É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Produção de partículas pseudodigitadas de gripe infecciosa de alto titer com glicoproteínas envelope de vírus H5N1 e H7N9 altamente patogênicos

8.3K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/60663

⸱

15 de janeiro de 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Central Laboratory, Hang Zhou Red Cross Hospital, 2Clinical Laboratory, Yuhang District Maternity and Child Health Care Hospital

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve um processo experimental para produzir partículas pseudodigitadas virais infecciosas de alto titer (pp) com glicoproteínas envelope de duas cepas de gripe A e como determinar sua infectividade. Este protocolo é altamente adaptável para desenvolver pps de qualquer outro tipo de vírus envolvidos com glicoproteínas envelope diferentes.

Resumo

A transmissão direta ocasional do vírus altamente patogênico da gripe aviária A H5N1 (HPAI H5N1) e H7N9 aos seres humanos e sua letalidade são graves problemas de saúde pública e sugerem a possibilidade de uma epidemia. No entanto, nossa compreensão molecular do vírus é rudimentar, e é necessário estudar as propriedades biológicas de suas proteínas envelope como alvos terapêuticos e desenvolver estratégias para controlar a infecção. Desenvolvemos uma plataforma de partículas pseudodigitadas virais sólidas (pp) para estudar o vírus da gripe aviária, incluindo a análise funcional de sua hemaglutinina (HA) e glicoproteínas envelope de neuraminidase (NA), as características de ressortamento dos HAs e NAs, receptores, troposmas, anticorpos neutralizantes, diagnóstico, infectividade, para fins de desenvolvimento de medicamentos e projeto de vacinas. Aqui, descrevemos um procedimento experimental para estabelecer pps com o envelope glicoproteínas (HA, NA) a partir de duas cepas de gripe A (HAPI H5N1 e 2013 aviário H7N9). Sua geração é baseada na capacidade de alguns vírus, como o vírus da leucemia murina (MLV), para incorporar glicoproteínas envelope em um pp. Além disso, também detalhamos como esses pps são quantificados com RT-qPCR, e a detecção de infectividade de pps vírus nativos e incompatíveis, dependendo da origem dos HAs e NAs. Este sistema é altamente flexível e adaptável e pode ser usado para estabelecer pps virais com glicoproteínas envelope que podem ser incorporados em qualquer outro tipo de vírus envolto. Assim, esta plataforma de partículas virais pode ser usada para estudar vírus selvagens em muitas investigações de pesquisa.

Introdução

A missão de uma partícula viral é transportar seu genoma de uma célula hospedeira infectada para uma célula hospedeira não infectada e entregá-la ao citoplasma ou ao núcleo em umaforma1 competente para replicação. Este processo é inicialmente desencadeado pela ligação aos receptores celulares hospedeiros, seguido pela fusão de virion e membranas celulares. Para vírus envolvidos, como os vírus da gripe, as glicoproteínas de pico são responsáveis pela ligação do receptor e fusão1,2. Glicoproteínas envelope viral (por exemplo, pirogênios, antígenos), estão envolvidos em muitas propriedades e eventos importantes, tais como iniciação do ciclo de vida do vírus (ligação e fusão), patogênese viral, imunogenicidade, apoptose celular hospedeira e tropismo celular, a via endocítica celular, bem como a transmissão e reassortmentinterespécies 1,3,4,5,6,7. Pesquisa sobre glicoproteínas envelope viral nos ajudará a entender muitos aspectos do processo de infecção viral. Partículas virais pseudodigitadas (pp), também denominadas pseudovirions ou pseudopartículas, podem ser geradas através de uma técnica de pseudotipagem8,9,10. Esta tecnologia tem sido utilizada para desenvolver partículas pseudodigitadas de muitos vírus, incluindo hepatite C11,12,hepatite B13,vírus da estomatite vesicular (VSV)14,15,e vírus da gripe16,17,18,19. Esta tecnologia é baseada na proteína Gag-Pol de lentivírus ou outros retrovírus.

Partículas virais pseudodigitadas podem ser obtidas usando um sistema de três plasmídeos cotransfecting um plasmid de expressão de glicoproteína envelope viral, uma embalagem retroviral plasmid faltando o gene env envelope, e um plasmid repórter separado em células produtores pp. O retrovírus é montado por sua proteína Gag, e buds de uma membrana celular infectada que expressa o vírus envelope proteína1. Portanto, é possível obter pps de gripe de alto titer usando a proteína gag retrovírus para produzir botões em uma membrana celular expressando influenza HA e NA. Em nossos estudos anteriores, has/nas em todas as combinações foram funcionais e capazes de executar suas funções correspondentes no ciclo de vida viral16,17,18,20,21. Estes pps são usados para investigar características biológicas da gripe, incluindo a hemaglutinação, a atividade da neuraminidase, o tropismo obrigatório do HA-receptor, e a infectividade. Como ha e NA são proteínas funcionais de superfície importantes no ciclo de vida viral, HAs e NAs incompatíveis derivados de diferentes cepas de gripe podem demonstrar parcialmente a ressortição entre eles. Aqui, geramos oito tipos de influenza pps, combinando dois HAs e dois NAs (derivados da cepa HPAI H5N1 e da mancha H7N9), usando um sistema de pseudotipagem de três plasmídeos. Estes oito tipos de pps incluem dois pps nativos, H5N1pp, H7N9pp; dois pps incompatíveis, (H5+N9)pp, (H7+N1)pp; e quatro pps que abrigam apenas uma única glicoproteína (HA ou NA), H5pp, N1pp, H7pp, N9pp. Estudos sobre o vírus influenza, como H5N1 e H7N9, são limitados por requisitos de biossegurança. Todos os estudos das cepas do vírus da gripe selvagem devem ser realizados em um laboratório de nível 3 de biossegurança (BSL-3). A tecnologia de partículas virais pseudodigitadas pode ser usada para empacotar um virion artificial em um ambiente de nível 2 de biossegurança (BSL-2). Portanto, pps representam uma ferramenta mais segura e útil para estudar os processos do vírus da gripe, dependendo de suas duas principais glicoproteínas: hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA).

Este protocolo descreve a geração desses pps com uma estratégia de cotransfecção de três plasmid (vista geral na Figura 1),como quantificar pps e detecção de infectividade. A produção pp envolve três tipos de plasmídeos (Figura 1). O gene gag-pol, que codifica a proteína Gag-Pol retrovírus, foi clonado de um kit de embalagem retrovírus e inserido no plasmídeo pcDNA 3.1 e chamado pcDNA-Gag-Pol. O gene de proteína fluorescente verde melhorada (eGFP), que codifica a Proteína Fluorescente Verde, foi clonado do vetor pTRE-EGFP, inserido no plasmídeo pcDNA 3.1 e chamado pcDNA-GFP. Durante a clonagem, uma seqüência de sinal de embalagem () foi adicionada através de uma cartilha. Os genes HA e NA foram clonados em um plasmid pVRC, chamado pVRC-HA e pVRC-NA, respectivamente. O último plasmídeo codifica a proteína de fusão e pode ser substituído por qualquer outra proteína de fusão de interesse. Nossa plataforma de pseudotipagem inclui dois plasmídeos de expressão glicoproteína: pVRC-HA e pVRC-NA. Isso pode simplificar a pesquisa sobre a revariedadeção entre diferentes cepas de vírus em uma configuração BSL-2.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

1. Dia 1: Cultura celular e semeadura

  1. Cultivar células embrionárias embrionárias humanas (HEK) 293T/17 em pratos de 60 mm com o meio essencial modificado (DMEM) de Dulbecco complementado com 10% de soro bovino fetal (FBS) e 100 U/mL penicilina-estreptomicina (DMEM Complete Medium, DCM) em uma incubadora de 37 °C, 5% de dióxido de carbono (CO2)até cerca de 80% de confluentes.
    NOTA: Hek 293T/17 células de passagem baixa são recomendadas.
  2. Lave cuidadosamente as células com 5 mL de sosteilo tampão de fosfato (PBS) 1x.
    NOTA: O manuseio manual das células HEK 293T/17 deve ser muito gentil, porque eles se separam facilmente.
  3. Remover PBS e dissociar as células com 1 mL de 0,25% trypsin-etileno diamina tetâtica solução (EDTA) solução. Coloque o prato em uma incubadora de 37 °C, 5% DE CO2 por não mais de 5 min até que as células sejam dissociadas.
  4. Desativar a trypsin adicionando 5 mL de DCM. Disperse as células em uma suspensão unicelular por pipetting cima e para baixo várias vezes.
  5. Transfira as suspensões celulares para um tubo de centrífuga pré-refrigerado de 15 mL. Colete as células por centrífuga a 250 x g por 5 min a 4 °C.
  6. Decantar o máximo possível do supernatant. Resuspenda a pelota celular com 6 mL de dcm médio e contar as células. Diluir as células para 1 x 106 células/mL com dcm médio.
  7. Semeie as células em uma placa de 6 poços com 1 mL de suspensão celular por poço. Gentilmente pat a placa para distribuir uniformemente as células. Incubar a placa durante a noite (14-16 h) em uma incubadora de 37 °C, 5% DE CO2.

2. Dia 2: Cotransfecção de quatro plasmídeos mediada por Lipofection

  1. Verifique a morfologia celular e densidade um microscópio de luz invertida. Idealmente, as células devem ser aproximadamente 85% confluent na transfecção. Substitua o meio com 1 mL de dmem sem soro médio por poço, e depois coloque a placa de volta para a incubadora.
    NOTA: O manuseio manual das células HEK 293T/17 deve ser muito gentil, porque eles se separam facilmente.
  2. Para que cada poço de células cultivadas seja transinfectado, diluir 8 μL do reagente de transfecção a um volume de 150 μL com soro médio reduzido (tubo 1). Misture suavemente e incubar por 5 min à temperatura ambiente (RT, aproximadamente 20 °C).
    NOTA: Para cada amostra de transfecção, prepare dois tubos de microcentrífuga de 1,5 mL, numerados 1 e 2.
  3. No tubo 2, diluir 2,5 μg de DNA plasmídeo em 150 μL de médio soro reduzido.
    NOTA: No tubo 2, diluir cada DNA plasmídeo, como mostrado na Tabela 1. Um plasmid codificando o vírus da estomatite vesicular (VSV) G glicoproteína (plasmídeo pLP-VSVG) foi usado como um controle positivo, porque VSV é capaz de infectar uma ampla gama de células. Partículas de controle negativo que não possuem glicoproteínas de envelope de gripe (Δenv pps) foram geradas usando plasmídeos pcDNA-Gag-Pol e pcDNA-GFP.
  4. Após uma incubação de 5 min, combine o DNA diluído com reagente de transfecção diluído. Misture suavemente e incubar por mais 15 min em RT.
  5. Adicione o complexo dna-lipídio ao poço correspondente contendo as células e o meio livre de soro. Misture suavemente balançando a placa para frente e para trás.
  6. Após a incubação de 4-6 h em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2, remover o meio e substituir por 2 mL de DMEM. Incubada por mais 36-48 h em uma incubadora de 37 °C, 5% CO2.
    NOTA: Substitua o DMEM sem soro e sem anticorpos. Neste protocolo, dois HAs e dois NAs podem ser usados para gerar oito tipos de pps (mostrado na Tabela 1).

3. Dia 3: Semeadura de células suscetíveis

  1. Para o ensaio da infectividade, semente cada tipo de células suscetíveis em 1 x 104 células por poço em uma placa de 96 poços.
    NOTA: Use dois tipos de célula-alvo para realizar o ensaio da infectividade neste artigo: uma linha de células humanas derivada de alveolar (células A549) e as células do Rim Canino Madin-Darby (MDCK). As células MDCK são amplamente utilizadas na pesquisa da gripe e podem ser um bom controle. Este passo é flexível. Quaisquer outras linhas de células-alvo podem ser usadas de acordo com os requisitos de pesquisa.
  2. Incubar a placa durante a noite (14-16 h) em uma incubadora de 37 °C, 5% DE CO2.

4. Dia 4: Pseudodigitado Coleção de Partículas Virais, Quantificação e Ensaio de Infectividade

  1. Coleção de partículas virais pseudodigitadas
    1. Verifique a cor do meio. Idealmente, deve ser rosa claro ou ligeiramente laranja. Examine as células com um microscópio biológico fluorescente invertido 440-460 nm.
    2. Em 36-48 h pós-transfecção, colher os pps passando por um 0,45 μm policinadeno fluoreto (PVDF) filtro de membrana para eliminar detritos celulares.
    3. Divida os pps em alíquotas de pequeno volume.
    4. Armazenar os pps em -80 °C.
      NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. No entanto, isso não é incentivado, porque a infectividade dos pps vai diminuir drasticamente após o congelamento e descongelamento.
  2. Quantificação de partículas virais pseudodigitadas
    1. Transfira 20 μL de pps purificados para um tubo de microcentrífuga livre de 1,5 mL (RNase).
    2. Adicione 1 μL de 0,24 U/mL nuclease benzonase. Incubar a 37 °C para 1 h para eliminar qualquer contaminação por DNA e RNA.
      NOTA: O RNA alvo, citomegalovírus comumente downregulated (CMV)-GFP RNA, é embalado nos pps e pode evitar ser degradado por nuclease benzonase.
    3. Congele a amostra a -70 °C para inativar a nuclease benzonase.
    4. Adicione 2 μL de proteinase K. Incubate em 50 °C para 30 min para digerir as proteínas do envelope e liberar o RNA CMV-GFP. Inativar o proteinase K a 100 °C por 3 min.
    5. Quantificar os pps por transcrição reversa quantitativa em tempo real (qRT)-PCR com uma sonda universal um passo RT-qPCR Kit, usando a cartilha para a frente 5'-AACAAAAGCTGGAGCTCGTTAA-3', a cartilha reversa 5'-GT GGCTCCTCATGAGTGAGGACTAC-3', e a sonda 5'-FAM-CCCCCAAATGAAGACCCCCGAG-TAM-3', em um termociclor PCR em tempo real. Normalize os pps para o número da cópia do RNA antes da infectividade.
  3. Ensaio da infectividade
    1. Diluir cada tipo de pps em termos dos dados qRT-PCR para 4 x 105 cópias/mL (normalização pp).
    2. Adicione tosyl-fenilalanina clorometila-cetona (TPCK) trippsina a uma concentração final de 40 μg/mL em pps que abrigam H7N9 HA. Incubar a 37 °C para 1 h para formar suas subunidades funcionais HA1 e HA2.
      NOTA: Não há necessidade de tratar os pps que abrigam H5 com TPCK-trippsina, porque eles têm vários resíduos de arginina e lysina no local de clivagem HA1-HA2. Este local de clivagem multi-básico pode ser cloado por proteases celulares onipresentes.
    3. Misture pps normalizados com médio DMEM (livre de soro) em uma proporção de 1:1 (volume/volume).
    4. Traga a placa contendo células suscetíveis para o armário de biossegurança.
    5. Ascutu o supernatant e lave as pilhas uma vez com 0.1 mL de PBS prewarmed.
    6. Adicione 0,1 mL de mistura pps-DMEM a um poço. Triplica os testes de infectividade de cada tipo de pps para uma linha celular suscetível (visualizada na Figura 2).
    7. Incubar a placa de 96 poços para 4-6 h em uma incubadora de 37 °C, 5% CO2.
    8. Aspirar o supernatant e substituir por 0,1 mL de DCM.
    9. Incubar a placa de 96 poços para mais 24-36 h em uma incubadora de 37 °C, 5% CO2.

5. Dia 5 ou 6: Detecção de infectividade

  1. Traga a placa de 96 poços para o armário de biossegurança.
  2. Ascutu o supernatant e lave as pilhas 1x com 0.2 mL de PBS prewarmed.
  3. Remover PBS e dissociar as células com 0,1 mL de 0,25% solução trypsin-EDTA.
  4. Coloque o prato em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2 por 3 min até que as células sejam dissociadas.
    NOTA: Evite incubar por mais de 5 min, porque isso levará à aglomeração celular.
  5. Desativar a trypsin adicionando 0.4 mL de DCM.
  6. Disperse as células em suspensão unicelular por tubulação para cima e para baixo várias vezes.
  7. Transfira as suspensões celulares para um tubo de microcentrífuga refrigerados de 1,5 mL.
  8. Determine as células positivas para repórter sgfp com triagem de células ativadas por fluorescência (FACS).
    NOTA: Para determinar a proporção de células-alvo positivas para repórters da GFP, defina portões de citometros de fluxo usando as amostras de controle (células A549 não tratadas ou células MDCK não tratadas) e, em seguida, conte as células positivas do repórter gfp de 10.000 células por amostra.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Dependendo do procedimento geral descrito acima, geramos 10 tipos de pps combinando dois has/nas de grupo ou glicoproteína VSV-G ou glicoproteínas sem envelope (mostrados na Tabela 1). Sete deles são infecciosos. Os pps que abrigam glicoproteína sem envelope ou apenas porto NA não mostrou qualquer infectividade aqui. O procedimento de produção de influenza pp é visto de forma geral na Figura 1. Micrografias eletrônicas de transmissão de pps (por exemplo, H5N1pp) são mostrada...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Neste protocolo, descrevemos um método para produzir partículas pseudodigitadas pelo vírus influenza (pp) em uma configuração BSL-2. O repórter plasmid pcDNA-GFP é incorporado aos pps e pode ser usado para quantificar pps pela FACS em um ensaio de infectividade. Escolhemos dois tipos de linhas celulares suscetíveis porque elas são amplamente utilizadas na pesquisa da gripe. As células MDCK forneceriam um bom controle para as células humanas imortalizadas variáveis usadas nesses estudos.

Este p...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por subvenções do Plano Provincial de Medicina e Ciência e Tecnologia da Saúde de Zhejiang (Grant Numbers, 2017KY538), Hangzhou Municipal Medicine and Health Science and Technology Plan (Grant Numbers, OO20190070), Hangzhou Medical Science e Hangzhou Medical Science e Hangzhou Medical Science e Hangzhou Projeto chave de tecnologia (Grant Numbers, 2014Z11) e Hangzhou projeto municipal de aplicação autônoma de desenvolvimento social e pesquisa científica (Grant Numbers, 20191203B134).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Benzonase NucleaseMillipore70664Redução eficaz da viscosidade e remoção de ácidos nucleicos de soluções proteicas
Microplacas tratadas com TC de poliestireno de fundo plano transparente (96 poços)Corning3599Tratadas para fixação celular ideal
Esterilizadas por radiação gama e certificadas não pirogênicas
Códigos alfanuméricos individuais para identificação
de poçosPlacas de Poços Múltiplos Tratadas com TC Transparente (6 poços)Costar3516Códigos alfanuméricos individuais para identificação de poços
Tratado para fixação celular ótima
Esterilizado por irradiação gama
Meio essencial modificado de Dulbecco (DMEM)Gibco11965092Um meio basal amplamente utilizado para apoiar o crescimento de muitas células de mamíferos diferentes
Soro fetalbovino ExcellFND500soros bovinos fetais que podem oferecer excelente valor para cultura de células básicas, pesquisa especializada e ensaios específicos
Classificação de células ativadas por fluorescência (FACS)Beckman coultercytoflex
Células A549 de adenocarcinoma alveolar humanoATCCCRM-CCL-185
Rim embrionário humano (HEK) Células HEK-293T/17 ATCCCRL-11268Um reagente de transfecção versátil que demonstrou transfectar eficazmente a mais ampla variedade de linhas celulares aderentes e em suspensão
Microscópio biológico fluorescente invertidoOlympusBX51-32P01-FLB3
Microscópio de luz invertidaOlympusCKX31-12PHP
Lipofectamine 2000 Reagente de transfecçãoInvitrogen11668019Detecção e quantificação rápidas, sensíveis e precisas de qPCR baseadas em sonda de alvos de RNA alvo.
Sonda Universal Luna Kit RT-qPCR de Um PassoNEBE3006LSuportará até 14.000 RCF
Células de
Rim Canino Madin-DarbyATCCCCL-34
Tubo de Microcentrífuga MaxyClear Snaplock (1.5 mL)AxygenMCT-150-C33 mm,
Unidade de Filtro de Seringa Millex-HV esterilizada por gama, 0.45 µ m, PVDFMilliporeSLHV033RSum meio essencial mínimo (MEM) aprimorado que permite uma redução da suplementação de soro fetal bovino em pelo menos 50% sem alteração na taxa de crescimento celular ou morfologia. O meio Opti-MEM I também é recomendado para uso com reagentes de transfecção lipídica catiônica, como o reagente de lipofectamina.
Opti-MEM I Meio Sérico ReduzidoGibco11058021Os antibióticos penicilina e estreptomicina são usados para prevenir a contaminação bacteriana de culturas de células devido à sua ação combinada eficaz contra bactérias gram-positivas e gram-negativas.
penicilina-estreptomicinaGibco15140122RCF máximo é de 12.500 xg
Faixa de temperatura de -80 & C a 120 & C
Tubos de centrífuga PP estéreis sem RNase-/DNase
(15 mL)Corning430791uma serina protease estável e altamente reativa
Proteinase KBeyotimeST532Tratada para fixação celular ideal
Esterilizada por radiação gama e certificada não pirogênica
Placa de cultura tratada com TC (60mm)Corning430166Tripsina do pâncreas bovino
TPCK Cuidado, essencialmente sem sal, pó liofilizado, ≥ 10.000 unidades BAEE/mg de proteína
TPCK-tripsinaSigmaT1426Esta formulação líquida de tripsina contém EDTA e vermelho de fenol. Gibco Tripsina-EDTA é feito de tripsina em pó, uma mistura irradiada de proteases derivadas do pâncreas suíno. Devido à sua força digestiva, a tripsina é amplamente utilizada para dissociação celular, passagem de cultura celular de rotina e dissociação de tecido primário. A concentração de tripsina necessária para a dissociação varia de acordo com o tipo de célula e os requisitos experimentais.
Tripsina-EDTA (0,25%), vermelho de fenolGibco25200056
Não Pirogênicas Não Pirogênicas (MDCK)

Referências

  1. Knipe, D. M., Howley, P. M. Fields Virology (6th). , Lippincott Williams & Wilkins Immunology. Philadelphia, PA. (2013).
  2. White, J. M., Delos, S. E., Brecher, M., Schornberg, K. Structures and mechanisms of viral membrane fusion proteins: multiple variations on a common theme. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 43 (3), 189-219 (2008).
  3. Bright, R. A., et al. Cross-clade protective immune responses to influenza viruses with H5N1 HA and NA elicited by an influenza virus-like particle. PLoS One. 3 (1), 1501(2008).
  4. Yang, J., et al. Reliability of pseudotyped influenza viral particles in neutralizing antibody detection. PLoS One. 9 (12), 113629(2014).
  5. Wyatt, R., Sodroski, J. The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and immunogens. Science. 280 (5371), 1884-1888 (1998).
  6. Joe, A. K., Foo, H. H., Kleeman, L., Levine, B. The transmembrane domains of Sindbis virus envelope glycoproteins induce cell death. Journal of Virology. 72 (5), 3935-3943 (1998).
  7. Albecka, A., Laine, R. F., Janssen, A. F., Kaminski, C. F., Crump, C. M. HSV-1 Glycoproteins Are Delivered to Virus Assembly Sites Through Dynamin-Dependent Endocytosis. Traffic. 17 (1), 21-39 (2016).
  8. Huang, A. S., Palma, E. L., Hewlett, N., Roizman, B. Pseudotype formation between enveloped RNA and DNA viruses. Nature. 252 (5485), 743-745 (1974).
  9. Rubin, H. Genetic Control of Cellular Susceptibility to Pseudotypes of Rous Sarcoma Virus. Virology. 26, 270-276 (1965).
  10. Steffen, I., Simmons, G. Pseudotyping Viral Vectors With Emerging Virus Envelope Proteins. Current Gene Therapy. 16 (1), 47-55 (2016).
  11. Bartosch, B., Dubuisson, J., Cosset, F. L. Infectious hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes. Journal of Experimental Medicine. 197 (5), 633-642 (2003).
  12. Bian, T., Zhou, Y., Bi, S., Tan, W., Wang, Y. HCV envelope protein function is dependent on the peptides preceding the glycoproteins. Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (1), 118-122 (2009).
  13. Gudima, S., Meier, A., Dunbrack, R., Taylor, J., Bruss, V. Two potentially important elements of the hepatitis B virus large envelope protein are dispensable for the infectivity of hepatitis delta virus. Journal of Virology. 81 (8), 4343-4347 (2007).
  14. Yoshida, Y., Emi, N., Hamada, H. VSV-G-pseudotyped retroviral packaging through adenovirus-mediated inducible gene expression. Biochemical and Biophysical Research Communications. 232 (2), 379-382 (1997).
  15. Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (17), 8033-8037 (1993).
  16. Zhang, F., et al. Characterization of pseudoparticles paired with hemagglutinin and neuraminidase from highly pathogenic H5N1 influenza and avian influenza A (H7N9) viruses. Virus Research. 253, 20-27 (2018).
  17. Zhang, F., et al. Infectivity of Pseudotyped Particles Pairing Hemagglutinin of Highly Pathogenic Avian Influenza a H5N1 Virus with Neuraminidases of The 2009 Pandemic H1N1 and a Seasonal H3N2. Journal of Bioterrorism & Biodefense. 2, 104(2011).
  18. Wu, J., et al. Characterization of neuraminidases from the highly pathogenic avian H5N1 and 2009 pandemic H1N1 influenza A viruses. PLoS One. 5 (12), 15825(2010).
  19. Nefkens, I., et al. Hemagglutinin pseudotyped lentiviral particles: characterization of a new method for avian H5N1 influenza sero-diagnosis. Journal of Clinical Virology. 39 (1), 27-33 (2007).
  20. Zhang, Y., et al. Hemagglutinin and neuraminidase matching patterns of two influenza A virus strains related to the 1918 and 2009 global pandemics. Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 405-408 (2009).
  21. Lin, X., et al. Oseltamivir boosts 2009 H1N1 virus infectivity in vitro. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (4), 1305-1308 (2009).
  22. McKay, T., Patel, M., Pickles, R. J., Johnson, L. G., Olsen, J. C. Influenza M2 envelope protein augments avian influenza hemagglutinin pseudotyping of lentiviral vectors. Gene Therapy. 13 (8), 715-724 (2006).
  23. Pan, H., et al. Autophagy mediates avian influenza H5N1 pseudotyped particle-induced lung inflammation through NF-kappaB and p38 MAPK signaling pathways. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 183-195 (2014).
  24. Szecsi, J., et al. Induction of neutralising antibodies by virus-like particles harbouring surface proteins from highly pathogenic H5N1 and H7N1 influenza viruses. Virology Journal. 3, 70(2006).
  25. Garcia, J. M., Lagarde, N., Ma, E. S., de Jong, M. D., Peiris, J. S. Optimization and evaluation of an influenza A (H5) pseudotyped lentiviral particle-based serological assay. Journal of Clinical Virology. 47 (1), 29-33 (2010).
  26. Garcia, J. M., Lai, J. C. Production of influenza pseudotyped lentiviral particles and their use in influenza research and diagnosis: an update. Expert Review of Anti-infective Therapy. 9 (4), 443-455 (2011).
  27. Haynes, J. R., et al. Influenza-pseudotyped Gag virus-like particle vaccines provide broad protection against highly pathogenic avian influenza challenge. Vaccine. 27 (4), 530-541 (2009).
  28. Schmeisser, F., et al. Production and characterization of mammalian virus-like particles from modified vaccinia virus Ankara vectors expressing influenza H5N1 hemagglutinin and neuraminidase. Vaccine. 30 (23), 3413-3422 (2012).
  29. Liu, Y. V., et al. Chimeric severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) S glycoprotein and influenza matrix 1 efficiently form virus-like particles (VLPs) that protect mice against challenge with SARS-CoV. Vaccine. 29 (38), 6606-6613 (2011).
  30. Moeschler, S., Locher, S., Conzelmann, K. K., Kramer, B., Zimmer, G. Quantification of Lyssavirus-Neutralizing Antibodies Using Vesicular Stomatitis Virus Pseudotype Particles. Viruses. 8 (9), 254(2016).
  31. Lai, A. L., Millet, J. K., Daniel, S., Freed, J. H., Whittaker, G. R. The SARS-CoV Fusion Peptide Forms an Extended Bipartite Fusion Platform that Perturbs Membrane Order in a Calcium-Dependent Manner. Journal of Molecular Biology. 429 (24), 3875-3892 (2017).
  32. Millet, J. K., et al. Middle East respiratory syndrome coronavirus infection is inhibited by griffithsin. Antiviral Research. 133, 1-8 (2016).
  33. Millet, J. K., et al. Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting. Journal of Visualized Experiments. (145), e59010(2019).
  34. Ma, M., et al. Murine leukemia virus pseudotypes of La Crosse and Hantaan Bunyaviruses: a system for analysis of cell tropism. Virus Research. 64 (1), 23-32 (1999).
  35. Wool-Lewis, R. J., Bates, P. Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses: identification of receptor-deficient cell lines. Journal of Virology. 72 (4), 3155-3160 (1998).
  36. Chen, C. M., et al. Production and design of more effective avian replication-incompetent retroviral vectors. Developmental Biology. 214 (2), 370-384 (1999).
  37. Kaku, Y., et al. Second generation of pseudotype-based serum neutralization assay for Nipah virus antibodies: sensitive and high-throughput analysis utilizing secreted alkaline phosphatase. Journal of Virological Methods. 179 (1), 226-232 (2012).
  38. Rudiger, D., Kupke, S. Y., Laske, T., Zmora, P., Reichl, U. Multiscale modeling of influenza A virus replication in cell cultures predicts infection dynamics for highly different infection conditions. PLOS Computational Biology. 15 (2), 1006819(2019).
  39. Petiot, E., et al. Influenza viruses production: Evaluation of a novel avian cell line DuckCelt(R)-T17. Vaccine. 36 (22), 3101-3111 (2018).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Análise de Hemaglutinina NeuraminidaseProdução de Pseudotipos ViraisIncorporação de Glicoproteínas de EnvelopeQuantificação por RT-qPCREnsaio de Detecção de InfectividadeNível de Biossegurança 2Microscopia Eletrônica de TransmissãoCélulas HEK-293T/17Estudo de Rearranjo Viral
Produção de partículas pseudodigitadas de gripe infecciosa de alto titer com glicoproteínas envelope de vírus H5N1 e H7N9 altamente patogênicos
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.