Produção de partículas pseudodigitadas de gripe infecciosa de alto titer com glicoproteínas envelope de vírus H5N1 e H7N9 altamente patogênicos

Resumo

Este protocolo descreve um processo experimental para produzir partículas pseudodigitadas virais infecciosas de alto titer (pp) com glicoproteínas envelope de duas cepas de gripe A e como determinar sua infectividade. Este protocolo é altamente adaptável para desenvolver pps de qualquer outro tipo de vírus envolvidos com glicoproteínas envelope diferentes.

Resumo

A transmissão direta ocasional do vírus altamente patogênico da gripe aviária A H5N1 (HPAI H5N1) e H7N9 aos seres humanos e sua letalidade são graves problemas de saúde pública e sugerem a possibilidade de uma epidemia. No entanto, nossa compreensão molecular do vírus é rudimentar, e é necessário estudar as propriedades biológicas de suas proteínas envelope como alvos terapêuticos e desenvolver estratégias para controlar a infecção. Desenvolvemos uma plataforma de partículas pseudodigitadas virais sólidas (pp) para estudar o vírus da gripe aviária, incluindo a análise funcional de sua hemaglutinina (HA) e glicoproteínas envelope de neuraminidase (NA), as características de ressortamento dos HAs e NAs, receptores, troposmas, anticorpos neutralizantes, diagnóstico, infectividade, para fins de desenvolvimento de medicamentos e projeto de vacinas. Aqui, descrevemos um procedimento experimental para estabelecer pps com o envelope glicoproteínas (HA, NA) a partir de duas cepas de gripe A (HAPI H5N1 e 2013 aviário H7N9). Sua geração é baseada na capacidade de alguns vírus, como o vírus da leucemia murina (MLV), para incorporar glicoproteínas envelope em um pp. Além disso, também detalhamos como esses pps são quantificados com RT-qPCR, e a detecção de infectividade de pps vírus nativos e incompatíveis, dependendo da origem dos HAs e NAs. Este sistema é altamente flexível e adaptável e pode ser usado para estabelecer pps virais com glicoproteínas envelope que podem ser incorporados em qualquer outro tipo de vírus envolto. Assim, esta plataforma de partículas virais pode ser usada para estudar vírus selvagens em muitas investigações de pesquisa.

Introdução

A missão de uma partícula viral é transportar seu genoma de uma célula hospedeira infectada para uma célula hospedeira não infectada e entregá-la ao citoplasma ou ao núcleo em uma^forma1 competente para replicação. Este processo é inicialmente desencadeado pela ligação aos receptores celulares hospedeiros, seguido pela fusão de virion e membranas celulares. Para vírus envolvidos, como os vírus da gripe, as glicoproteínas de pico são responsáveis pela ligação do receptor e fusão^1,2. Glicoproteínas envelope viral (por exemplo, pirogênios, antígenos), estão envolvidos em muitas propriedades e eventos im....

Protocolo

1. Dia 1: Cultura celular e semeadura

1. Cultivar células embrionárias embrionárias humanas (HEK) 293T/17 em pratos de 60 mm com o meio essencial modificado (DMEM) de Dulbecco complementado com 10% de soro bovino fetal (FBS) e 100 U/mL penicilina-estreptomicina (DMEM Complete Medium, DCM) em uma incubadora de 37 °C, 5% de dióxido de carbono (CO₂₎até cerca de 80% de confluentes.
   NOTA: Hek 293T/17 células de passagem baixa são recomendadas.
2. Lave cuidadosamente as células com 5 mL de sosteilo tampão de fosfato (PBS) 1x.
   NOTA: O manuseio manual das células HEK 293T/17 deve ser muito gentil, porque eles se separam facilmente.
3. Rem....

Resultados

Dependendo do procedimento geral descrito acima, geramos 10 tipos de pps combinando dois has/nas de grupo ou glicoproteína VSV-G ou glicoproteínas sem envelope (mostrados na Tabela 1). Sete deles são infecciosos. Os pps que abrigam glicoproteína sem envelope ou apenas porto NA não mostrou qualquer infectividade aqui. O procedimento de produção de influenza pp é visto de forma geral na Figura 1. Micrografias eletrônicas de transmissão de pps (por exemplo, H5N1pp) são mostrada.......

Discussão

Neste protocolo, descrevemos um método para produzir partículas pseudodigitadas pelo vírus influenza (pp) em uma configuração BSL-2. O repórter plasmid pcDNA-GFP é incorporado aos pps e pode ser usado para quantificar pps pela FACS em um ensaio de infectividade. Escolhemos dois tipos de linhas celulares suscetíveis porque elas são amplamente utilizadas na pesquisa da gripe. As células MDCK forneceriam um bom controle para as células humanas imortalizadas variáveis usadas nesses estudos.

Este p.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Benzonase Nuclease	Millipore	70664	Redução eficaz da viscosidade e remoção de ácidos nucleicos de soluções proteicas
Microplacas tratadas com TC de poliestireno de fundo plano transparente (96 poços)	Corning	3599	Tratadas para fixação celular ideal Esterilizadas por radiação gama e certificadas não pirogênicas Códigos alfanuméricos individuais para identificação
de poçosPlacas de Poços Múltiplos Tratadas com TC Transparente (6 poços)	Costar	3516	Códigos alfanuméricos individuais para identificação de poços Tratado para fixação celular ótima Esterilizado por irradiação gama
Meio essencial modificado de Dulbecco (DMEM)	Gibco	11965092	Um meio basal amplamente utilizado para apoiar o crescimento de muitas células de mamíferos diferentes
Soro fetal	bovino Excell	FND500	soros bovinos fetais que podem oferecer excelente valor para cultura de células básicas, pesquisa especializada e ensaios específicos
Classificação de células ativadas por fluorescência (FACS)	Beckman coulter	cytoflex
Células A549 de adenocarcinoma alveolar humano	ATCC	CRM-CCL-185
Rim embrionário humano (HEK) Células HEK-293T/17 ATCC		CRL-11268	Um reagente de transfecção versátil que demonstrou transfectar eficazmente a mais ampla variedade de linhas celulares aderentes e em suspensão
Microscópio biológico fluorescente invertido	Olympus	BX51-32P01-FLB3
Microscópio de luz invertida	Olympus	CKX31-12PHP
Lipofectamine 2000 Reagente de transfecção	Invitrogen	11668019	Detecção e quantificação rápidas, sensíveis e precisas de qPCR baseadas em sonda de alvos de RNA alvo.
Sonda Universal Luna Kit RT-qPCR de Um Passo	NEB	E3006L	Suportará até 14.000 RCF Células de
Rim Canino Madin-Darby	ATCC	CCL-34
Tubo de Microcentrífuga MaxyClear Snaplock (1.5 mL)	Axygen	MCT-150-C	33 mm,
Unidade de Filtro de Seringa Millex-HV esterilizada por gama, 0.45 µ m, PVDF	Millipore	SLHV033RS	um meio essencial mínimo (MEM) aprimorado que permite uma redução da suplementação de soro fetal bovino em pelo menos 50% sem alteração na taxa de crescimento celular ou morfologia. O meio Opti-MEM I também é recomendado para uso com reagentes de transfecção lipídica catiônica, como o reagente de lipofectamina.
Opti-MEM I Meio Sérico Reduzido	Gibco	11058021	Os antibióticos penicilina e estreptomicina são usados para prevenir a contaminação bacteriana de culturas de células devido à sua ação combinada eficaz contra bactérias gram-positivas e gram-negativas.
penicilina-estreptomicina	Gibco	15140122	RCF máximo é de 12.500 xg Faixa de temperatura de -80 & C a 120 & C Tubos de centrífuga PP estéreis sem RNase-/DNase
(15 mL)	Corning	430791	uma serina protease estável e altamente reativa
Proteinase K	Beyotime	ST532	Tratada para fixação celular ideal Esterilizada por radiação gama e certificada não pirogênica
Placa de cultura tratada com TC (60mm)	Corning	430166	Tripsina do pâncreas bovino TPCK Cuidado, essencialmente sem sal, pó liofilizado, ≥ 10.000 unidades BAEE/mg de proteína
TPCK-tripsina	Sigma	T1426	Esta formulação líquida de tripsina contém EDTA e vermelho de fenol. Gibco Tripsina-EDTA é feito de tripsina em pó, uma mistura irradiada de proteases derivadas do pâncreas suíno. Devido à sua força digestiva, a tripsina é amplamente utilizada para dissociação celular, passagem de cultura celular de rotina e dissociação de tecido primário. A concentração de tripsina necessária para a dissociação varia de acordo com o tipo de célula e os requisitos experimentais.
Tripsina-EDTA (0,25%), vermelho de fenol	Gibco	25200056

Não Pirogênicas Não Pirogênicas (MDCK)