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Os PPIs são a base de vários processos celulares. Os métodos tradicionais de identificação de PPIs incluem triagem de leveduras-dois híbridos (Y2H) e imunoprecipitação juntamente com espectrometria de massa (IP-MS)1. No entanto, ambos sofrem de algumas desvantagens. Por exemplo, a triagem Y2H requer a disponibilidade da biblioteca Y2H da espécie de planta-alvo ou animal. A construção dessas bibliotecas é trabalhosa e cara. Além disso, a abordagem Y2H é realizada na levedura heteróloga do organismo eucaótico unicelular, que pode não representar o status celular de células eucaóticas mais altas.
Em contraste, o IP-MS mostra baixa eficiência na captura de PPIs transitórios ou fracos, e também é inadequado para aquelas proteínas com baixa abundância ou alta hidrofobicidade. Muitas proteínas importantes envolvidas nas vias de sinalização vegetal, como quinases semelhantes a receptores (RLKs) ou a família NLR de receptores imunológicos são expressas em níveis baixos e frequentemente interagem com outras proteínas transitoriamente. Por isso, restringe muito a compreensão dos mecanismos subjacentes à regulação dessas proteínas.
Recentemente, métodos de rotulagem de proximidade (PL) baseados em ascorbate peroxidase (APEX) e um mutante Escherichia coli biotin ligase BirAR118G (conhecido como BioID) foram desenvolvidos e utilizados para o estudo de PPIs2,3,4. O princípio da PL é que uma proteína de interesse alvo é fundida com uma enzima, que catalisa a formação de biotinyl-AMP labile (bio-AMP). Estes bio-AMP livres são liberados por enzimas PL e difusos para a proximidade da proteína alvo, permitindo a biotinylação de proteínas proximais nas aminas primárias dentro de um raio estimado de 10 nm5.
Essa abordagem tem vantagens significativas em relação às abordagens tradicionais Y2H e IP-MS, como a capacidade de capturar PPIs transitórios ou fracos. Além disso, o PL permite a rotulagem de proteínas proximais da proteína alvo em seus ambientes celulares nativos. Diferentes enzimas PL têm desvantagens únicas ao aplicá-las em diferentes sistemas. Por exemplo, embora a APEX ofereça cinética de marcação mais alta em comparação com o BioID e seja aplicada com sucesso em sistemas de mamíferos, a exigência de peróxido de hidrogênio tóxico (H2O2) nesta abordagem torna-o inadequado para estudos de PL em plantas.
Em contraste, o PL baseado em BioID evita o uso do Tóxico H2O2, mas a taxa de rotulagem é lenta (exigindo 18-24 h para completar a biotinylação), tornando assim a captura de PPIs transitórios menos eficiente. Além disso, a maior temperatura de incubação (37 °C) necessária para um PL eficiente pelo BioID introduz estresse externo a alguns organismos, como plantas4. Portanto, a implantação limitada de PL baseado em BioID em plantas (ou seja, protoplastos de arroz, Arabidopsis e N. benthamiana) foi relatada6,7,8,9. A enzima TurboID recentemente descrita supera as deficiências do PL. Turbo. TurboID, baseado em APEX e BioID, mostrou alta atividade que permite a realização de PL dentro de 10 min na RT10. O PL baseado em TurboID foi aplicado com sucesso em células, moscas e vermes10. Recentemente, nós e outros grupos de pesquisa otimizamos e ampliamos independentemente o uso de PL baseado em TurboID para estudar PPIs em diferentes sistemas vegetais, incluindo plantas n. benthamiana e arabidopsis e raízes peludas de tomate11,12,13,14. Análises comparativas indicaram que o TurboID tem melhor desempenho para pl em plantas em comparação com o BioID11,14. Também demonstrou a robustez do PL baseado em TurboID na planta, identificando uma série de novas interações com um receptor imunológico NLR11, uma proteína cujos parceiros de interação são geralmente difíceis de obter usando métodos tradicionais.
Este protocolo ilustra o PL baseado em TurboID na planta, descrevendo a identificação de proteínas de interação do domínio N-terminal TIR do receptor imunológico NLR em plantas n. benthamiana. O método pode ser estendido a quaisquer proteínas de interesse em N. benthamiana. Mais importante, fornece uma referência importante para investigar PPIs em outras espécies vegetais, como Arabidopsis,tomate e outras.