Artigo de método

Rotulagem de proximidade baseada em turboid para identificação na planta de redes de interação proteína-proteína

DOI:

10.3791/60728

⸱

17 de maio de 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Agro-Biotechnology and Ministry of Agriculture Key Laboratory of Soil Microbiology, College of Biological Sciences, China Agricultural University, 2Department of Plant Biology, College of Biological Sciences, University of California, Davis, 3Genome Center, College of Biological Sciences, University of California, Davis

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Descrito aqui é um método de rotulagem de proximidade para identificação de parceiros de interação do domínio TIR do receptor imunológico NLR no tecido da folha Nicotiana benthamiana. Também é fornecido um protocolo detalhado para a identificação de interações entre outras proteínas de interesse utilizando essa técnica em Nicotiana e outras espécies vegetais.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Técnicas de rotulagem de proximidade (PL) utilizando ascorbate peroxidase (APEX) ou Escherichia coli biotin ligase BirA (conhecida como BioID) têm sido usadas com sucesso para identificação de interações proteína-proteína (PPIs) em células de mamíferos. No entanto, os requisitos de peróxido de hidrogênio tóxico (H2O2) em PL baseado em APEX, maior tempo de incubação com biotina (16-24 h) e maior temperatura de incubação (37 °C) em PL baseado em BioID limitam severamente suas aplicações em plantas. O PL baseado em TurboID recentemente descrito aborda muitas limitações do BioID e do APEX. TurboID permite rotulagem rápida de proximidade de proteínas em apenas 10 min sob condições de temperatura ambiente (RT). Embora a utilidade do TurboID tenha sido demonstrada em modelos animais, recentemente mostramos que o PL baseado em TurboID tem melhor desempenho em plantas em comparação com o BioID para rotulagem de proteínas que são proximais a uma proteína de interesse. Desde que aqui esteja um protocolo passo-a-passo para a identificação de parceiros de interação proteica usando o domínio n-terminal Toll/interleukin-1 receptor (TIR) da família de proteínas de nucleotídeo-binding leucina-rich repeat (NLR) como modelo. O método descreve construção vetorial, agroinfiltração de construtos de expressão proteica, tratamento de biotina, extração e dessalização de proteínas, quantificação e enriquecimento das proteínas biotinylated por purificação de afinidade. O protocolo descrito aqui pode ser facilmente adaptado para estudar outras proteínas de interesse em Nicotiana e outras espécies vegetais.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os PPIs são a base de vários processos celulares. Os métodos tradicionais de identificação de PPIs incluem triagem de leveduras-dois híbridos (Y2H) e imunoprecipitação juntamente com espectrometria de massa (IP-MS)1. No entanto, ambos sofrem de algumas desvantagens. Por exemplo, a triagem Y2H requer a disponibilidade da biblioteca Y2H da espécie de planta-alvo ou animal. A construção dessas bibliotecas é trabalhosa e cara. Além disso, a abordagem Y2H é realizada na levedura heteróloga do organismo eucaótico unicelular, que pode não representar o status celular de células eucaóticas mais altas.

Em contraste, o IP-MS m....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA: Uma visão geral do método é mostrada na Figura 1.

1. Preparação do material vegetal

  1. Cultivar sementes N. benthamiana em solo úmido em alta densidade e mantê-las em uma câmara climática com uma luz de 16 horas (cerca de 75 μmol/m2s) e 8 h de fotoperíodo escuro a 23-25 °C.
  2. Cerca de 1 semana depois, transfira cuidadosamente cada muda jovem para potes de 4' x 4' e mantenha as mudas na mesma câmara.
  3. Manter as plantas na câmara por cerca de 4 semanas até que elas cresçam para um estágio de folha de 4-8 para a posterior agroinfiltração

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os dados representativos, que ilustram os resultados esperados com base no protocolo descrito, são adaptados de Zhang et al11. A Figura 1 resume os procedimentos para a realização de PL baseado em TurboID em N. benthamiana. A Figura 2 mostra a expressão proteica e biotinylation nas folhas de N. benthamiana infiltradas. A Figura 3 mostra que as proteínas biotinyladas nas folhas infiltradas fo.......

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A ligase de biotina TurboID é gerada pela evolução direcionada baseada em levedura do BioID10. Tem muitas vantagens sobre outras enzimas PL. TurboID permite a aplicação de PL em outros sistemas modelo, incluindo moscas e vermes, cuja temperatura de crescimento ideal é de cerca de 25 °C10. Embora a abordagem pl tenha sido amplamente utilizada em sistemas animais, sua aplicação em plantas é limitada. O protocolo descrito aqui fornece um procedimento passo-a-passo para estabel.......

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada para revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado por subsídios do Programa Nacional de Ciência e Tecnologia Transgênica (2019ZX08010-003 para Y.Z.), da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (31872637 para Y.Z.), e dos Fundos De Pesquisa Fundamental para as Universidades Centrais (2019TC028 a Y.Z.), e NSF-IOS-1354434, NSF-IOS-1339185 e NIH-GM132582-01 para S.P.D.K.

....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Espectrofotômetro 721Metash, fabricado na ChinaQ / SXFZ6Para medição OD600< / sub>
Bicarbonato de amônioSigmaA6141-500G
BiotinaSigmaB4639-1G50 mM Centrífuga de estoque
EppendorfCentrífuga 5702
CentrífugaEppendorf5417R
coquetel de inibidor de protease completoRoche11697489001
ácido desoxicólicoSigmaD2510-100G
DL-Ditiotreitol (DTT)VWR Life Science0281-25G
Dynabeads MyOne Streptavidin C1Invitrogen65001para purificação de afinidade
EDTASigmaE6758-500G
Placa ELISACorningCostar 3590
HEPESSigmaH3375-1KG
Ácido clorídrico (HCl)Fisher ScientificA144S-212
Immobilon-P Membrana PVDFMilliporeIPVH00010Para análise de Western blot
Solução de cloreto de lítio (LiCl), 8MSigmaL7026-500ML
Refrigerado de baixa velocidade centrífugaZonkia, fabricada na ChinaKDC-2046Para dessalinizar
Cloreto de Magnésio, Hexahidratado (MgCl2· 6H2O)SigmaM9272-500G
Rack magnéticoInvitrogen123.21DPara adsorção de esferas
Fotômetro de microplaca Multiskan FCThermo Fisher ScientificN07710Para medição OD595 NP-40
(IGEPAL CA-630)SigmaI8896-100ML
Rato anti-HARoche11867423001
Misturador rotacionalKylin-Bell Lab InstrumentWH-986para
incubadora de choqueLabotery, fabricado na ChinaZQPZ-228
Cloreto de sódio (NaCl)Fisher ScientificS271-3
Desoxicolato de sódioSigmaD2510-100G
Dodecil sulfato de sódio (SDS)SigmaL4390-1KG
Estreptavidin-HRPAbcamab7403
Triton X-100Fisher ScientificBP151-100
Trizma baseSigmaT1503-1KG
VortexScientific IndustriesG-560E
Water-jacket IncubadoraBlue pard, fabricada na ChinaGHP-9080Para incubação
AgrobacteriumColuna de dessalinização Zeba ThermoFisher Scientific89893para remoção de biotina
IP

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
  2. Kim, D. I., Roux, K. J. Filling the void: proximity-based labeling of proteins in living cells. Trends in Cell Bio....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Rotulagem de Proximidade TurboIDIntera es Prote na Prote naReceptores Imunes NLRNicotiana benthamianaProtocolo de Agroinfiltra oTratamento com BiotinaEnriquecimento com EstreptavidinaAn lise por Western BlotEspectrometria de MassasExtra o de Prote nas Vegetais

Artigos relacionados