Artigo de método

Rotulagem de proximidade baseada em turboid para identificação na planta de redes de interação proteína-proteína

DOI:

10.3791/60728

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17 de maio de 2020

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1State Key Laboratory of Agro-Biotechnology and Ministry of Agriculture Key Laboratory of Soil Microbiology, College of Biological Sciences, China Agricultural University, 2Department of Plant Biology, College of Biological Sciences, University of California, Davis, 3Genome Center, College of Biological Sciences, University of California, Davis

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Descrito aqui é um método de rotulagem de proximidade para identificação de parceiros de interação do domínio TIR do receptor imunológico NLR no tecido da folha Nicotiana benthamiana. Também é fornecido um protocolo detalhado para a identificação de interações entre outras proteínas de interesse utilizando essa técnica em Nicotiana e outras espécies vegetais.

Resumo

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Técnicas de rotulagem de proximidade (PL) utilizando ascorbate peroxidase (APEX) ou Escherichia coli biotin ligase BirA (conhecida como BioID) têm sido usadas com sucesso para identificação de interações proteína-proteína (PPIs) em células de mamíferos. No entanto, os requisitos de peróxido de hidrogênio tóxico (H2O2) em PL baseado em APEX, maior tempo de incubação com biotina (16-24 h) e maior temperatura de incubação (37 °C) em PL baseado em BioID limitam severamente suas aplicações em plantas. O PL baseado em TurboID recentemente descrito aborda muitas limitações do BioID e do APEX. TurboID permite rotulagem rápida de proximidade de proteínas em apenas 10 min sob condições de temperatura ambiente (RT). Embora a utilidade do TurboID tenha sido demonstrada em modelos animais, recentemente mostramos que o PL baseado em TurboID tem melhor desempenho em plantas em comparação com o BioID para rotulagem de proteínas que são proximais a uma proteína de interesse. Desde que aqui esteja um protocolo passo-a-passo para a identificação de parceiros de interação proteica usando o domínio n-terminal Toll/interleukin-1 receptor (TIR) da família de proteínas de nucleotídeo-binding leucina-rich repeat (NLR) como modelo. O método descreve construção vetorial, agroinfiltração de construtos de expressão proteica, tratamento de biotina, extração e dessalização de proteínas, quantificação e enriquecimento das proteínas biotinylated por purificação de afinidade. O protocolo descrito aqui pode ser facilmente adaptado para estudar outras proteínas de interesse em Nicotiana e outras espécies vegetais.

Introdução

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Os PPIs são a base de vários processos celulares. Os métodos tradicionais de identificação de PPIs incluem triagem de leveduras-dois híbridos (Y2H) e imunoprecipitação juntamente com espectrometria de massa (IP-MS)1. No entanto, ambos sofrem de algumas desvantagens. Por exemplo, a triagem Y2H requer a disponibilidade da biblioteca Y2H da espécie de planta-alvo ou animal. A construção dessas bibliotecas é trabalhosa e cara. Além disso, a abordagem Y2H é realizada na levedura heteróloga do organismo eucaótico unicelular, que pode não representar o status celular de células eucaóticas mais altas.

Em contraste, o IP-MS mostra baixa eficiência na captura de PPIs transitórios ou fracos, e também é inadequado para aquelas proteínas com baixa abundância ou alta hidrofobicidade. Muitas proteínas importantes envolvidas nas vias de sinalização vegetal, como quinases semelhantes a receptores (RLKs) ou a família NLR de receptores imunológicos são expressas em níveis baixos e frequentemente interagem com outras proteínas transitoriamente. Por isso, restringe muito a compreensão dos mecanismos subjacentes à regulação dessas proteínas.

Recentemente, métodos de rotulagem de proximidade (PL) baseados em ascorbate peroxidase (APEX) e um mutante Escherichia coli biotin ligase BirAR118G (conhecido como BioID) foram desenvolvidos e utilizados para o estudo de PPIs2,3,4. O princípio da PL é que uma proteína de interesse alvo é fundida com uma enzima, que catalisa a formação de biotinyl-AMP labile (bio-AMP). Estes bio-AMP livres são liberados por enzimas PL e difusos para a proximidade da proteína alvo, permitindo a biotinylação de proteínas proximais nas aminas primárias dentro de um raio estimado de 10 nm5.

Essa abordagem tem vantagens significativas em relação às abordagens tradicionais Y2H e IP-MS, como a capacidade de capturar PPIs transitórios ou fracos. Além disso, o PL permite a rotulagem de proteínas proximais da proteína alvo em seus ambientes celulares nativos. Diferentes enzimas PL têm desvantagens únicas ao aplicá-las em diferentes sistemas. Por exemplo, embora a APEX ofereça cinética de marcação mais alta em comparação com o BioID e seja aplicada com sucesso em sistemas de mamíferos, a exigência de peróxido de hidrogênio tóxico (H2O2) nesta abordagem torna-o inadequado para estudos de PL em plantas.

Em contraste, o PL baseado em BioID evita o uso do Tóxico H2O2, mas a taxa de rotulagem é lenta (exigindo 18-24 h para completar a biotinylação), tornando assim a captura de PPIs transitórios menos eficiente. Além disso, a maior temperatura de incubação (37 °C) necessária para um PL eficiente pelo BioID introduz estresse externo a alguns organismos, como plantas4. Portanto, a implantação limitada de PL baseado em BioID em plantas (ou seja, protoplastos de arroz, Arabidopsis e N. benthamiana) foi relatada6,7,8,9. A enzima TurboID recentemente descrita supera as deficiências do PL. Turbo. TurboID, baseado em APEX e BioID, mostrou alta atividade que permite a realização de PL dentro de 10 min na RT10. O PL baseado em TurboID foi aplicado com sucesso em células, moscas e vermes10. Recentemente, nós e outros grupos de pesquisa otimizamos e ampliamos independentemente o uso de PL baseado em TurboID para estudar PPIs em diferentes sistemas vegetais, incluindo plantas n. benthamiana e arabidopsis e raízes peludas de tomate11,12,13,14. Análises comparativas indicaram que o TurboID tem melhor desempenho para pl em plantas em comparação com o BioID11,14. Também demonstrou a robustez do PL baseado em TurboID na planta, identificando uma série de novas interações com um receptor imunológico NLR11, uma proteína cujos parceiros de interação são geralmente difíceis de obter usando métodos tradicionais.

Este protocolo ilustra o PL baseado em TurboID na planta, descrevendo a identificação de proteínas de interação do domínio N-terminal TIR do receptor imunológico NLR em plantas n. benthamiana. O método pode ser estendido a quaisquer proteínas de interesse em N. benthamiana. Mais importante, fornece uma referência importante para investigar PPIs em outras espécies vegetais, como Arabidopsis,tomate e outras.

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Protocolo

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NOTA: Uma visão geral do método é mostrada na Figura 1.

1. Preparação do material vegetal

  1. Cultivar sementes N. benthamiana em solo úmido em alta densidade e mantê-las em uma câmara climática com uma luz de 16 horas (cerca de 75 μmol/m2s) e 8 h de fotoperíodo escuro a 23-25 °C.
  2. Cerca de 1 semana depois, transfira cuidadosamente cada muda jovem para potes de 4' x 4' e mantenha as mudas na mesma câmara.
  3. Manter as plantas na câmara por cerca de 4 semanas até que elas cresçam para um estágio de folha de 4-8 para a posterior agroinfiltração15.

2. Construção de fusões TurboID

  1. Use a técnica padrão de clonagem molecular para gerar fusão da proteína alvo com TurboID (PCR TurboID da Addgene plasmid #107177). Aqui, usamos o domínio TIR n-terminal do receptor imunológico NLR como a proteína de interesse alvo e construído TIR fundido ao TurboID sob o controle do vírus do mosaico de couve-flor 35S promotor (p35S::TIR-TurboID).
    NOTA: A fusão da enzima TurboID ao carboxil-terminus ou amino-terminus da proteína-alvo dependerá da proteína de interesse. Normalmente, para uma proteína citoplasmática, ambos os termini devem ser aceitáveis, desde que a fusão TurboID não afete a função da proteína alvo. No entanto, para uma proteína localizada em membrana, a topologia proteica deve ser caracterizada com antecedência antes de determinar qual terminus é melhor para a fusão TurboID.
  2. Construa uma citermina fundida com TurboID sob o mesmo promotor para servir como controle para análise proteômica quantitativa subseqüente.
    NOTA: É importante construir um controle TurboID para identificar o proteome proximal à proteína alvo. O controle de fusão TurboID deve mostrar um nível de expressão semelhante ao da proteína alvo fundida com TurboID. Isso pode ser determinado empiricamente ajustando a concentração de Agrobacterium durante a agroinfiltração. Além disso, é importante que a proteína de controle tenha um padrão de localização subcelular semelhante ao da proteína de interesse alvo.

3. Agroinfiltração

  1. Transformação dos plasmídeos para Agrobacterium
    1. Adicionar 0,5 μg dos plasmídeos gerados das etapas 2.1 e 2.2 a 50 μL da cepa Agrobacterium tumefaciens GV3101, preparadas como descrito anteriormente16.
      NOTA: Outras cepas de Agrobacterium, como o GV2260, também podem ser utilizadas.
    2. Incubar no gelo por 30 min.
    3. Choque térmico em banho-maria a 42 °C por 60 s.
    4. Adicione 400 μL de meio LB (tripptone de 10 g/L, 5 g/l de levedura e 10 g/L NaCl; pH = 7,0) ao Agrobacterium e incubar a 28 °C por 90 min.
    5. Emplacasse todo o teor no tubo no ágar LB suplementado com antibióticos apropriados para selecionar o plasmídeo, bem como para o Agrobacterium (para GV3101: 50 mg/L gentamicina e 50 mg/L rifampicina).
    6. Incubar placas a 28 °C por 36-48 h até que as colônias individuais sejam visíveis.
  2. Escolha e estique várias colônias individuais em uma placa de ágar LB fresco com antibióticos (ver passo 3.1.5) e cresça a 28 °C durante a noite.
    NOTA: É mais ideal realizar a pcr colônia para confirmar a presença da construção binária específica no Agrobacterium. Em nossa experiência, mais de 95% das colônias contêm as construções binárias introduzidas.
  3. Inocula3 mL de meio LB mais antibióticos apropriados (ver passo 3.1.4) com colônia Agrobacterium abrigando a construção de interesse, e incuba ndo agitando durante a noite a 28 °C até que o OD600 da cultura Agrobacterium atinja 2.0.
  4. Centrifugar as células a 3.000 x g e resuspendê-las para OD600 = 1,0 em tampão de agroinfiltração (10 mM MgCl2, 10 mM MES [pH = 5,6], 250 μM acetosyringone).
    NOTA: Embora seja ideal incubar o inóculo por 2 h no RT antes da agroinfiltração, em nossa experiência com a cepa GV3101, não houve grande diferença entre a expressão proteica alvo com vs. sem incubação.
  5. Use uma seringa sem agulha de 1 mL para infiltrar o inóculo na epiderme (abaxial) das folhas n. benthamiana totalmente maduras.
    NOTA: Para preparar uma quantidade suficiente de materiais de folha para três réplicas biológicas: uma folha inteira é geralmente infiltrada, três folhas são infiltradas por planta, e três a quatro plantas são usadas para cada construção. Para cada folha, 1,5-2,0 mL de agrobactérias resuspensas é suficiente.
  6. Após 36 h de pós-infiltração (hpi), infiltrar-se em biotina de 200 μM (na solução MgCl2 de 10 mM) nas folhas pré-infiltradas com construções TurboID.
  7. Mantenha a planta por 3-12 h adicionais antes de colher o tecido da folha conforme descrito na seção 4.
    NOTA: A razão para escolher os 36 hpi para infiltração de biotina é que a expressão proteica alvo atinge picos neste ponto de tempo de acordo com estudos anteriores11. É aconselhável determinar o tempo necessário para a expressão ideal da proteína de interesse alvo. O tempo de incubação da infiltração pós-biotina depende do projeto experimental e da proteína alvo em estudo. Normalmente, 3-12 h de tratamento com biotina permite a rotulagem da maioria das proteínas proximais à proteína alvo pelas fusões TurboID.

4. Coleta de amostras de folhas

NOTA: Para posterior processamento das amostras de folhas, use luvas estéreis para evitar a contaminação da queratina das amostras. Todos os reagentes também devem ser o mais livre de queratina possível.

  1. Corte as folhas infiltradas na base do petiole, remova a veia da folha e congele o tecido da folha em nitrogênio líquido.
  2. Triture o tecido da folha usando um pilão e argamassa e armazene o pó de folha em tubos de falcão de 15 mL ou 50 mL a -80 °C para uso subsequente.
    NOTA: Leve de três a quatro pedaços de folhas para cada uma das três réplicas biológicas de diferentes plantas. O protocolo pode ser pausado aqui. Antes das etapas subseqüentes, recomenda-se avaliar a expressão proteica e a biotinylação da proteína alvo por meio de análises de imunoblot. As manchas ocidentais típicas são mostradas na Figura 2.

5. Extração de proteína total da folha

  1. Transfira cerca de 0,35 g de pó de folha para um tubo de 2 mL. Prepare dois tubos para cada amostra.
    ATENÇÃO: Use luvas ao tocar em qualquer objeto resfriado por nitrogênio líquido.
  2. Adicionar 700 μL de tampão de lyse RIPA (50 mM Tris-HCl [pH = 7,5], 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40 [v/v], 0,1% SDS [w/v], 0,5% de desoxicoto de sódio [w/v], 1 mM DTT, 1 comprimido de coquetel inibidor de protease) a 0,35 g de pó de folha.
  3. Vórtice os tubos por 10 min.
  4. Deixe as amostras no gelo por 30 min.
  5. Misture o conteúdo a cada 4-5 minutos, virando os tubos de cabeça para baixo várias vezes.

6. Remoção da biotina livre por dessalela

NOTA: Esta seção leva cerca de 50 min.

  1. Equilibre a coluna de salgadinho.
    1. Remova o selador na parte inferior da coluna de dessalela e coloque a coluna em um tubo de 50 mL.
    2. Remova a solução de armazenamento por centrifugação a 1000 x g e 4 °C por 2 min e certifique-se de que a tampa está solta.
    3. Coloque a coluna de dessalela em um tubo de 50 mL. Equilibre a coluna 3x com 5 mL de tampão de lysis RIPA, cada vez centrifugando a 1000 x g e 4 °C por 2 min e descartando o fluxo.
    4. Transfira a coluna de desalsão para um novo tubo de 50 mL e armazene temporariamente a 4 °C para uso subsequente.
  2. Gire os tubos do passo 5.4 a 16.500 x g e 4 °C por 10 min e transfira o sobrenadante dos dois tubos para um novo tubo de 2 mL.
  3. Adicionar 1.500 μL de extrato proteico ao topo da resina da coluna de seladura equilibrada (a partir do passo 6.1.4). Quando o extrato de proteína entrar na resina, adicione mais 100 μL de tampão de lyse RIPA.
    NOTA: Embora 1.400 μL de tampão de lyse RIPA tenha sido utilizado para extração de proteínas das folhas, o volume total após a extração e dessaling da proteína foi invariavelmente aumentado em certa medida em relação ao volume original. Portanto, uma combinação das amostras de cada grupo conforme descrito nas etapas 5.1 e 5.4 pode resultar em pelo menos 1.500 μL de extrato de proteína por amostra.
  4. Centrifugação a 1000 x g e 4 °C por 2 min e deixe as amostras salgadas no gelo temporariamente.

7. Quantificação dos extratos de proteína selada usando um ensaio de Bradford

  1. Preparar 50 μL de cada solução BSA gradiente: 0 mg/mL, 0,2 mg/mL, 0,4 mg/mL, 0,6 mg/mL, 0,8 mg/mL e 1 mg/mL.
  2. Diluir o extrato de proteína dessacou misturando uma amostra de 5 μL com 45 μL de ddH2O.
  3. Prepare 1x regente bradford diluindo o regente 5x Bradford (100 mg de Coomassie brilhante azul G250, 47 mL de metanol, 100 mL de 85% de ácido fosfórico, 53 mL de ddH2O).
  4. Adicione 50 μL de cada solução BSA gradiente e 50 μL de extrato de proteína diluído ao 2,5 mL de 1x regente bradford.
  5. Incubar no RT por 10 min.
  6. Adicione 200 μL de solução de cada amostra a um poço de uma placa ELISA (três réplicas técnicas por amostra).
  7. Meça o OD595 usando um leitor de microplacas.
  8. Desenhe a curva padrão com base no valor da solução BSA gradiente e calcule a concentração das amostras de proteína selada. Normalmente, a concentração total de proteínas obtida de 0,7 g de folhas varia de 3-6 mg/mL.
  9. Prepare 6-8 mg de extrato de proteína dessalgado para posterior purificação de afinidade.

8. Enriquecimento de proteínas biotinyladas

  1. Pegue 200 μL de contas magnéticas conjugadas com Streptavidn-C1 em um tubo de 2 mL.
  2. Equilibre as contas magnéticas conjugadas streptavidn-C1 com 1 mL de tampão de lyse RIPA por 1 min em RT.
  3. Após cada lavagem, use o rack magnético para adsorvar as contas por 3 min e remova suavemente a solução por pipetting.
  4. Repita as etapas 8.2 e 8.3.
  5. Transfira o extrato de proteína dessalgado para as contas magnéticas conjugadas com streptavidn-C1 equilibradas.
  6. Incubar o tubo a 4 °C durante 12 horas (ou durante a noite) em um rotor para purificar a afinidade das proteínas biotinylated.
  7. Capture as contas em um rack magnético por 4 min em RT até que as contas se recolquem em um lado do tubo, em seguida, remova suavemente o sobrenadante por pipeta.
  8. Adicione 1,7 mL de tampão de lavagem I (2% SDS em água) ao tubo e mantenha-o no rotor em RT por 8 min. Repita o passo 8.3.
  9. Adicionar 1,7 mL de tampão de lavagem II (50 mM HEPES: pH = 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% ácido desoxicoxicolico [w/v], 1% Triton X-100) no tubo e mantê-lo no rotor em RT por 8 min. Repita o passo 8.3.
  10. Adicionar 1,7 mL de tampão de lavagem III (10 mM Tris-HCl: pH = 7,4, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0,1% ácido desoxico [w/v], 1% NP40 [v/v]) no tubo e mantê-lo no rotor em RT por 8 min. Repita o passo 8.3.
  11. Adicione 1,7 mL de 50 mM Tris-HCl (pH = 7,5) para remover o detergente e repita o passo 8.3.
  12. Transfira as contas para um novo tubo de 1,5 mL e repita as etapas 8.11 e 8.3.
  13. Lave as contas 6x por 5 min cada com tampão de bicarbonato de amônio de 50 mM no RT.
  14. Adicione 1 mL de 50 mM tampão de bicarbonato de amônio às contas magnéticas e misture bem.
  15. Remova 100 μL de contas para análise de imunoblot para confirmar o enriquecimento de proteínas biotinyladas. Uma mancha típica ocidental é mostrada na Figura 3.
  16. Congele o resto das amostras de proteínas e armazenada a -80 °C ou envie-as imediatamente para análise de LC-MS/MS em gelo seco.
    NOTA: Os resultados típicos de MS são exibidos em uma publicação anterior (Zhang et al. 2019; Figura 2, Dados Suplementares 1 e Dados Suplementares 2)11. Todos os conjuntos de dados estão disponíveis no MassIVE (encontrado em ) usando o identificador: MSV000083018 e MSV000083019.

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Resultados

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Os dados representativos, que ilustram os resultados esperados com base no protocolo descrito, são adaptados de Zhang et al11. A Figura 1 resume os procedimentos para a realização de PL baseado em TurboID em N. benthamiana. A Figura 2 mostra a expressão proteica e biotinylation nas folhas de N. benthamiana infiltradas. A Figura 3 mostra que as proteínas biotinyladas nas folhas infiltradas fo...

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Discussão

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A ligase de biotina TurboID é gerada pela evolução direcionada baseada em levedura do BioID10. Tem muitas vantagens sobre outras enzimas PL. TurboID permite a aplicação de PL em outros sistemas modelo, incluindo moscas e vermes, cuja temperatura de crescimento ideal é de cerca de 25 °C10. Embora a abordagem pl tenha sido amplamente utilizada em sistemas animais, sua aplicação em plantas é limitada. O protocolo descrito aqui fornece um procedimento passo-a-passo para estabel...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada para revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado por subsídios do Programa Nacional de Ciência e Tecnologia Transgênica (2019ZX08010-003 para Y.Z.), da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (31872637 para Y.Z.), e dos Fundos De Pesquisa Fundamental para as Universidades Centrais (2019TC028 a Y.Z.), e NSF-IOS-1354434, NSF-IOS-1339185 e NIH-GM132582-01 para S.P.D.K.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Espectrofotômetro 721Metash, fabricado na ChinaQ / SXFZ6Para medição OD600< / sub>
Bicarbonato de amônioSigmaA6141-500G
BiotinaSigmaB4639-1G50 mM Centrífuga de estoque
EppendorfCentrífuga 5702
CentrífugaEppendorf5417R
coquetel de inibidor de protease completoRoche11697489001
ácido desoxicólicoSigmaD2510-100G
DL-Ditiotreitol (DTT)VWR Life Science0281-25G
Dynabeads MyOne Streptavidin C1Invitrogen65001para purificação de afinidade
EDTASigmaE6758-500G
Placa ELISACorningCostar 3590
HEPESSigmaH3375-1KG
Ácido clorídrico (HCl)Fisher ScientificA144S-212
Immobilon-P Membrana PVDFMilliporeIPVH00010Para análise de Western blot
Solução de cloreto de lítio (LiCl), 8MSigmaL7026-500ML
Refrigerado de baixa velocidade centrífugaZonkia, fabricada na ChinaKDC-2046Para dessalinizar
Cloreto de Magnésio, Hexahidratado (MgCl2· 6H2O)SigmaM9272-500G
Rack magnéticoInvitrogen123.21DPara adsorção de esferas
Fotômetro de microplaca Multiskan FCThermo Fisher ScientificN07710Para medição OD595 NP-40
(IGEPAL CA-630)SigmaI8896-100ML
Rato anti-HARoche11867423001
Misturador rotacionalKylin-Bell Lab InstrumentWH-986para
incubadora de choqueLabotery, fabricado na ChinaZQPZ-228
Cloreto de sódio (NaCl)Fisher ScientificS271-3
Desoxicolato de sódioSigmaD2510-100G
Dodecil sulfato de sódio (SDS)SigmaL4390-1KG
Estreptavidin-HRPAbcamab7403
Triton X-100Fisher ScientificBP151-100
Trizma baseSigmaT1503-1KG
VortexScientific IndustriesG-560E
Water-jacket IncubadoraBlue pard, fabricada na ChinaGHP-9080Para incubação
AgrobacteriumColuna de dessalinização Zeba ThermoFisher Scientific89893para remoção de biotina
IP

Referências

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