Apresentamos um sistema robusto, transferível e preditivo de exposição in vitro para a triagem e monitoramento de partículas transmitidas pelo ar sobre sua citotoxicidade pulmonar aguda, expondo células pulmonares humanas cultivadas na interface ar-líquido (ALI).
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Artigo de método
Avaliação da toxicidade da inalação aguda de partículas transmitidas por expor células pulmonares humanas cultivadas na Interface Ar-Líquido
Neste artigo
Resumo
Resumo
Aqui, apresentamos um sistema de exposição in vitro modular especialmente projetado que permite a exposição homogênea de células pulmonares humanas cultivadas no ALI a gases, partículas ou atmosferas complexas (por exemplo, fumaça de cigarro), fornecendo assim fisiofilógico realista exposição da superfície apical da região aleolar humana ao ar. Em contraste com modelos de exposição sequencial com orientação linear de aerossol, o design modular do sistema de fluxo radial atende a todos os requisitos para a geração contínua e o transporte da atmosfera de teste para as células, distribuição homogênea e deposição de as partículas e a remoção contínua da atmosfera. Este método de exposição é projetado principalmente para a exposição de células a partículas aéreas, mas pode ser adaptado à exposição de aerossóis líquidos e gases altamente tóxicos e agressivos, dependendo do método de geração de aerossóis e do material dos módulos de exposição .
Dentro do quadro de um estudo de validação recém-concluído, este sistema de exposição foi comprovado como um método de triagem transferível, reprodutível e preditivo para a avaliação qualitativa da citotoxicidade pulmonar aguda das partículas transmitidas pelo ar, assim potencialmente reduzindo ou substituindo experimentos animais que normalmente forneceriam essa avaliação toxicológica.
Introdução
A inalação de partículas tóxicas no ar é uma preocupação de saúde pública, levando a uma infinidade de riscos à saúde em todo o mundo e muitos milhões de mortes anualmente1,2. As mudanças climáticas, o desenvolvimento industrial em curso e a crescente demanda por energia, produtos agrícolas e de consumo têm contribuído para o aumento de doenças pulmonares nos últimos anos3,4,5,6. O conhecimento e avaliação de substâncias inaleáveis sobre sua toxicidade aguda de inalação fornecem a ba....
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Protocolo
NOTA: O protocolo de um experimento de exposição cobre um período de três dias.
Dia 1º
1. Preparações gerais e cultivo de células
NOTA: A linha de células epitelia isopólicas a549 foi usada para experimentos de exposição. As células devem ser manuseadas em condições estéreis. Outras linhas celulares adequadas para o cultivo no ALI podem ser usadas.
- Prepare o meio de crescimento (O Meio Mínimo Essencial (DMEM) de Dulbecco, complementado com soro bovino 10% fetal (FBS) e 5 μg/mL gentamicina) e o meio de exposição (DMEM, complementado com 5 μg/mL gentamicina e uma concentração f....
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Resultados
O CULTEX RFS é um sistema de exposição modular especialmente projetado in vitro que permite a exposição direta e homogênea das células no ALI. Dentro de um antigo estudo de pré-validação, a aplicabilidade geral desse sistema de exposição e sua transferibilidade, estabilidade e reprodutibilidade foram demonstradas com sucesso. Em um recente projeto de pesquisa financiado pelo Ministério da Educação e Pesquisa da Alemanha, o sistema de exposição foi validado com sucesso e estabelecido como .......
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Discussão
Muitos modelos de teste de toxicidade de inalação não animal foram desenvolvidos nos últimos anos, a fim de obter informações sobre o risco de inalação aguda de partículas inaginadas e reduzir e substituir experimentos animais de acordo com o princípio3R 25.
Em termos de modelos de cultura celular, a exposição de células pode ser feita em condições submersas ou no ALI. Expor células condições submersas pode afetar as propriedades físico-químicas e, portanto, as propried.......
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Divulgações
Os autores AT, KG, AB, SH, HM, TG, HT e DS não têm nada para divulgar. A empresa Cultex Technology GmbH (antiga Cultex Laboratories GmbH) produz instrumentos (por exemplo, CULTEX RFS, CULTEX DG) utilizados neste artigo. NM foi funcionário da Cultex Laboratories GmbH durante este estudo. OK é um funcionário da Cultex Technology GmbH (anteriormente Cultex Laboratories GmbH). A patente PCT/EP2009/007054 para o dispositivo é de propriedade do fundador da Cultex Technology GmbH Prof. Dr. Ulrich Mohr (anteriormente Cultex Laboratories GmbH).
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Ministério federal de Educação e Pesquisa (Bundesministerium für Bildung und Forschung, BMBF, Alemanha (Grant 031A581, subprojeto A-D)) e pela Fundação Alemã de Pesquisa (Deutsche Forschungsgesellschaft, DFG, Grupo de Treinamento de Pesquisa GRK 2338).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Células | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | |
| Meio de cultura celular e suprimentos | |||
| DMEM | Biochrom, Berlim, Alemanha | FG 0415 | usado como meio de crescimento |
| DMEM | Gibco-Invitrogen, Darmstadt, Alemanha | 22320 | usado como meio de exposição |
| FBS superior | Biochrom, Berlim, Alemanha | S 0615 | |
| Gentamicina (10mg/mL) | Biochrom, Berlim, Alemanha | A 2710 | |
| HEPES 1M | Th. Geyer, Renningen, Alemanha | L 0180 | |
| PBS | Biochrom, Berlim, Alemanha | L 1825 | |
| Tripsina/EDTA (0,05%/0,02%) | Biochrom, Berlim, Alemanha | L 2143 | |
| Material de cultura de células | |||
| CASY Cups | Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Alemanha | REF 05651794 | |
| Placas de cultura de células | Corning, Wiesbaden, Alemanha | 3516 | Placas de 6 poços |
| Corning Transwell Pastilhas de cultura de células | Corning, Wiesbaden, Alemanha | 3450 | Inserções de 24 mm; 6-&tímido; placas de poço; 0,4 µ m |
| Chemicals | |||
| CASYton | Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Alemanha | REF 05651808001 | |
| Ar Comprimido (DIN EN 12021) | Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschleiß heim, Alemanha | 2290152 | |
| WST-1 | Abcam, Cambridge, Reino Unido | ab155902 | |
| Instrumentos + equipamento | |||
| CASY Contador de Células | Schä rfe System GmbH, Reutlingen, Alemanha | ||
| Termostato de circulação | LAUDA, Lauda-Kö nigshofen, Alemanha | Ecoline RE 100 | |
| CULTEX HyP - Prensa Hidráulica | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| Manga de inserção CULTEX | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX RFS - Sistema de Fluxo Radial Tipo 2 (módulo para exposição de partículas) | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX RFS - Sistema de Fluxo Radial Tipo 2 (módulo para exposição ao ar limpo) | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| Fornecimento CULTEX Controlador | |||
| de fluxo 0-30 ml/min (IQ-Flow) | Bronkhorst Deutschland Nord GmbH | ||
| Controlador de fluxo 0-1,5 l/min (EL-Flow) | Bronkhorst Deutschland Nord GmbH | ||
| Filtros (grandes) | Munktell & Filtrak GmbH, Sachsen, Alemanha | LP-050 | Filtro Estéril Munktell; Eficiência de retenção de partículas > 99,999% |
| Filtros (pequenos) | Parker Hannifin Corporation, Mainz, Alemanha | 9933-05-DQ | Filtro descartável Balston |
| Bomba média | Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Alemanha | Ismatec IPC High Precision Multichannel Dispenser | bomba peristáltica digital |
| Microplate Reader Infinite M200 Pro | Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Alemanha | ||
| Bomba Vakuum | KNF, Freiburg, Alemanha | N86 KT.18 | |
| Vö controlador de fluxo de massa gtlin 0,2-10 l/min | TrigasFI GmbH | Vö regulador compacto gtlin red-y, Typ-Nr.: GCR-C3SA-BA20 | |
| Banho-maria | LAUDA, Lauda-Kö nigshofen, Alemanha | Ecoline Staredition RE 104 |
Referências
- Faber, S. C., McCullough, S. D. Through the Looking Glass: In vitro Models for Inhalation Toxicology and Interindividual Variability in the Airway. Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 115-128 (2018).
- Ambient air pollution: a global assessment of exposure and burden of disease. , World Health Organization. http://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/250141/9789241511353-eng.pdf?sequence=1 ....
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Reimpressões e permissões
