos os três ensaios de metilação começam com uma entrada de gDNA e resultam em uma porcentagem de células T CD8+, Treg ou Th17 dentro de toda a população celular. Os dados gerados a partir do qPCR após a conversão do bisulfite foram analisados utilizando-se o modelo de análise fornecido. Este modelo usou as curvas padrão obtidas a partir das amostras padrão para estimar o número de cópia das metas e contagem total de células nas amostras de teste. O tipo de célula por cento foi então calculado usando as fórmulas integradas nos modelos de análise. A Figura 1 mostra dados representativos do ensaio CD8+, obtidos a partir da análise de células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMCs) e células T de três doadores diferentes usando citometria de fluxo e o ensaio de metilação descrito. As tendências entre os dois métodos em todos os doadores em ambos os tipos de células foram semelhantes. A Figura 2 mostra dados representativos do ensaio treg. Três doadores treg purificados foram analisados usando qPCR à base de metilação e citometria de fluxo e os resultados foram traçados no gráfico mostrado. Os resultados para ambos os métodos foram relativamente semelhantes. No entanto, em todos os casos a citometria de fluxo rendeu valores mais elevados. A Figura 3 mostra a comparação das células Th17 detectadas por citometria de fluxo e metilação. Neste gráfico, há condições estimuladas e não estimuladas para os métodos experimentais. As células requerem estimulação com PMA e ionomicina e tratamento com um inibidor de transporte de proteínas para aumentar a quantidade de IL-17A presente dentro de cada célula para que possa ser detectada através de citometria de fluxo²⁰. O estado de metilação pode ser detectado independentemente do estado de estimulação. A citometria de fluxo produziu níveis mais baixos de células Th17 quando comparadas à metilação. A sensibilidade e especificidade do ensaio foi demonstrada pelo limite de valores em branco (LOB), limite de detecção (LOD) e limite de valores de quantitação (LOQ) exibidos na Tabela 6.

Figura 1: Comparação de fluxo e metilação de percentuais CD8+ para PBMCs e células T para três doadores diferentes. PbMCs e células T de três doadores diferentes foram redigidos pelo percentual de células T CD8+ em toda a população usando citometria de fluxo ou metilação. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figura 2: Comparação de fluxo e metilação de percentuais de Treg para Treg purificado para três doadores diferentes. As células Treg purificadas foram revidadas para a porcentagem de células Treg em toda a população usando citometria de fluxo ou metilação. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figura 3: Comparação de fluxo e metilação de 17 percentuais para grupos experimentais estimulados e não estimulados. Células T estimuladas e não estimuladas foram analisadas utilizando citometria de fluxo e metilação. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Ensaio	Lob	Lod	Loq
CD8	0	19	52
Gapdh	0	7	21
FoxP3	0	3	12
Th17 TpG	0	35	73
Th17 CpG	0	38	73

Tabela 6: LoB, LoD, LoQ de números de cópia para ensaios baseados em metilação. Sensibilidade e especificidade do ensaio é detalhado pelos valores lob, LoD e LoQ obtidos pelas diretrizes miqe^21,22. Em geral, apenas 40 cópias podem ser detectadas com precisão por esses ensaios.

Discussion

Com o advento de novas imunoterapêuticas, há a necessidade de métodos padronizados de detecção de identidade e pureza das células imunes. Os métodos de avaliação para testes de teste em processo e liberação robustos, validados e escaláveis permanecem a serem estabelecidos e representam um grande desafio para a comercialização de terapias à base de células. Embora a citometria de fluxo seja atualmente o método mais comum para fenotipagem celular imune, a alta qualidade da amostra e os requisitos de quantidade dificultam o uso regular. Além disso, a implementação da citometria de fluxo em um ambiente de boa prática de fabricação (GMP) é limitada por estratégias de gating dependentes de operadores e a exigência de padrões de referência para cada marcador utilizado^13,14. Embora a gating automatizada tenha sido demonstrada para melhorar a robustez de ensaio, ainda não é uma estratégia de controle de qualidade bem estabelecida. Embora o perfil de expressão genética também possa ser usado para caracterizar a identidade e a pureza do produto da terapia celular, os dados são semiquantitativos e intensivos em mão-de-obra. Além disso, o RNA e o microRNA são relativamente menos estáveis que o DNA e podem contribuir para a falta de resultados robustos e reprodutíveis. Assim, utilizar o estado epigenético de metilação do DNA de um lócus específico fornece um método estável, fácil de executar, robusto e escalável de identificar e quantificar um tipo de célula de interesse.

A detecção de padrões de metilação para células fenótipo baseia-se em três passos críticos: Primeiro, o ensaio requer o uso de gDNA, que é isolado de acordo com os métodos descritos. O DNA de alta qualidade é necessário e, se não for utilizado, a conversão bisulfita pode ser afetada^23,24. Se o DNA de baixa qualidade for obtido, recomenda-se uma maior purificação para garantir a confiabilidade do ensaio. Em segundo lugar, é necessária a conversão bisulfita bem sucedida da citosina não metilada ao uracil. O passo mais crítico na conversão bisulfite é a desnaturação de DNA^23,25. A desnaturação de alta temperatura utilizando bisulfite de amônio, ao contrário do bisulfito de sódio, aumenta a eficiência e consistência da conversão e é o processo recomendado para esses ensaios^25,26. Os usuários devem garantir que a reação ocorra a 80 °C e que a mistura de amostras seja feita com frequência. Por essas razões, recomenda-se um termomixer digital (ver Tabela de Materiais). Em terceiro lugar, a técnica adequada de pipetagem deve ser seguida durante a preparação qPCR. Três réplicas técnicas são necessárias durante a reação qPCR para aderir às informações mínimas para publicação de diretrizes quantitativas de PCR em tempo real (MIQE)²⁷. A inclusão de réplicas mais técnicas é aceitável, mas não necessária. Técnica de pipetagem inadequada e/ou não incluir réplicas técnicas levará a resultados qPCR não confiáveis.

Se os passos críticos forem seguidos e os resultados desejados ainda não forem obtidos, vários controles dentro do ensaio podem ser aproveitados para identificar o problema. A conversão bisulfita adequada é o passo mais crucial neste ensaio. A conversão bisulfita inadequada seria destacada por um fator de calibração falhado e/ou valores de referência calculados pelo modelo de análise. Se a conversão bisulfite fosse realizada incorretamente (por exemplo, se a reação fosse realizada na RT), não haveria amplificação durante o qPCR. Além disso, não seria observada amplificação se um erro fosse cometido durante a preparação de reação qPCR (por exemplo, se o mix mestre qPCR não fosse adicionado). Essas duas questões podem ser separadas investigando as amostras padrão. A amplificação nas amostras padrão, mas não a referência, calibradora e amostras experimentais, indicaria que a conversão bisulfita não foi realizada corretamente. Nenhuma amplificação em nenhuma das amostras indicaria que o qPCR não foi realizado corretamente.

Embora este ensaio atenda à rigorosa exigência de amostra e variabilidade da análise associada a outros métodos de fenotipagem, especificamente a citometria de fluxo, existem limitações que devem ser notadas. Este ensaio tem como alvo um único lócus que é usado como identificador único para a célula-alvo, que proíbe a análise multiplexada que é comumente realizada com citometria de fluxo. Isso dificulta a identificação de tipos de células complexas como o Th17. No entanto, o uso de padrões de metilação em um único lócus tem se mostrado um marcador fenocópico preciso de múltiplas células e tem sido usado em múltiplos ensaios clínicos^15,16. Isso é verdade especialmente em Tregs, onde avaliar assinaturas de metilação FOXP3 é um método preciso e inequívoco para detectar verdadeiros Tregs de células expressas transitórias foxp3²⁸. A perda da análise multiplexada é compensada pela precisão dos loci interrogados. Iterações futuras do ensaio podem incluir vários corantes qPCR e quenchers para permitir a detecção de loci múltiploem em uma reação qPCR.

Este ensaio pode ser usado como um método alternativo para citometria de fluxo na determinação do fenótipo celular e identidade. Deve-se notar que este ensaio não rende os valores exatos que a citometria de fluxo faz (Figuras 1-3). Isso se deve, em parte, à variabilidade da análise de dados associada à citometria de fluxo. Dependendo da estratégia de gating, os resultados da citometria do fluxo podem variar significativamente. Este é especialmente o caso quando se utiliza protocolos complexos de coloração para olhar para metas intracelulares, como o IL-17, onde o coeficiente de variação (CV) pode chegar a 15%^{de 14}. Entre vários usuários, o ensaio apresentado consistentemente tinha um CV de <15%, suportando a robustez do ensaio e melhores capacidades de padronização. As maiores diferenças entre fenotipagem epigenética e baseada em citometria de fluxo são vistas quando a estimulação celular é necessária(Figura 3). A detecção de células Th17 via citometria de fluxo foi realizada utilizando-se um protocolo comum para estimulação celular T e coloração de citocina intracelular^29,30,31. As diferenças observadas na fenotipagem de Th17 entre medição epigenética e citometria de fluxo podem ser devido à cinética da produção il-17. Enquanto as assinaturas de metilação são estáveis, a produção de proteínas leva tempo e deve estar presente em quantidades suficientes para ser detectada por anticorpos fluorescentes^20,32. A incubação de 6 h com inibidor de transporte proteico e coquetel de estimulação celular pode precisar ser estendida para ver o nível das células Th17 detectadas através de métodos de fenotipagem epigenética. Mais estudos são necessários para determinar a razão exata pela qual os valores não correspondem e determinar o método de fenotipagem mais preciso.

Neste relatório, detalhamos como identificar e quantificar tipos de células imunes em uma mistura heterogênea de células de forma simples e robusta. Os ensaios são projetados e otimizados para uso potencial para testes em processo e liberação de terapêuticas baseadas em células. Os ensaios descritos atendem à exigência de que matérias-primas altamente qualificadas sejam utilizadas em aplicações de terapia celular. Ao abordar as deficiências da citometria de fluxo e outros métodos moleculares, como estabilidade, requisitos amostrais, estimulação prévia, permeabilização celular para coloração intracelular e subjetividade da análise de dados, os ensaios descritos estão em linha com os objetivos de comercialização de terapias à base de células.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubos Eppendorf Safe-Lock de 2,0 ml Modelo de	Eppendorf	22363344
para ensaio			Clique aqui
Modelo de análise para ensaio			Th17Clique aqui
Modelo de análise para ensaio			Clique aqui
Attune NxT Citômetro de foco acústico, azul/vermelho/violet6/amarelo	Thermo Fisher Scientific	A29004
CTS PureQuant CD8+ Ensaio de células T	Thermo Fisher Scientific	A43674
CTS PureQuant Th17 Ensaio	Thermo Fisher Scientific	A43676
CTS PureQuant Treg Assay	Thermo Fisher Scientific	A43675
Dynabeads SILANE Kit de DNA genômico	Thermo Fisher Scientific	37012D	Usado para isolamento e purificação de DNA genômico após conversão de bissulfito. Contém tampão de eluição para diluir amostras.
Ímã DynaMag-2	Thermo Fisher Scientific	12321D	Usado como um rack magnético durante o isolamento e purificação do DNA
Kit de fenotipagem de células T humanas essenciais da eBioscience Kit de fenotipagem de células T humanas essenciais da eBioscience Kit de fenotipagem	Thermo Fisher Scientific	A42923
eBioscience Essential Human Th1/Th17 Kit de fenotipagem	Thermo Fisher Scientific	A42927
eBioscience Essential Human Treg	Kit Thermo Fisher Scientific	A42925
Eppendorf SmartBlock 2 mL	Eppendorf	5362000035
Eppendorf ThermoMixer C	Eppendorf	5382000023
HulaMixer Misturador de amostras	Thermo Fisher Scientific	15920D	Misturador de amostras recomendado
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific	ND 1000
Antiaderente, Microfífuga sem RNase Tubos, 1,5 mL	Applied Biosystems	AM12450
QuantStudio 12S Flex	Applied Biosystems	4470661
TE, pH 8,0, sem RNase	Thermo Fisher Scientific	AM9849
Misturador de Vórtice	Thermo Fisher Scientific	H2KT17113