Triagem para inibidores da pirofosia ligada à membrana de maritoga

Resumo

Aqui apresentamos um método de triagem para inibidores de pirofosfatase ligado à membrana (da Thermotoga maritima)com base na reação azul molibdênio em um formato de placa de 96 poços.

Resumo

Pirofosfatases ligadas à membrana (mPPases) são enzimas diméricas que ocorrem em bactérias, arqueais, plantas e parasitas protistas. Estas proteínas acovardam o pirofosfato em duas moléculas de ortofosfato, que é acoplado com próton e / ou íon de sódio bombeamento através da membrana. Como não existem proteínas homólogas em animais e humanos, os mPPases são bons candidatos na concepção de potenciais alvos de drogas. Aqui apresentamos um protocolo detalhado para a tela para inibidores de mPase utilizando a reação azul molibdênio em um sistema de placa de 96 poços. Usamos mPase da bactéria termofílica Thermotoga maritima (TmPPase) como uma enzima modelo. Este protocolo é simples e barato, produzindo um resultado consistente e robusto. Leva apenas cerca de uma hora para concluir o protocolo de ensaio de atividade desde o início do ensaio até a medição de absorção. Uma vez que a cor azul produzida neste ensaio é estável por um longo período de tempo, ensaio (s) subseqüente pode ser realizado imediatamente após o lote anterior, e a absorção pode ser medida mais tarde para todos os lotes de uma só vez. A desvantagem deste protocolo é que ele é feito manualmente e, portanto, pode ser desgastante, bem como exigir boas habilidades de pipetting e tempo de manutenção. Além disso, a solução arsenite-citrate usada neste ensaio contém arsenita de sódio, que é tóxica e deve ser tratada com as precauções necessárias.

Introdução

Aproximadamente 25% do total de proteínas celulares são proteínas da membrana e cerca de 60% delas são alvos de drogas^1,2. Um dos alvos potenciais da droga³, pirofosfofases ligados à membrana (mPPases), são enzimas diméricas que bombeiam próton e/ou íon de sódio através da membrana por hidróforadede de pirofosfato em dois ortopofosfatos⁴. mPPases podem ser encontrados em vários organismos^5, como bactérias, archaea, plantas e parasitas protistas, com exceção de seres humanos e animais⁴. Em parasitas protistas, por ex....

Protocolo

1. Preparação de proteínas

NOTA: A expressão e purificação de TmPPase foi descrita em outros lugares¹³.

1. Prepare 10 mL da solução tampão de reativação contendo 20 mM 2-(N-morpholino) ácido ethanesulfonic (MES) pH 6.5, 3.5% (v/v) glycerol, 2 mM dithiothreitol (DTT), e 0.05% dodecyl maltoside (DDM).
2. Prepare 10 mL da mistura de reação contendo 200 mM Tris-Cl pH 8.0, 8.0 mM MgCl_2,333 mM KCl, e 67 mM NaCl.
   NOTA: Mg²⁺ é necessário para chelate o pirofosfato como o substrato de mPase, K⁺ é necessário para aumentar a atividade enzimática como TmPPase é um mPase ....

Resultados

Neste protocolo, oito compostos (1-8) foram testados(Figura 2A)juntamente com o BID, inibidor comum de pirofosfatases, como controle positivo. Cada composto foi testado em três concentrações diferentes (1 μM, 5 μM e 20 μM) em triplicado. O fluxo de trabalho da triagem é representado na Figura 1,a partir da amostra e preparação do reagente até a medida de absorção em 860 nm.

Ao final deste protocolo, após a adição da solução A + B e ar.......

Discussão

Aqui relatamos um protocolo detalhado para triagem simples de inibidores para pirofosfatase ligada à membrana de T. maritima em um formato de placa de 96 poços baseado em Vidilaseris et al.¹⁴. Este protocolo é barato e baseado em ácido 12-fosphomolybdic, que é formado a partir de ortopofosfato e molibdênio em condições ácidas e reduzido a espécies de fosphomolybdenum com uma cor azul distinta¹². Este método é preferido em relação a outros protocolos, como o ensaio .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Folha de vedação adesiva	Thermo Scientific	AB0558
Heptamolibdato de amônio tetrahidratado	Merck	F1412481 636
Ácido ascórbico	Sigma-Aldrich	95212-250G
BioLite 96Well Multidish Thermo	Scientific	130188
Dimetil sulfóxido (DMSO)	Merck	1167431000
Tiras de tubo de PCR de 8 poços 0,2 ml sem tampas (120)	Genética Nippon	FG-028
Dodecil maltosídeo (DDM)	Melford	B2010-100G
Etanol	Merck	1009901001
Ácido acético glacial	Merck	1000631011
Ácido clorídrico	Sigma-Aldrich	258148-500ML
Imidodifosfato de sódio sal	Sigma-Aldrich	I0631-1G
L-&alfa;-Fosfatidilcolina de lecitina de soja	Sigma	429415-100GM
de PCR de 96 poços
MultiSkan Go	Thermo Scientific	10680879
Ascent (Tipo 750)	Labsystems
Placa de Petri de poliestireno (tamanho 150 mm x 15 mm)	Sigma-Aldrich	P5981-100EA
Cloreto de potássio	Merck	104936
Prism 6 software	GraphPad
QBT2 Bloco de aquecimento	Grant Instruments
Meta-arsenito de sódio	Fisher Chemical
Fosfato de sódio dibásico (Pi)	Sigma	S0876-1KG
Pirofosfato de sódio dibásico	Fluka	71501-100G
Citrato trissódico di-hidratado	Fluka	71404-1KG

Cloreto de magnésio Placas 8147330500 Sigma-Aldrich Multiplate Bio-Rad MLL9651 Nepheloskan 12897692