O Método CrioAPEX para Análise de Microscopia Eletrônica da Localização da Proteína da Membrana dentro de células ultraestruturalmente preservadas

Elaine  M. Mihelc; Stephanie Angel; Robert  V. Stahelin; Seema Mattoo

doi:10.3791/60677

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O Método CrioAPEX para Análise de Microscopia Eletrônica da Localização da Proteína da Membrana dentro de células ultraestruturalmente preservadas

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DOI:

10.3791/60677

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27 de fevereiro de 2020

Elaine M. Mihelc¹ , Stephanie Angel² , Robert V. Stahelin²^,³^,⁴ , Seema Mattoo¹^,⁴^,⁵^,⁶

¹Department of Biological Sciences, Purdue University, ²Department of Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology, Purdue University, ³Purdue Institute of Inflammation, Immunology and Infectious Disease, Purdue University, ⁴Bindley Biosciences Center, Purdue University, ⁵Purdue Institute of Integrative Neuroscience, Purdue University, ⁶Purdue Center for Cancer Research, Purdue University

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve o método crioAPEX, no qual uma proteína de membrana com etiqueta APEX2 pode ser localizada por microscopia eletrônica de transmissão dentro da ultraestrutura celular idealmente preservada.

Resumo

Eventos celulares-chave como transdução de sinal e tráfico de membrana dependem da localização adequada da proteína dentro dos compartimentos celulares. Compreender a localização subcelular precisa das proteínas é, portanto, importante para responder a muitas questões biológicas. A busca por um rótulo robusto para identificar a localização de proteínas combinada com a preservação e a coloração adequadas do celular tem sido historicamente desafiadora. Os recentes avanços nas imagens de microscopia eletrônica (EM) levaram ao desenvolvimento de muitos métodos e estratégias para aumentar a preservação celular e rotular proteínas alvo. Uma tag genética relativamente nova baseada em peroxidase, APEX2, é um líder promissor em etiquetas em ativas em clones. A preparação amostral para microscopia eletrônica de transmissão (TEM) também avançou nos últimos anos com o advento da criofixação por congelamento de alta pressão (FpE) e desidratação e coloração de baixa temperatura via substituição de congelamento (FS). O HPF e o FS proporcionam excelente preservação da ultraestrutura celular para imagens TEM, perdendo apenas para direcionar a crio-imagem de amostras vívidas. Aqui apresentamos um protocolo para o método crioAPEX, que combina o uso da tag APEX2 com HPF e FS. Neste protocolo, uma proteína de interesse é marcada com APEX2, seguida de fixação química e reação peroxidase. No lugar da tradicional coloração e desidratação alcoólica à temperatura ambiente, a amostra é criofixada e sofre desidratação e coloração em baixa temperatura via FS. Usando crioAPEX, não só uma proteína de interesse pode ser identificada dentro de compartimentos subcelulares, mas também informações adicionais podem ser resolvidas em relação à sua topologia dentro de uma membrana estruturalmente preservada. Mostramos que este método pode fornecer alta resolução suficiente para decifrar padrões de distribuição de proteínas dentro de um lumen organela, e distinguir a compartimentação de uma proteína dentro de uma organela próxima a outras organelas não rotuladas. Além disso, o crioAPEX é processualmente simples e incapacitado para células cultivadas na cultura tecidual. Não é mais tecnicamente desafiador do que métodos típicos de criofixação e congelamento de substituição. O CrioAPEX é amplamente aplicável para análise de TEM de qualquer proteína de membrana que possa ser geneticamente etiquetada.

Introdução

Estudos biológicos muitas vezes incluem questões de resolução de localização de proteínasubcelular dentro de células e organelas. A microscopia de imunofluorescência fornece uma visão útil de baixa resolução da localização de proteínas, e os recentes avanços na imagem de superresolução estão empurrando os limites de resolução para proteínas fluorescentes^{marcadas 1,}²^,³. No entanto, a microscopia eletrônica (EM) continua sendo o padrão-ouro para a ultraestrutura celular de alta resolução por imagem, embora a rotulagem de proteínas seja um desafio.

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