Artigo de método

Analisando o Transporte Mitocondrial e a Morfologia em neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos em Paraplegia Espástica Hereditária

DOI:

10.3791/60548

⸱

9 de fevereiro de 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, University of Illinois College of Medicine Rockford, 2Department of Bioengineering, University of Illinois at Chicago, 3MD Program, University of Illinois College of Medicine Rockford

Neste artigo

Resumo

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Transporte mitocondrial prejudicado e morfologia estão envolvidos em várias doenças neurodegenerativas. O protocolo apresentado usa neurônios cerebrais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas para avaliar o transporte mitocondrial e a morfologia em paraplegia espástica hereditária. Este protocolo permite a caracterização do tráfico mitocondrial ao longo de axônios e análise de sua morfologia, o que facilitará o estudo de doenças neurodegenerativas.

Resumo

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Os neurônios têm intensas demandas por alta energia para apoiar suas funções. O transporte mitocondrial prejudicado ao longo de axônons tem sido observado em neurônios humanos, o que pode contribuir para a neurodegeneração em vários estados da doença. Embora seja desafiador examinar a dinâmica mitocondrial nos nervos humanos vivos, tais paradigmas são fundamentais para estudar o papel das mitocôndrias na neurodegeneração. Descrito aqui está um protocolo para analisar o transporte mitocondrial e a morfologia mitocondrial em axônios de neurônios cerebrais provém derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs). Os iPSCs são diferenciados em neurônios glutamatergicos telencefálicos usando métodos bem estabelecidos. Mitocôndrias dos neurônios estão manchadas com MitoTracker CMXRos, e o movimento mitocondrial dentro dos axônons os axônolos são capturados usando um microscópio de imagem de células ao vivo equipado com uma incubadora para a cultura celular. Imagens de lapso de tempo são analisadas usando software com plugins "MultiKymograph", "Bioformat importer" e "Macros". Kymographs do transporte mitocondrial são gerados, e velocidade mitocondrial média nas direções anteroras e retrógradas é lida a partir do kymograph. Em relação à análise mitocondrial de morfologia, o comprimento mitocondrial, a área e a proporção são obtidos usando o ImageJ. Em resumo, este protocolo permite a caracterização do tráfico mitocondrial ao longo de axônios e análise de sua morfologia para facilitar estudos de doenças neurodegenerativas.

Introdução

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A motilidade mitocondrial e a distribuição desempenham um papel vital no cumprimento de demandas energéticas variáveis e especializadas em neurônios polarizados. Os neurônios podem estender axônhons extremamente longos para se conectar com metas através da formação de sinapses, que exigem altos níveis de energia para correntes ca2+ e íons. O transporte de mitocôndrias de soma para axônomon é fundamental para suportar a função axonal e sináptica dos neurônios. O movimento mitocondrial espacial e temporalmente dinâmico é conduzido pelo transporte axonal rápido a taxas de vários micrômetros por segundo1.

Especificamente, proteínas motoras ou adaptantes, como cinesesina e dynein, participam do transporte rápido de organela ao longo de microtúbulos para controlar o movimento das mitocôndrias2,3. A atividade neuronal normal requer transporte adequado de mitocôndrias recém-montadas da soma neuronal ao axôlo distal (transporte axonal anterogrado) e transporte reverso de mitocôndrias do axôlo distal de volta ao corpo celular (transporte retrógrado). Estudos recentes indicaram que a alocação mitocondrial inadequada está fortemente associada a defeitos neuronais e doenças degenerativas do neurônio motor4,5. Portanto, para dissecar o papel das mitocôndrias na neurodegeneração, é importante estabelecer métodos para examinar o movimento mitocondrial ao longo de axôlos nas culturas vivas.

Existem dois desafios principais na análise e análise do rastreamento das mitocôndrias: (1) identificar mitocôndrias do fundo em cada quadro, e (2) analisar e gerar as conexões entre cada quadro. Na resolução do primeiro desafio, uma abordagem de rotulagem de fluorescência é amplamente utilizada para distinguir mitocôndrias do fundo, como o tinante MitoTracker ou transfecção de proteína mitocondrial com fluorescência (por exemplo, mito-GFP)6,7,8. Para analisar a associação entre quadros, vários algoritmos e ferramentas de software foram descritos em estudos anteriores9. Em um artigo recente, os pesquisadores compararam quatro ferramentas automatizadas diferentes (por exemplo, Volocity, Imaris, wrMTrck e Difference Tracker) para quantificar o transporte mitocondrial. Os resultados mostraram que, apesar das discrepâncias no comprimento da pista, do deslocamento mitocondrial, da duração do movimento e da velocidade, essas ferramentas automatizadas são adequadas para avaliar a diferença de transporte após o tratamento10. Além dessas ferramentas, um plugin integrado "Macros" para ImageJ (escrito por Rietdorf e Seitz) tem sido amplamente utilizado para analisar o transporte mitocondrial11. Este método gera kymogramas que podem ser usados para analisar o movimento mitocondrial, incluindo velocidade em direções anteroras e retrógradas.

Mitocôndrias são organelas altamente dinâmicas que mudam constantemente de número e morfologia em resposta a condições fisiológicas e patológicas. Fissão mitocondrial e fusão regulam firmemente a morfologia mitocondrial e a homeostase. O desequilíbrio entre fissão mitocondrial e fusão pode induzir redes mitocondriais extremamente curtas ou longas, que podem prejudicar a função mitocondrial e resultar em atividades neuronais anormais e neurodegeneração. Transporte mitocondrial prejudicado e morfologia estão envolvidos em várias doenças neurodegenerativas, como doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington e paraplegia espástica hereditária (HSP)12,13,14,15. HSP é um grupo heterogêneo de distúrbios neurológicos herdados caracterizados pela degeneração do trato corticorrâmdia e subsequente falha no controle dos músculos dos membros inferiores16,17. Neste estudo, neurônios cerebrais derivados do IPSC são usados para avaliar transporte mitocondrial e morfologia em HSP. Este método fornece um paradigma único para examinar a dinâmica mitocondrial de axônsão neuronal em culturas vivas.

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Protocolo

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1. Geração de neurônios glutamatergicos telencefálicos de iPSCs

NOTA: O protocolo detalhado para a manutenção dos iPSCs e sua diferenciação em neurônios glutalicos telencefálicos são semelhantes aos descritos anteriormente18. Aqui, o processo crítico durante a diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas é introduzido e destacado.

  1. IPSCs culturais em alimentadores de fibroblasto embrionário de camundongos (MEF) em meio de células-tronco embrionárias humanas (hESC) suplementadas com fator de crescimento do fibroblasto (bFGF, 4 ng/mL).
  2. Após a incubação com dispase (1 mg/mL) por 3 min, dissociam os iPSCs em pequenos aglomerados. Em seguida, a cultura do IPSC agrega em suspensão no meio do HESC por 4 dias. Consulte este ponto de tempo, quando as iPSCs começam como a cultura de suspensão, como dia 1 (D1). Troque o meio-dia por 4 dias.
  3. Na D5, colete os agregados do IPSC após centrífuga em 200 x g por 2 min e cultura em mídia de indução neural (NIM) por 3 dias. Cultura a célula agrega em suspensão por 3 dias mudando metade da mídia a cada 2 dias. Adicione DMH-1 (2 μM) e SB431542 (2 μM) ao meio NIM para aumentar a eficiência da indução neural.
  4. Na D8, colete os agregados do iPSC após centrífuga em 200 x g por 2 min e deixe-os aderir a 6 placas de poço (cerca de 20-30 agregados por poço da placa) culturing em NIM com 10% FBS (ou com placas revestidas de laminin) durante a noite. No dia seguinte, remova o velho meio e mude para NIM a cada 2 dias até d17.
    NOTA: Observa-se neste período a geração de células neuroepiteliais, indicadas pela formação de células colunas com estruturas de roseta.
  5. Na D17, isolar mecanicamente as células neuroepiteliais no centro das colônias (decolando diretamente aplicando uma pequena pressão ao centro das colônias) ou enzimáticamente (tratadas com dispase). Transfira as células neuroepiteliais isoladas para o frasco t25 de cultura tecidual não tratada contendo 8 mL de NIM com adição de B27 (1x), cAMP (1 μM) e IGF (10 ng/mL).
    NOTA: A cultura de suspensão permite que as células formem neuroesferas enriquecidas com progenitores neurais de projeção cortical.
  6. Após o D35, coloque as neuroferas na poli-ornithine e sem LDEV fator de crescimento reduzido matriz de membrana de porão(Tabela de Materiais) revestido de 35 mm pratos inferiores de vidro de 35 mm para gerar neurônios glutamatergicos telencefalilicos (neurônios de projeção cortical). Antes de chapeamento, dissociar as neuroesferas a pequenos aglomerados incubando com 1 mg/mL solução de desprendimento celular por 2 min a 37 °C.
  7. Remova a solução de desprendimento celular por centrífuga e resuspenda em 1 mL de meio de diferenciação neural (NDM). As células da placa no prato inferior do vidro (cerca de cinco clusters em 100 μL de média por prato) para deixá-las anexá-las. Em seguida, adicione NDM (1 mL por prato) e cultura as células em NDM contendo B27 (1x), cAMP (1 μM), IGF (10 ng/mL), hBDNF (10 ng/mL) e GDNF (10 ng/mL).
    NOTA: Pequenos aglomerados são banhados porque sobrevivem bem e dão origem a neurônios de projeção longas. Alternativamente, as células podem ser dissociadas e banhadas a uma densidade em torno de 20.000 células por prato para melhor separação.
  8. Caracterize os neurônios glutamatergicos telencefálicos, imunostainando os marcadores Tbr1 e βIII-tubulina.

2. Exame do transporte mitocondrial ao longo de axôngulas de neurônios glutalicostel

  1. Aqueça o NDM e ligue a incubadora para o microscópio de fluorescência fixado a 37 °C e 5% de CO2.
  2. Para visualizar mitocôndrias ao longo dos axônios de neurônios cérebros, incubar os neurônios com corante fluorescente vermelho de 50 nM para manchar mitocôndrias em células vivas (por exemplo, MitoTracker CMXRos) em NDM por 3 min a 37 °C. Em seguida, lave células 2x com NDM aquecido. Os neurônios são incubados no NDM.
  3. A fim de registrar o transporte mitocondrial ao longo dos axônses, tire imagens de lapso de tempo do movimento mitocondrial usando o objetivo de 40x com um microscópio de fluorescência.
    NOTA: Para estabilizar a cultura, realize a imagem de células vivas quando as células forem incubadas na incubadora por 20 min após a coloração mitocondrial.
  4. Em campo de fase, identifique os axôons com base em características morfológicas (emergem diretamente do corpo celular neuronal, neuritas longas constantes constantes constantes sem ramificação). Mitocôndrias se movem em anterogrados (do corpo celular ao axôlo distal) e direções retrógradas (do terminal axonal ao corpo celular). Para distinguir a direção do movimento mitocondrial ao longo dos axôngos, identifique claramente os corpos celulares dos neurônios. Nesta etapa, concentre-se axons em campo de fase para reduzir o fotobranqueamento.
  5. Depois de distinguir o corpo celular e o axôlo, ajuste o tempo de exposição e o foco das mitocôndrias em axôngos. Em seguida, capture o transporte de mitocôndrias dentro de axônons a cada 5 s por uma duração total de 5 minutos, rendendo 60 quadros. Capturar aleatoriamente pelo menos cinco locais para cada prato e repetir 3x para cada grupo.

3. Análise de dados do transporte mitocondrial e morfologia em neurônios corticais

NOTA: Analise os dados coletados sobre o transporte mitocondrial usando um software de análise de imagem (por exemplo, ImageJ ou MetMorph19). Como o ImageJ está prontamente disponível, realize a análise do transporte mitocondrial e da morfologia usando ImageJ com o MultiKymograph, Macrose Analisar plugins de partículas.

  1. Analisando o transporte mitocondrial usando ImageJ
    1. Depois de capturar as imagens de lapso de tempo da motilidade mitocondrial, analise a velocidade e o movimento das mitocôndrias usando o plugin MultiKymograph. As imagens são salvas como arquivos de formato .tiff, que são analisados pelo software Fiji seguindo um método relatado anteriormente20.
    2. Baixe o software Fiji. Baixe plugins que serão necessários para analisar a velocidade de movimento mitocondrial a partir de kymographs. Baixe o Pacote de Bioformatos e o Plugin Kymograph junto com estes quatro plugins de classe ., incluindo: MultipleKymograph.class, MultipleOverlay.class, StackDifference.class e WalkingAverage.class (Tabela de Materiais). Mova esses arquivos para a pasta de plugins Fiji. Baixe plugins "tsp050706.txt" para a pasta plugins. Reinicie o software Fiji quando os arquivos forem movidos para a pasta plugins.
    3. Abra o software Fiji. Escolha pluginse, em seguida, importe imagens da série .tiff através do Importador de Bioformatos em Bioformatos. Certifique-se de escolher o Standard ImageJ na visualização stack,escolha Abrir todas as séries,verificar a escala automática,e clique em OK. Anote o número do quadro e o tamanho das imagens em pixels, que são exibidos na parte superior da imagem.
      NOTA: Pegue 60 quadros por imagem.
    4. Considere tornar as imagens mais claras ajustando brilho/contraste o menu Image para todos os 60 quadros.
    5. Clique com o botão direito de escolher a linha segmentada e desenhar uma linha segmentada a partir do corpo celular e terminando no axôlo terminal. Gere o kymograph escolhendo multiplekymograph plugins. A seleção da largura da linha é solicitada após a escolha do MultipleKymograph. Certifique-se de que este é um número estranho. Escolha 1 para a largura da linha. Um kymograph é gerado após esta etapa.
      NOTA: Várias informações importantes podem ser lidas a partir do kymograph. O eixo Y do kymograph é o tempo de duração (5 min) para os 60 quadros. O eixo X representa a posição dos axônses selecionados.
    6. Use uma linha diagonal no kymograph para determinar a direção de movimento das mitocôndrias (anterogrados, retrógradas ou estáveis). Por exemplo, uma linha descendo para a direita ao longo do eixo Y indica movimento anterogrado, e uma linha descendo para a esquerda ao longo do eixo Y indica movimento retrógrado. Uma linha vertical indica que não houve movimento na mitocôndria.
    7. Meça a distância, os valores de tempo e a velocidade para as mitocôndrias em movimento usando o plugin Macros no software Fiji. Vá para Plugins | Macros | Instalação | tsp050607.txt. Desenhe uma linha segmentada sobre o traço do movimento mitocondrial no kymograph, e sempre desenhe a linha da região superior para inferior (eixo y).
    8. Depois de desenhar a linha, vá para Plugins | Macros | ler velocidades de tsp. Uma vez que uma linha segmentada ao longo do traço é traçada, o plugin lê velocidades segmentadas correspondentes à linha.
      NOTA: A unidade para todos os dados são pixels. soma dy é o tempo consumido a partir do ponto de partida, e a soma dx indica a distância da mitocôndria movendo-se no eixo x. dy agora e dx agora mostra o tempo de período e distância de movimento para cada segmento, respectivamente. velocidade real mostra a velocidade para cada segmento (dx agora/dy agora). velocidade média indica a velocidade média para o movimento mitocondrial (soma dx/soma dy).
    9. Altere a unidade do dx agora de pixel para μm como a razão de pixel em μm medindo a barra de escala. Converta a unidade para distância de pixel para μm medindo barras de escala em imagens. Use a ferramenta de linha para desenhar uma linha ao longo da barra de escala e medir o comprimento da linha, opte por Medir" em "Analisar. Mude o tempo de pixel para segundos, como 1 pixel = 5 segundos neste experimento.
    10. No arquivo de planilha, calcule a velocidade média e rotule correspondentemente o movimento retrógrado ou anterogrado. Média da velocidade de movimento anterogrado ou retrógrada.
    11. Determine a porcentagem de mitocôndrias estacionárias e motiladas do kymograph. As mitocôndrias móveis anterores ou retrógradas são definidas como movendo 5 μm para frente ou para trás da origem durante todo o período21. Mitocôndrias são consideradas estacionárias se não se moverem mais de 5 μm durante os 5 min.
  2. Análise da morfologia mitocondrial usando ImageJ
    NOTA: Determine a morfologia mitocondrial medindo o comprimento, área e a proporção usando imageJ. Para isso, siga os passos abaixo.
    1. Para analisar o comprimento e a área mitocondriais dentro dos axônhons, baixe o plugin Straighten_.jar do site ImageJ (ver Tabela de Materiais)e mova-o para a pasta de plugins. Reiniciar o software ImageJ.
    2. Abra a imagem através da função aberta em Arquivo e converta a imagem de 32 bits em 8 bits usando Type under Image.
    3. Desenhe uma linha segmentada ao longo dos axônhons. Escolha endireitar plugins e definir 50 pixels para largura de filamento/linha wide. Isso vai gerar um axôlo endireito.
    4. Ajuste o limiar imagem e defina a medida em Analisar escolhendoÁrea | Perímetro | Fit elipse | Descritores de forma.
    5. Meça a barra de escala usando a função da linha e defina a escala em Analisar preenchendo a distância em pixel, saiba distânciae a unidade de comprimento. Em seguida, escolha a Global para definir essa configuração de escala.
    6. Use analisar partículas em Análise para determinar a área. Os parâmetros imediatos são tamanho (pixel^2) = 0,20-infinito, circularidade = 0,00-1,00, e mostram = elipses. Escolha os resultados do Display.
      NOTA: A medição produzirá os resultados de múltiplos parâmetros de morfologia mitocondrial, incluindo área, perímetros, comprimento (maior), largura (menor) e proporção (AR). O número mitocondrial correspondente também está listado.
    7. Calcule o número mitocondrial por axôlo (μm) usando o número mitocondrial dividido pelo comprimento axonal.

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Resultados

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Aqui, os iPSCs humanos foram diferenciados em neurônios glutamatergicos telencefálicos, caracterizados por imunomanchas com marcadores tbr1 e βIII de tubulina(Figura 1A). Para examinar o transporte axonal de mitocôndrias, essas células foram manchadas com corante fluorescente vermelho, e a imagem de lapso de tempo foi realizada. Como o ImageJ está prontamente disponível e mais fácil de obter, o transporte mitocondrial foi ainda mais analisado com os plugins ImageJ "MultiKymo...

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Discussão

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Este artigo descreve um método para analisar o transporte mitocondrial e a morfologia em axônios neuronais usando corante fluorescente vermelho e software ImageJ, ambos fornecem uma plataforma única para estudar degeneração axonal e morfologia mitocondrial em doenças neurodegenerativas. Existem vários passos críticos no protocolo, incluindo a coloração de mitocôndrias, imagens de células ao vivo e análise das imagens. Neste método, um corante fluorescente foi usado para manchar mitocôndrias. Uma vez que os neurônios huma...

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Divulgações

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Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pela Fundação Paraplegia Spastic, fundação Blazer e o NIH (R21NS109837).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Solução de Desprendimento Celular AccutaseTecnologias Celulares InovadorasAT104
Capuz de BiossegurançaThermo Scientific1300 SÉRIE A2
Albumina de soro bovino (BSA)SigmaA-7906
Fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF)Peprotech450-02
CentrífugaThermo ScientificSorvall Legend X1R/
LamínulasChemiglass Life Sciences1760-012
AMP Cíclico (cAMP)Sigma-AldrichD0627
DispaseGibco17105-041
DorsomorfinaSelleckchemS7146
Meio de águia modificado de Dulbecco com mistura de nutrientes F12 (DMEM / F12)Corning10-092-CV
FBSGibco16141-002
Fator de crescimento de fibroblastos 2 (FGF2, bFGF)Peprotech100-18B
Geltrex Fator de crescimento reduzido sem LDEV Matriz de membrana basalGibcoA1413201
Gem21 NeuroPlex Suplemento sem soroGemini400-160
Pratos com fundo de vidroMatTekP35G-0.170-14-C
Pipetas de vidro de 9 ''VWR14673-043
Fator neurotrófico derivado da glia (BDNF)Sigma-AldrichD0627
GlutaMAX-IGibco35050-061
HeparinaSigmaH3149
Fator de crescimento de insulina 1 (IGF1)InvitrogenM7512
Knockout Serum ReplacerGibcoA31815
LamininSigmaL-6274
2-MercaptoethanolSigmaM3148-100ML
MitoTracker CMXRosInvitrogenM7512
Meio neurobasalGibco21103-049
Aminoácidos não essenciaisGibco11140-050
N2 NeuroPle Sem soro SuplementoGemini400-163
Microscópio Olympus IX83OlympusIX83-ZDC2
PBSCorning21-031-CV
Microscópio de contraste de faseOlympusCKX41 / IX2-SLP
Placas de 6 poçosCorning353046
placas de 24 poçosCorning353047
Bromidrato de poli-L-ornitina (poliornitina))Sigma-AldrichP3655
SB431542Stemgent04-0010
Sistema de Filtração a Vácuo Descartável Estéril 50ml 0.22 μ m Millipore Express® Plus MembranaMilliporeSCGP00525
Stericup 500/1000 ml Durapore 0,22 μ M PVDFMilliporeSCGVU10RE
anticorpo Tbr1 (1:2000)ChemiconAB9616
Inibidor de tripsinaGibco17075029
tubos de 50 mlPhenixSS-PH50R
tubos de 15 ml FrascosPhenixSS-PH15R
T25 (não tratados)VWR10861-572
Plugins para softwares
Bio-formats Packagehttp://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/
a href="https://fiji.sc/" target="_blank">https://fiji.sc/
Plug-in Kymographhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
MultipleKymograph.classhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
MultipleOverlay.classhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
WalkingAverage.classhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
StackDifference.classhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
Straighten_.jarhttps://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html
tsp050706.txthttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
75004261Fiji software<

Referências

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