Análise do consumo de oxigênio em ilhotas pancreáticas de primatas não humanos

Resumo

Este protocolo demonstra a medida precisa e reproduzível do consumo de oxigênio em ilhotas pancreáticas de primatas não humanos. As técnicas de carregamento de ilhotas e revestimento da microplaca fornecem uma estrutura para a medição eficiente da respiração em outros tipos de esferóides cultivados.

Resumo

A medição do consumo de oxigênio em aglomerados esferóides de células, como ilhotas pancreáticas ex vivo, tem sido historicamente desafiadora. Demonstramos a medição do consumo de oxigênio de ilhota usando uma microplaca de 96 poços projetada para a medição do consumo de oxigênio em esferóides. Neste ensaio, as microplacas esferóides são revestidas com um adesivo de células e tecidos no dia anterior ao ensaio. Utilizamos um pequeno volume de solução adesiva para incentivar a adesão ao ilhota apenas ao fundo do poço. No dia do ensaio, 15 ilhotas são carregadas diretamente na base de cada poço usando uma técnica que garante o posicionamento ideal das ilhotas e a medição precisa do consumo de oxigênio. Vários aspectos da respiração mitocondrial são sondados farmacologicamente em ilhotas de primatas não humanos, incluindo respiração dependente de ATP, respiração máxima e vazamento de prótons. Este método permite resultados consistentes e reproduzíveis usando apenas um pequeno número de ilhotas por poço. Teoricamente, pode ser aplicado a quaisquer esferóides cultivados de tamanho semelhante.

Introdução

A fim de manter os níveis normais de glicose no sangue, a célula β pancreática deve sentir elevações na glicose e secretar insulina em conformidade. O acoplamento da secreção de insulina com os níveis de glicose está diretamente ligado ao metabolismo da glicose e à produção de ATP através da fosforia oxidativa mitocondrial. Assim, as mitocôndrias desempenham um papel crítico no acoplamento de estímulo-secreção¹. Avaliar a função mitocondrial das células β pode revelar defeitos que levam à secreção de insulina prejudicada. A secreção de glucagon por células α pancreáticas também está intimamente ligada à função mitocondrial^2.

Protocolo

1. Preparação de microplaca e cartucho de sensor no dia anterior à execução do ensaio

Ilhotas foram isoladas de três anos de idade macacos japoneses como descrito anteriormente¹³. Este método é muito semelhante ao usado para isolar ilhotas humanas de doadores de cadáveres, mas difere dos ratos, em que pancreata são muitas vezes inflados com solução de colagem, enquanto o animal está sedação e antes da remoção de órgãos. A recuperação de ilhotas foi realizada de acordo com as diretrizes do Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) do Oregon National Primate Research Center (ONPRC) e da Oregon Health and Scienc....

Resultados

Para carregar ilhotas em microplaca, 15 ilhotas devem ser aspiradas em 15 μL de mídia, como mostrado na Figura 1A. As ilhotas estabelecer-se-ão naturalmente para a parte inferior da ponta do pipet dentro de alguns segundos. Em seguida, a ponta do tubo é abaixada para o fundo do poço. A ponta é muito ligeiramente levantada, e um pequeno volume (cerca de 5 μL) é canalizado para fora junto com as ilhotas. Esta técnica resulta em colocação consis.......

Discussão

O estudo do consumo de oxigênio de ilhotas já foi dificultado pela forma esférica das ilhotas, sua falta de adesão às superfícies culturais e o número de ilhotas exigidas por poço. Neste protocolo, destacamos a eficácia da microplaca esferóide de 96 poços para medir o consumo de oxigênio de ilhotas em um pequeno número de ilhotas e demonstramos uma técnica de manuseio e carregamento de ilhotas que é tecnicamente viável e produz consistente Resultados.

Para que as ilhotas aderem ao fundo da mic.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placa de cultura de células, estilo Corning 430166 de 60 mm X 15 mm		Adesivo de
e tecidos Cell-Tak	Corning	354240
Tubo cônico, 50 mL	Falcon	352070
Dextrose anidra	Fisher Scientific	BP350-1	Para solução de glicose, 200 mg/ml, filetered estéril
Reservatórios descartáveis (estéreis), 25 ML	Vistalab	3054-1033	para carregar pipeta multicanal
EZFlow Estéril 0,45 μ m Filtro de Seringa PES, 13 mm	Foxx Life Sciences	371-3115-OEM
L-glutamina	Gibco	25030-081	200 mM (100x)
	ThermoFisher Scientific	94410810
Pipeta multicanal, 15-1250 μ L	ThermoFisher Scientific	4672100BT	Pipetas
P20, P200 e P1000	Sonda	de pH 2231000602
	Hanna Instruments	HI2210-01
Ponteiras de pipeta, 20 μ L, 200 μ L, 1000 μ L	Olympus	24-404, 24-412, 24-430
Seahorse XF Base Media	Agilent	103334-100
Seahorse XF Cell	Agilent	103015-100	Inclui Oligomicina, FCCP e Rotenone/Antimicina A
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent	S7800B	Incluindo estação de preparação com 37 ° C incubadora sem CO2
Seahorse XFe96 Spheroid Fluxpak Mini	Agilent	102905-100	Inclui cartucho sensor, microplaca esferóide e calibrante
Bicarbonato de sódio	Fisher Scientific	BP328-500
Piruvato de sódio	Gibco	11360-070	100 mM (100x)
Microscópio estéreo	Seringa Olympus	SZX9
(estéril), 5 mL	BD	309603	para filtração estéril
Água (estéril)	Sigma	W3500-500mL

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