Enriquecimento de afinidade simultânea de duas modificações pós-translacionais para quantificação e localização do site

Summary

Este fluxo de trabalho descreve o desempenho do enriquecimento tempo e econômico de múltiplas modificações pós-translacionais de proteínas (PTMs) simultaneamente para análise proteômica global quantitativa. O protocolo utiliza o enriquecimento ptm em nível de peptídeo com múltiplos anticorpos conjugados, seguido pela análise de espectrometria de aquisição independente de dados para obter insights biológicos sobre o crosstalk PTM.

Abstract

Estudar múltiplas modificações pós-translacionais (PTMs) de proteínas é um passo crucial para entender o crosstalk PTM e obter insights mais holísticos sobre a função proteica. Apesar da importância dos estudos de enriquecimento multi-PTM, poucos estudos investigam mais de um PTM por vez, devido parcialmente às despesas, tempo e grandes quantidades proteicas necessárias para realizar múltiplas análises proteômicas globais de PTMs. O enriquecimento de afinidade "um pote" detalhado neste protocolo supera essas barreiras ao permitir a identificação simultânea e quantificação de peptídeos com resíduos de lisina contendo acetilação e sucintação ptMs com baixas quantidades de amostra Entrada. O protocolo envolve a preparação de proteínas provenientes de fígados de camundongos de camundongos toquesirt5, desempenho da digestão de trippsina, enriquecimento para PTMs e desempenho da análise espectrométrica em massa utilizando um fluxo de trabalho de aquisição independente de dados (DIA). Como esse fluxo de trabalho permite o enriquecimento de dois PTMs da mesma amostra simultaneamente, fornece uma ferramenta prática para estudar o crosstalk PTM sem exigir grandes quantidades de amostras, e reduz consideravelmente o tempo necessário para a preparação da amostra, dados aquisição e análise. O componente DIA do fluxo de trabalho fornece informações específicas do PTM abrangentes. Isso é particularmente importante ao estudar a localização do site ptm, pois o DIA fornece conjuntos abrangentes de íons fragmentais que podem ser computacionalmente decifrados para diferenciar entre diferentes isoformas de localização do PTM.

Introduction

Uma miríade de modificações pós-translacionais regulam dinamicamente proteínas e caminhos através de efeitos na atividade¹, sinalização²e rotatividade^3,4. Por exemplo, as quinases proteicas são ativadas ou desativadas pela adição dos grupos de fosfato⁵, e a acetilação de histona e outras modificações fornecem um mecanismo para alterar a estrutura da cromatina e servir como mecanismos regulatórios transcricionales^6,7. Nos últimos anos, surgiram evidências de que vários PTMs trabalham em conjunto ou competem para regular a função proteica ou atividade^8,9,10,11. Portanto, entender o crosstalk ptm é uma necessidade emergente na pesquisa do PTM. No entanto, a maioria dos fluxos de trabalho proteômicos disponíveis para identificar e quantificar os sites de PTM se concentram em modificações únicas, em vez da interação de múltiplas modificações. O fluxo de trabalho descrito correlaciona "pontos quentes" específicos de modificação proteica e resíduos de lisina que são modificados por vários PTMs diferentes.

Há uma necessidade crescente na comunidade científica de métodos viáveis para estudar múltiplos PTMs simultaneamente¹². A maioria dos métodos para identificar e quantificar globalmente os locais de vários tipos de PTMs são desafiadores devido aos altos custos e quantidade de tecido necessários^12,13. Não só os experimentos de enriquecimento multi-PTM são demorados em termos de preparação de amostras, aquisição de dados e análise de dados, mas esses estudos normalmente requerem grandes e muitas vezes quantidades proibitivas de proteína¹¹. Descrito aqui está um protocolo para enriquecimento e análise simultâneo de vários PTMs, que também aborda várias dessas barreiras e permite o perfil ptm em larga escala e avaliação de crosstalk entre vários PTMs¹⁴. Este fluxo de trabalho de um pote descreve uma maneira prática para pesquisadores biomédicos traçarem perfil global de vários PTMs, identificarem peptídeos co-modificados e estudarem o crosstalk PTM de forma eficiente e econômica^14,15.

Aqui, este método é mostrado examinando a acylation de proteína mitocondrial, que foi estudada pela primeira vez há mais de 50 anos,¹⁶. Concentra-se especificamente na acetilação de lisina¹⁷ e na sucinta^18,incluindo a co-ocorrência dessas modificações em proteínas e até mesmo a co-modificação no nível peptídeo. Como o estudo utiliza um modelo de rato-de-nocaute sirtuino 5 (SIRT5), ele foi escolhido para se concentrar no enriquecimento de acetilação e locais de sucinta. Esta decisão foi tomada porque os locais de sucinta são alvos da SIRT5 dessuccinylase e, portanto, espera-se que mostrem uma significativa upregulação em camundongos KO, tornando-os os PTMs mais relevantes neste caso. Ambos os PTMs são biologicamente relevantes como recentemente resumido por Carrico et al.¹⁹. Em geral, a acetilação mostra efeitos importantes na expressão genética e no metabolismo, e a sucinta tem sido relatada para regular o metabolismo cardíaco e a função²⁰.

O protocolo descrito pode ser realizado com baixa quantidade de material de insumo proteico (por exemplo, 1 mg de proteína) e reduz a duração total do experimento reduzindo o tempo gasto para processamento de amostras, aquisição de MS e análise de dados. Um esquema de fluxo de trabalho é fornecido na Figura 1. Também usamos quantidades ainda menores de material inicial (até 100 μg de isato de proteína, reduzindo as quantidades de contas utilizadas em conformidade), o que, como esperado, reduz o rendimento global dos peptídeos acylated identificados; no entanto, ele ainda fornece resultados altamente valiosos e peptídeos acírquios quantificáveis.

Embora os chamados fluxos de trabalho de cima para baixo ou médio-down normalmente não utilizem abordagens de digestão proteolítica (e assim mantenham a conectividade de vários PTMs dentro de uma proteína), este protocolo se concentra em uma abordagem de enriquecimento de afinidade baseada em peptídeo para obter profundidade extra e sensibilidade para identificação e quantificação ptm(Figura 1). Além disso, esse fluxo de trabalho centrado no peptídeo utiliza métodos modernos de espectrometria de massa, incluindo 1) uma combinação de aquisição dependente de dados (DDA) para gerar bibliotecas espectrais e 2) aquisição independente de dados (DIA) para quantificação ptm precisa em um fluxo de trabalho sem rótulos.

Os fluxos de trabalho do DIA superam a amostragem de esquemas típicos de varredura dda, fragmentando abrangentemente todos os sinais de peptídeo dentro da faixa m/z^{amostrada 21}. Esse recurso também é extremamente benéfico em termos de localização do site, pois é mais fácil obter informações sobre quais íons específicos de fragmentos são modificados dentro do peptídeo. Além disso, os fluxos de trabalho dia permitem a identificação e quantificação de pequenas isoformas ptm-peptídeos com íons precursores idênticos. Os métodos DIA também podem determinar uma localização específica do site PTM dentro de um peptídeo com base em íons específicos correspondentes que são amplamente medidos em todos os momentos. No entanto, as abordagens dda muitas vezes utilizam características de "exclusão dinâmica" que excluem múltiplas amostragem de MS/MS para o mesmo íon precursor, perdendo assim pequenas isoformas PTM.

A estratégia simultânea de enriquecimento aqui descrita é idealpara estudos que se beneficiarão do perfil global e quantificação de vários PTMs, examinando o crosstalk ptm e entendendo as interações dinâmicas das modificações pós-translacionais. A identificação de múltiplos PTMs enriquecidos em um fluxo de trabalho combinado foi descrita por: enriquecimento global, serial ou paralelo do PTM contendo peptídeos proteolíticos, ou, alternativamente, pela análise de proteínas intactas. Em comparação direta com o enriquecimento serial da acetilação e sucintação, a eficiência da metodologia de um pote foi estabelecida como sendo muito semelhante^{a 14}. Esses protocolos alternativos exigem quantidades significativas de material e tempo iniciais e podem ser proibitivamente caros. Em contrapartida, o protocolo de um pote fornece um método barato e eficiente para enriquecimento de mais de um PTM com análise e identificação subsequentes.

Os tecidos hepáticos do rato são obtidos de ratos sirt5 e são usados aqui como material inicial. Este protocolo também pode ser realizado para lisates proteicos de diferentes tecidos ou experimentos de cultura celular. Este protocolo pode ser aplicado a lisates proteicos obtidos a partir de tecidos ou pelotas de cultura celular.

Protocol

Todos os experimentos descritos no protocolo seguem as diretrizes do Comitê Institucional de Pesquisa Animal do Instituto Buck.

1. Extração de proteína de tecido homogeneizado e digestão com protease

1. Prepare novamente o tampão de lise para uma concentração final de 8 M de uérea, 50 mM de bicarbonato de trietilmonio (TEAB), 1 μM trichostatin A (TSA), nicotinamida de 20 mM, cloreto de sódio de 75 mM (NaCl), 1x protease/foshatase coquetel inibidor (PIC) com hPLC-água.
2. Adicione uma folha de aço estéril a um tubo de 2 mL compatível com um homogeneizador de moagem de papel, em seguida, coloque a peça de tecido (tamanho de ervilha) no tubo. Adicione tampão de lise (500 μL) e vórtice brevemente para garantir que o buffer cubra a peça do tecido (adicione mais buffer de lise, se necessário). Coloque tubos em conjuntos adaptadores pré-refrigerados, garantindo que os tubos sejam equilibrados entre os dois adaptadores do homogeneizador.
3. Homogeneize amostras 2x a 25 Hz por 3 min cada a 4 °C. Se o tecido não estiver totalmente homogeneizado, gire os tubos brevemente e transfira o lisato homogeneizado para um tubo de 1,5 mL recém-rotulado. Em seguida, adicione adicional tampão de lise à peça de tecido restante e repita a homogeneização 2x a 25 Hz por 3 min cada. Duas rodadas de homogeneização são tipicamente suficientes para quebrar o tecido.
4. Remova o bico de metal com uma pinça. Entre cada amostra, enxágue a pinça com água de grau HPLC, metanol de grau HPLC e água de grau HPLC novamente.
5. Combine os lisates homogeneizados se duas rodadas de homogeneização forem aplicadas e sonsone amostras com um ultrassom por 10 ciclos a 30 s on/30 s off e 4 °C em alta potência.
6. Centrífuga sates homogeneizadas em 14.000 x g por 10 min a 4 °C para limpar o lysate. Transfira o supernatant (lisato limpo) para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, evitando qualquer camada de gordura que possa sentar em cima do supernatant e quaisquer detritos na parte inferior do tubo.
7. Realizar um ensaio de ácido bicinchoníco (BCA) para medir a concentração de proteínas do lisato limpo com diluição adequada (por exemplo, 1:20 e/ou 1:200). De acordo com os resultados do BCA, a alíquota de 1 mg de proteína de cada amostra.
8. Reduza as proteínas em dithiothreitol de 4,5 mM (DTT) a 37 °C para 30 min com agitação a 1.400 rpm. Posteriormente, proteínas alquiladas em iodoacetamide de 10 mM (IAA) com incubação no escuro (lugar na gaveta ou armário) à temperatura ambiente (RT) por 30 min.
   NOTA: Podem ser utilizados reagentes alternativos, como N-ethylmaleimide (NEM) em vez de AAA.
9. Adicione 50 mM TEAB às amostras para diluir a concentração de uéia para abaixo de 2 M. Spot 1 μL da amostra em um papel pH para garantir que o pH da amostra diluída esteja entre 7,0-8,5. Adicione a trippsina a cada amostra a uma proporção de 1:50 (trippsina-à-proteína, wt/wt) e digerir a proteína com agitação a 37 °C durante a noite (cerca de 14-16 h).
10. Apagar os digeres com 10% de ácido fórmico para atingir 1% de ácido fórmico no dia seguinte. Vórtice e giro brevemente. Localize 1 μL da amostra em tiras de pH para garantir que o digesté seja pH = 2-3. Amostras de centrífuga sem 1.800 x g para 15 min na RT para compor qualquer material insolúvel.

2. Saltamento de peptídeos proteolíticos não enriquecidos através de extração em grande escala de fase sólida

1. Obtenha cartuchos contendo resina C18 que podem ligar até 10 mg de proteína. Encaixe esses cartuchos em um aparelho de vácuo para usar sucção de vácuo que pode puxar o líquido através do cartucho durante cada uma das etapas a seguir. Designe um cartucho para cada amostra de peptídeo.
2. Adicione 800 μL de aceonitrila de 80% (ACN) em ácido formico de 0,2% aos cartuchos com 19,8% de água e use sucção a vácuo para puxar o líquido. Repita esta etapa 1x, evitando a secagem dos cartuchos completamente.
3. Equilibre os cartuchos adicionando 800 μL de ácido fórmico de 0,2% na água com sucção de vácuo para puxar todo o volume através do filtro. Repita este 2x. Carregue peptídeos nos cartuchos com sucção de vácuo. Lave peptídeos 2x com 800 μL de 0,2% de ácido fórmico na água sucção de vácuo.
4. Disponha tubos de microcentrífuga de 1,5 mL cada cartucho para coletar peptídeos na etapa final. peptídeos de elute de sucção a vácuo de cartuchos, primeiro com 800 μL de 80% ACN em 0,2% de ácido fórmico e 19,8% de água, depois com 400 μL da mesma solução. Seque as amostras de peptídeo salgados completamente em um concentrador de vácuo (2-3 h).

3. Enriquecimento simultâneo de peptídeos k-acesatas e k-sucintas com contas de imunoafinidade

1. Resuspender os peptídeos secos em 1,4 mL de tampão de purificação de imunoafinidade (IAP) frio. Vórtice para misturar e garantir um pH de ~7. Amostras de centrífuga a 10.000 x g por 10 min a 4 °C. Uma pequena pelota pode aparecer.
2. Reserve peptídeos no gelo enquanto prepara as contas anticorpos. Para um tubo de K-acetil e tubo de pasta de bico de anticorpo K-ssuccinyl (volume: 100 μL de chorume por tubo), adicione 1 mL de soro fisiológico (PBS) e misture por tubulação. Transfira toda a solução para um novo tubo de 1,5 mL e gire em uma centrífuga em miniatura por 30 s na RT.
3. Aspirar o PBS, tomando cuidado para evitar aspirar qualquer contas. Repita a lavagem 3x lavando novamente com 1 mL de PBS frio de 1x, centrifugiing para 30 s na RT e aspirando fora da PBS.
4. Resuspender as contas em cerca de 440 μL de PBS. Um quarto do número de contas em cada tubo PTM (100 μL, fornecido pelo fabricante) é usado para o enriquecimento de um pote (cerca de 62,5 μg de cada anticorpo imobilizado para contas de anticorpos K-acetil e K-succinyl). Pipette as contas várias vezes para misturar bem. Remova 100 μL de contas de anticorpos acetil-lisina e transfira para um tubo com dicas precut de 200 μL, garantindo que o mix mestre permaneça consistentemente bem misturado.
5. Faça o mesmo com as contas de anticorpos sucinta-lisina removendo 100 μL de contas de anticorpos sucinta-lisina ao tubo para alcançar partes iguais do anticorpo acetil-lisina e anticorpo sucinta-lisina em cada tubo. Gire para baixo por 30 s em uma centrífuga em miniatura e aspirar fora da mídia com ponta de carregador de gel (contas ficarão brancas).
   NOTA: Cada tubo deve ter uma pelota de feijão semelhante na parte inferior.
6. Pipette o peptídeo resuspenso diretamente sobre as contas lavadas. Tenha cuidado para evitar qualquer pelota (adicione rapidamente para evitar secar as contas). Incubar os peptídeos com contas a 4 °C durante a noite com agitação.

4. Elução dos peptídeos ligados a contas de anticorpos

1. Gire as amostras de peptídeo a 2.000 x g por 30 s a 4 °C. Remova o supernatant contendo peptídeos desvinculados e guarde para experimentos futuros, se desejar. Adicione 1 mL de tampão IAP frio de 1x às contas para lavar e misturar invertendo 5x. Gire a 2.000 x g por 30 s a 4 °C. Aspirar a solução IAP e repetir o passo de lavagem IAP 1x para um total de duas lavhes.
2. Adicione 1 mL de água HPLC fria às contas e misture invertendo 5x. Gire a 2.000 x g por 30 s a 4 °C. Aspirar fora da água. Repita o passo de lavagem d'água duas vezes para um total de três lavantes. Gire um tempo adicional em 2.000 x g para 30 s a 4 °C para coletar qualquer água restante no fundo do tubo. Aspirar qualquer água extra que possa ter coletado com pontas de carregamento de gel de ponta plana. Tenha cuidado para evitar aspirar as contas.
3. Adicione 55 μL de 0,15% de ácido trifluorocético na água às contas. Incubar as contas por 10 min na RT enquanto ocasionalmente bate na parte inferior do tubo para misturar. Gire as contas na RT por 30 s em uma centrífuga em miniatura. Remova os peptídeos eluted e reserve usando uma ponta de carregamento de gel de ponta plana.
4. Adicione 45 μL de 0,15% de ácido trifluorocético na água às contas. Incubar por 10 min na RT enquanto bate na parte inferior do tubo ocasionalmente para misturar. Gire as contas na RT por 30 s em uma centrífuga em miniatura. Remova a segunda elusão usando uma ponta de carregamento de gel de ponta plana e combine com a primeira elusão.
5. Gire os peptídeos combinados em 12.000 x g por 5 min na RT para pelotas quaisquer contas que sobrecarregam. Transfira a solução de amostra de peptídeos para um novo tubo de 500 μL.
   NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.

5. Dessalgado de peptídeos enriquecidos

NOTA: O pH das amostras deve ser inferior a 4 para uma ligação ideal à ponta contendo resina C18. Use uma ponta de pipeta de 10 μL contendo 0,6 μL de resina C18 e uma pipeta de 10 μL para controlar a ponta.

1. Pré-musculoso a ponta C18, canalizando 10 μL de acetoonitrile na ponta. Dispense acecetonitrile em resíduos. Repita esta etapa mais duas vezes.
2. Equilibre a ponta lavando 3x com 10 μL de ácido fórmico de 0,2% na água. Dispense a solução em resíduos após cada equilíbrio.
3. Carregue peptídeos da amostra na ponta, canalizando e distribuindo amostra de peptídeo enriquecido com a ponta. Pipette para cima e para baixo repetidamente pelo menos 20x e dispensar a solução restante da ponta.
4. Lave a ponta contendo peptídeo vinculado com 10 μL de ácido fórmico de 0,2% na água. Dispense a solução em resíduos. Repita esta etapa 9x.
5. Peptídeos de elute em um novo tubo usando 10 μL de um tampão de elução contendo 0,2% de ácido formico, acetoonitrila de 50% e 49,8% de água. Repetidamente pipette e dispensar a 10 μL de solução dentro do novo tubo 15x. Repita esta etapa com um adicional de 10 μL de tampão de elução, repetidamente encaneando no mesmo tubo que a elusão anterior.
6. Peptídeos secos completamente no concentrador a vácuo (aproximadamente 20 min). Resuspender os peptídeos secos em volume adequado de 0,2% de ácido fórmico na água.
   NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.

6. Aquisição de dados usando DDA e DIA

NOTA: Analise as amostras com métodos DDA e DIA LC-MS/MS, que podem ser ajustadas dependendo do instrumento espectrométrico de massa disponível. Aqui, as amostras foram analisadas usando um sistema HPLC 2D nano-LC acoplado a um espectrômetro de massa de alta resolução.

1. Use um sistema HPLC combinado com um sistema HPLC de plataforma baseado em chip diretamente conectado a um espectrômetro de massa (muitas configurações e sistemas LC-MS também podem ser usados).
2. Análise de amostras utilizando fase inversa HPLC-ESI-MS/MS
   1. Após a injeção, transfira as misturas de peptídeos para um chip de pré-coluna C18 e desal os peptídeos lavando com fase móvel A a 2 μL/min por 10 min. Em seguida, transfira os peptídeos para uma coluna analítica e lute a uma taxa de fluxo de 300 nL/min com um gradiente de 2-3 h usando as fases móveis A e B. Especificamente, use um gradiente linear de 5% da fase móvel B para 35% da fase móvel B acima de 80 min.
   2. Posteriormente, rampe a fase B móvel para 80% acima de 5 min, depois mantenha-se em 80% B por 8 min antes de retornar a 5% B para um reequilíbrio de 25 min.
3. Construa um método de instrumento de MS para DDA e defina os seguintes experimentos de varredura de instrumentos
   1. Experimento 1: Varredura precursora do MS1 de m/z 400-1.500 (tempo de acumulação de 250 ms). Defina o limiar de intensidade para desencadear exames de MS/MS para ions de carga estados de 2-5 a 200 contagens. Definir a exclusão dinâmica dos íons precursores para 60 s.
   2. Experimento 2: Varredura de íons de produtos MS/MS com uma varredura MS2 variam de m/z 100-1.500 (tempo de acumulação de 100 ms por cada varredura de íons de 30 produtos por ciclo). Defina o spread de energia de colisão para CES = 5, em seguida, selecione o modo devarredura de íonsdo produto de alta sensibilidade ".
      NOTA: O método DDA adquirirá espectros de MS/MS para os 30 íons precursores mais abundantes após cada pesquisa MS1 digitalpor ciclo, e o tempo total do ciclo será de ~3,3 s. Aquisições dDA serão usadas para construir bibliotecas espectrais conforme descrito na seção 7.
4. Construir um método de instrumento de MS para DIA e definir os seguintes experimentos de varredura de instrumentos.
   1. Experimento 1: realizar o exame precursor do MS1 de m/z 400-1.250 (tempo de acumulação de 250 ms).
   2. Experimento 2: realizar varreduras de íons de produtos MS/MS para 64 segmentos de SWATH variável com uma faixa de varredura MS2 de m/z 100-1.500 (tempo de acumulação de 45 ms por cada digitalização de íons de 64 produtos por ciclo). Defina o spread de energia de colisão para CES = 10, em seguida, selecione o modo devarredura de íonsdo produto de alta sensibilidade ".
   3. Use a estratégia de aquisição da janela variável 64 DIA/SWATH, conforme descrito por Schilling et al.²² para obter quantificação sem rótulos com um tempo de ciclo total de ~3,2 s. Resumidamente, nesta aquisição, em vez do quadrupole Q1 transmitindo uma faixa de massa estreita através da célula de colisão, uma janela mais ampla de largura variável da janela (5-90 m/z) é passada em etapas incrementais sobre toda a gama de massa (m/z 400 -1.250 com 64 segmentos SWATH, cada um com um tempo de acumulação de 45 ms, produzindo um tempo de ciclo de 3,2 s, que inclui um Exame MS111 com um tempo de acumulação de 250 ms).
      NOTA: A largura variável da janela é ajustada de acordo com a complexidade da corrente típica de íonS MS1 observada dentro de uma certa gama m/z usando um algoritmo de calculadora de janela variável²² (janelas mais estreitas são escolhidas em faixas m/z "ocupadas", janelas largas em faixas m/z com poucos ions precursores eluting). Em outras plataformas de instrumentos ms, outras estratégias de janela DIA podem ser implementadas.

7. Análise de dados

NOTA: Algumas configurações de análise de dados devem ser alteradas e adaptadas ao experimento específico. Por exemplo, o banco de dados de proteínas (arquivo FASTA) selecionado depende da espécie a partir da qual a amostra foi preparada (aqui, Mus musculus). Abaixo, a análise de dados para amostras de camundongos enriquecidas para peptídeos acessa e sucintas é descrita.

1. Use um mecanismo de pesquisa de banco de dados ms para analisar aquisições de DDA. Crie um método de mecanismo de busca de banco de dados da seguinte forma:
   1. Para parâmetros de descrição da amostra: selecioneIdentificaçãoTipo de Amostra, selecioneÁcido IodoáceoAfinação Cysteine, selecioneTrypsinDigestão (assumindo decote c-terminal em lysine e arginina), selecioneTripleTOF 6600Instrumento, Fatores Especiais, verifique ênfase em Acetilação e Enriquecimento de Succinilation, e selecione Mus musculus Espécies.
   2. Para parâmetros específicos de processamento: selecionemodificações biológicaso ID Focus, selecioneSwissProtno Banco de Dados, verifiqueID CompletoEsforço de Pesquisa, selecione0,05 (10%)em Limiar de Proteína Detectado, e verifiqueExecutar análisede taxa de descoberta falsa Qualidade de Resultados. Salve o método do mecanismo de busca e envie os arquivos brutos espectrométricos em massa para processamento pelo mecanismo de pesquisa do banco de dados usando o método gerado.
      NOTA: Em um processo iterativo, todas as varreduras de MS e MS/MS são automaticamente recalibradas pelo mecanismo de busca com base em anotações iniciais e resultados.
2. Clique em "Exportar Peptide Resumo" após a conclusão da pesquisa e filtrar todos os resultados de identificação peptídeos por um "limiar de confiança" de 99 em um software de planilha (por exemplo, Excel; falsa taxa de descoberta [FDR] de 1%).
3. No arquivo de planilha "Peptide Summary", filtro para todos os peptídeos que contêm a anotação PTM "acetilação" e "sucintação" na coluna de modificação para gerar um relatório de resultados para apresentar exclusivamente os peptídeos acylated e suas proteínas correspondentes.
4. Para construir bibliotecas espectrais MS/MS para processamento posterior do arquivo bruto DIA e maior quantificação relativa, abra o Software de Análise Quantitativa dia. Selecione a aba "Biblioteca", em seguida(na parte inferior da página) clique em "Gerar biblioteca espectral" do "Database Search Engine" e abra um relatório FDR do Database Search Engine (o arquivo *FDR.xlsx), que foi gerado automaticamente como parte do processo de pesquisa do banco de dados de arquivos brutos DDA. Em seguida, clique em "next" e selecione o "LibrarySettings Schema" e "em seguida". Selecione "Uniprot_mouse_proteome" como banco de dados, em seguida, clique "próximo" e "goa_mouse" como o arquivo de anotação genética (ontologia). Por fim, clique em "finalizar",e a biblioteca espectral será gerada.
   NOTA: Informações sobre os peptídeos acessais e sucintas dos arquivos de dados brutos do DDA, varreduras precursoras de íons do MS1 e varreduras de íons fragmentados do MS2 serão incluídas nas bibliotecas espectrais (isso inclui tempo de retenção, padrão de fragmentação MS/MS, etc.).
5. Use o software de análise quantitativa de proteômica DIA para realizar quantificação relativa dos níveis de acetilação e sucinta e criar planilhas de peptídeos que contenham PTM que possam ser usados para análise de dados adicionais.
   1. Para analisar e quantificar peptídeos contendo PTM, abra o Software de Análise Quantitativa do DIA, use o esquema de análise de modelos. O esquema de modelo está disponível no software selecionando a opção "Perspectivas de Configurações" | "DIA Análise" | "BGS PTMs" (significativo ou esparso, dependendo do experimento).
      NOTA: Em vez de usar o modelo de análise BGS PTM no Software de Análise Quantitativa do DIA, todas as configurações específicas do PTM também podem ser configuradas manualmente seguindo estas instruções: 1)identificação, selecionelocalização PTM(corte de probabilidade = 0,75); 2) em "quantificação", selecione "pequeno agrupamento peptídeo" | "sequência modificada"; e 3)pós-análise, selecioneagrupamento de abundância diferencial| "grupo menor" (configurações de quantificação). Essas configurações ativarão o recurso de localização ptm para que os peptídeos modificados sejam listados como entradas individuais e análise diferencial sejam realizadas no nível peptídeo.
   2. Para iniciar a Análise quantificação, selecione a aba "Pipeline" e clique em "Configurar uma análise dia a partir do arquivo", abra os arquivos brutos de interesse do MS DIA para quantificação relativa. Selecione "Atribuir Biblioteca Espectral" e selecione a biblioteca que foi construída acima, clique "carga" | "próximo". Selecione o esquema de análise "BGS PTMs" e clique "em seguida". Selecione o arquivo FASTA de banco de dados apropriado "Uniprot_mouse_proteome" | "próximo". Defina a configuração da condição, que atribui as diferentes condições às amostras, e clique "em seguida". Selecione "goa_mouse" como o arquivo de anotação genética (ontologia) e clique "em seguida". Revise a visão geral da análise (resumo da configuração do experimento) e selecione "diretório de saída" | "final". Finalmente, clique em "Run Pipeline" para realizar a análise quantitativa livre de rótulos.
      NOTA: Módulos estatísticos do Dia Quantitative Analysis Software realizam automaticamente análise de FDR, geram mapas de calor e parcelas de vulcão comparando as diferentes condições, geram listas de peptídeos e proteínas identificados e quantificados e fornecem Valores Q, juntamente com alterações relativas do fold comparando condições diferentes.
6. Como alternativa, use software para remoção de interferência de conjuntos de dados DIA para processamento de dados e realização de análise estatística após exportar as áreas de pico extraídas para locais de acetilação e sucinta.

8. Visualização de dados de peptídeos modificados e avaliação da localização do site ptm

1. Para abrir uma análise quantitativa dia gerada selecione a aba "Análise" seguida por "carregar o Experimentode Software de Análise Quantitativa " (de um experimento salvo abrindo um *. Arquivo SNE). Navegue até o *. Arquivo de resultados do SNE e selecione "aberto".
2. No painel esquerdo, clique na seta à esquerda do terceiro arquivo raw *.wiff da parte superior para expandir e visualizar todos os 64 segmentos SWATH. Clique na seta à esquerda do segmento [428.7-437.3] para expandir o segmento específico e exibir os peptídeos modificados identificados para esta gama de massa. Clique no peptídeo carregado triplamente KQYGEAFEK[Acetyl]R.
   NOTA: Por padrão, o painel superior direito normalmente exibe o MS2 XIC, e o painel inferior exibe MS1 Isotope Envelope XIC
   1. No painel superior, selecione "PtM Localization Plot". No painel inferior, selecione "PtM Localization Plot".
   2. No Enredo de Localização ptm, selecione a sequência de peptídeos superior "KQYGEAFEK[Acetyl]R", com uma pontuação total de localização ptm de 18.32. Clique na seta à esquerda para expandir a visualização e visualizar os íons confirmados e refutantes. Clique na seta ao lado do "Confirmar íons", em seguida, selecione o íon "y3 [+42]" para destacar esse íon em particular, que confirma que o site de acetilação está localizado no K2 da sequência peptídea.
   3. No Enredo de Localização ptm selecione a segunda sequência de peptídeos "K[Acetyl]QYGEAFEKR" com uma pontuação total (muito baixa) de localização PTM de 1. Clique na seta à esquerda para expandir a visualização e visualizar os íons confirmados e refutantes. Clique na seta ao lado do "Confirmar íons", em seguida, na seta ao lado dos "Refutantes Íons", em seguida, selecione alguns íons fragmentados para visualizar e avaliar o cromromatograma de íon extraído e espectro de MS/MS (Figura 5).
      NOTA: O escore de localização ptm atribuído e a inspeção visual indicam que o isomer PTM correto é KQYGEAFEK[Acetyl]R, enquanto não existe ou evidência mínima para o outro possível isomer PTM K[Acetyl]QYGEAFEKR.

Results

A Figura 1 mostra um diagrama geral do fluxo de trabalho, incluindo a colheita do tecido dos fígados de camundongos, o uso de 1 mg de proteína para digerir o lysato protetina com trippsina, incubar peptídeos com contas conjugadas por anticorpos, adquirir as amostras no MS e finalmente realizar análise dia/swath dos dados usando vários pacotes de software proteômico quantitativo (acadêmico e comercial).

A Figura 2A mostra como o cronograma do fluxo de trabalho e as quantidades de amostra e proteína necessárias, em comparação com métodos alternativos que estão sendo utilizados atualmente para estudos de enriquecimento multi-PTM. O método de um pote pode ser realizado pela metade do tempo e com metade do número de amostras quanto esses métodos alternativos. Comparado com o método de enriquecimento de dois PTM único, o protocolo de um pote também requer metade da quantidade de proteína.

Este protocolo tem se mostrado uma alternativa viável e econômica. A Figura 2B mostra que o coeficiente mediano de variação (CV) para áreas modificadas de peptídeos foi menor no método de um pote do que nos enriquecimentos uniptm e ptm serial. A Figura 2C,D mostra que, ao comparar os métodos de enriquecimento PTM e single-PTM, não foram evidentes diferenças notáveis entre as correlações das quantificações de nível do local para as duas modificações. Isso também era verdade para as correlações de nível peptídeo e fragmentado. A mesma observação foi realizada para as três correlações ao comparar os enriquecimentos de um pote e PTM em série. Todos os dados brutos subjacentes de MS e folhas de resultados processadas do Excel associadas a um relatório recente da Basisty et al.¹⁴ estão disponíveis e podem ser baixados no MassIVE (MSV000081906) e ProteomeXchange (PXD0008640).

Em geral, embora estratégias de enriquecimento de anticorpos possam mostrar certas limitações, como oclusão potencial de epítopo ou especificidade limitada, os anticorpos utilizados neste estudo são misturas de clones gerados independentemente e, portanto, fornecem faixas mais amplas de Especificidades.

Os resultados experimentais documentam a possibilidade de detectar e avaliar o crosstalk ptm. A Figura 3 exibe dados de um enriquecimento bem sucedido e ilustra um exemplo para um peptídeo contendo múltiplas e diferentes modificações acyl visualizando o crosstalk PTM. Figura 3A mostra um peptídeo que é acessado em um resíduo de lisina e sucinta no outro, e a Figura 3B mostra o mesmo peptídeo sucinta em ambas as lisinas. Isso demonstra que o mesmo resíduo de lisina pode ser modificado com ambos os grupos de acylation, e há a possibilidade de crosstalk ocorrer naquele local. A Figura 4 apresenta o número de resíduos de lisina identificados como descritonos nos trechos 7.1-7.3 para levar ambas as modificações, apontando também para possíveis crosstalk ptm.

Como demonstra a Figura 5, o processamento de conjuntos de dados DIA PTM com software quantitativo de proteômica nos permite identificar quais resíduos específicos de lisina são modificados. Trata-se de um conceito conhecido como localização do site, que é um passo essencial para qualquer análise para determinação de possível crosstalk PTM. A Figura 5 exibe duas isoformas potenciais, juntamente com os íons confirmados e refutantes para cada um que pudessem ser visualizados e avaliados conforme descrito nas seções 8.1-8.3 (especificamente passos 8.3.2 e 8.3.3). Com base nessas informações, conseguimos identificar com confiança qual das duas isoformas estava presente na amostra original. O espectro MS/MS do isoform confirmado KQYGEAFEKacR demonstra claramente que os íons y (y₂-y₅) contendo o resíduo de lisina acesina, que mudou de 42 m/z (a massa incremental de um grupo de acetil), confirmou o resíduo específico de lisina no peptídeo modificado.

Figura 1: Fluxo de trabalho típico para enriquecimento de um pote de PTMs. Os tecidos (aqui, fígados) são colhidos de camundongos SIRT5 KO e tipo selvagem (WT), e as proteínas são lised, tessapsin-digeridas em peptídeos e salted. Peptídeos são então enriquecidos pela imunoafinidade com combinações de contas de anticorpo sucinta e acetil. Fluxos de trabalho de MS paralelos medem ambos 1) pequenas alíquotas de mudanças de expressão proteica inteira (para normalização da proteína) e 2) peptídeos enriquecidos contendo acylation para identificação do local de acylation (DDA-MS) e localização do local, seguido pela quantificação (DIA-MS). Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figura 2: Comparação do fluxo de trabalho de um pote com métodos alternativos. (A)Comparação de tempo, custos e materiais necessários para o fluxo de trabalho de um pote, enriquecimento em série-PTM e dois enriquecimentos de PTM. (B)Comparação de CVs entre o fluxo de trabalho de um pote, o enriquecimento PTM de acetil-lysina único e o enriquecimento ptm único sucinta-lsine. Análise de correlação de lança comparando as áreas de pico do peptídeo acyl obtidas a partir do fluxo de trabalho de um pote, e os enriquecimentos de um único PTM: parcelas correspondentes dos resultados da área de pico log2 para locais de acetilação(C)e(D)locais de sucinta. As encostas de regressão e os fatores de correlação são indicados nos painéis individuais¹⁴. Duas réplicas biológicas independentes foram processadas para cada uma das condições. Este número foi modificado de Basisty et al.¹⁴. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figura 3: Crosstalk entre acetilação e modificações de sucinta de resíduos de lisina. Espectro de espectra speto de ms/MS de peptídeos triptróticos de tisindrial 3-ketoacyl-CoA thiolase que mostram a mesma sequência de aminoácidos, mas foram modificados em dois resíduos de lisina com diferentes PTMs. (A)MS/MS do peptídeo AANEAGYFNEEMAPIEVKsuccTKacK e (B) MS/MS do peptídeo AANEAGYFNEEMAPIEVKsuccKsuccK. Este número foi modificado de Basisty et al.¹⁴. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figura 4: Sobreposição e conversa cruzada entre os resíduos de lisina acessa e sucintas – exemplos específicos em complexos proteicos. (A)diagrama de Venn exibindo sobreposição entre 2.235 acetilação e 2.173 locais de sucinta. Destes, 943 locais foram acesiados e sucintas. Fígado de um rato-nocauteado SIRT5 (dessssério) foi analisado, e muitos locais de sucinta foram identificados. Na verdade, eles eram mais abundantes do que normalmente observados no fígado do rato (peptídeos modificados foram filtrados a um valor Q de <0,05). (B) Complexos proteicos que mostram a porcentagem de suas subunidades contendo locais acesilados e sucintas (linha vermelha ousada representa a importância determinada pelo teste exato de Fisher). (C) Diagrama do complexo de sintetizador ATP: subunidades proteicas em vermelho retratam as subunidades que contêm locais acessais e sucintas. Este número foi modificado de Basisty et al.¹⁴. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figura 5: O software quantitativo de proteômica decifra a localização do site peptídeo de PTMs. Com base na fragmentação de MS/MS do peptídeo, é possível fornecer informações sobre o resíduo específico de lisina que o grupo acetil está modificando. Isso mostra a capacidade do software de oferecer informações valiosas sobre a localização do site de PTMs. (A) Duas possibilidades de modificação de resíduo sine e localização do site PTM: KQYGEAFEKacR (esquerda) e KacQYGEAFEKR (à direita). "Confirmar" e "refutar" íons fragmentados são mostrados para cada uma das possíveis isoformas de localização do local do peptídeo. Com base nessas informações, são atribuídos pontuações e pontuações refutantes, confirmando a presença de isoform KQYGEAFEKacR na amostra. (B) Espectro MS/MS correspondente ao isoform confirmado KQYGEAFEKacR indicando que todos os íons y, incluindo o resíduo de lisina acessina (y₂ e superior) carregam uma massa incremental de +42 m/z, que corresponde à modificação acetila. Os íons b observados não contêm a modificação. (C) Cromatografia de íon extraído (XIC) com áreas de pico abundantes resultantes de y₂ e_{y 3} íons, ambos compõem o site de acetilação no isoform confirmado KQYGEAFEKacR. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Discussion

Este protocolo descreve uma nova técnica para o enriquecimento simultâneo de múltiplos PTM para entender mais efetivamente o crosstalk ptm. Métodos alternativos de atingir esse objetivo tendem a ser proibitivamente demorados e caros, e exigem grandes quantidades de proteína para serem bem sucedidos^11,13. Este protocolo apresenta um fluxo de trabalho de enriquecimento multi-PTM que envolve incubação em contas conjugadas por anticorpos para dois PTMs ao mesmo tempo para melhorar a eficiência geral do experimento. Este método também envolve o uso de DDA para geração de bibliotecas espectrais e aquisições dia MS para detectar e quantificar os peptídeos presentes com interferência reduzida de íons fragmentados^22,23. Programas de software, como os mecanismos de pesquisa de banco de dados ms são usados para analisar e quantificar dados de aquisições de DDA, enquanto o Quantitative Proteomics Software²⁴ e o software específico de análise quantitativa DIA²⁵ são necessários para interpretar o espectro complexo produzido pelas aquisições da DIA.

Existem vários passos críticos dentro deste protocolo que devem ser seguidos cuidadosamente. Como o principal objetivo do protocolo é enriquecer para vários PTMs simultaneamente, a etapa de enriquecimento anticorpo-afinidade (seção 2) é fundamental para o sucesso do experimento. Ao realizar lava-jatos nas contas, é necessário garantir que nenhuma das contas seja aspirada acidentalmente. Garantir que a concentração de ureia tenha sido diluída para 1 M antes da digestão com a trippsina (passo 1.8) também é necessária. Embora a ureia de 8 M seja exigida no protocolo de solubilização proteica, as concentrações de ureia acima de 1 M inibirão a atividade enzimática da trippsina. Além disso, é importante verificar consistentemente o pH da amostra em todo o protocolo. Isso é especialmente importante antes da digestão. Se o pH da amostra e a solução de trippsina não forem neutralizados adequadamente antes da incubação, pode resultar em uma digestão ineficiente em que muitos locais de decote podem ser perdidos, resultando em menos identificações de peptídeos.

Algumas modificações no protocolo podem ser úteis ao preparar amostras. Para um lysate de proteína adquirido a partir de 1 mg de material inicial, um quarto das contas de anticorpos fornecidas em cada tubo de varredura PTM pode ser usada como uma alternativa econômica. Uma maior quantidade de material inicial pode ser usada para melhores resultados, desde que a quantidade de contas de anticorpos utilizadas seja aumentada proporcionalmente. Outra modificação que pode melhorar o fluxo de trabalho é digerir amostras com outro protease, além da trippsina. Essa modificação resultaria em mais variabilidade nos peptídeos, proporcionando maior cobertura de resíduos proteicos. Embora não seja necessário, recomenda-se que a metese seja uma das enzimas utilizadas para análise de PTM devido à sua alta especificidade do decote²⁶.

Uma limitação desse protocolo é que os PTMs que estão sendo estudados precisam ter químicas semelhantes para serem enriquecidos simultaneamente¹⁴. Os procedimentos para as diferentes contas conjugadas por anticorpos devem ser semelhantes, utilizando solventes e soluções semelhantes, incluindo condições de elusão semelhantes e, preferencialmente, do mesmo fornecedor. Por essa razão, o método aqui descrito usa consistentemente acetilação e sucinta como exemplo, ambos usam contas conjugadas com anticorpos (Cell Signaling Technology, Inc). Embora esse método possa teoricamente ser aplicado a qualquer número de PTMs, seriam necessários estudos adicionais para avaliar a limitação exata do protocolo nesse sentido. Além disso, como se trata de um método de enriquecimento baseado em anticorpos, o método só pode fornecer uma quantificação relativa dos sites de PTM.

Em comparação com os métodos de enriquecimento multi-PTM existentes, esse fluxo de trabalho é uma alternativa mais viável e econômica. A partir deste experimento, observou-se que a eficácia deste método se compara extremamente bem com métodos alternativos, como enriquecimentos individuais ou seriais. A Figura 2B mostra que o CV mediano das áreas de pico de peptídeos modificados foi realmente diminuído no método de um pote em comparação com enriquecimentos de PTM único e enriquecimentos de PTM em série¹³. Analisamos ainda os resultados experimentais avaliando as quantificações do nível do local para acetilação ou sucinta. Além disso, a análise de correlação de Spearman (Figura 2C,D) demonstrou que o enriquecimento ptm de um pote teve desempenho semelhante aos fluxos de trabalho de enriquecimento de um único PTM. Isso também era verdade para as correlações de peptídeo e fragmentação. A mesma observação foi realizada para as três correlações ao comparar um pote com enriquecimento serial-PTM.

Esse protocolo permite que os pesquisadores façam insights biológicos fascinantes sobre o crosstalk PTM de forma rápida e econômica. O componente DIA do fluxo de trabalho permite que os pesquisadores entendam mais sobre os PTMs, pois fornece informações sobre localização do local e supera desafios como baixa ocupação de PTMs. Os íons precursores tendem a ser excluídos com DDA, o que é particularmente importante ao estudar PTMs, pois a ocupação do local muitas vezes é baixa ao ponto em que esses peptídeos não são selecionados para MS/MS, mas ainda contêm informações cruciais. Experimentos de acompanhamento poderiam ser realizados para avaliar o limite superior de quantos PTMs podem ser enriquecidos simultaneamente usando este método. Uma melhoria futura desse fluxo de trabalho pode incluir o desenvolvimento de plataformas de software mais avançadas para automatizar ainda mais a análise da localização do site e a ocupação do site ptm.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M Tampão de biocarbonato de trietilamônio (TEAB)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA	T7408
Acetonitrile, Burdick e Jackson Grau LC-MS	Burdick and Jackson, Muskegon, MI, EUA	36XL66
Bioruptor sonicator	Diagenode, Denville, NJ, EUA	B01020001
chip de pré-coluna C18 (200 µ m x 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 um, 120 A)	SCIEX, Framingham, MA, USA	5015841
chip C18-CL (75 µ m x 15 cm ChromXP, 3 µ m, 300 &)	SCIEX, Framingham, MA, USA	804-00001
Dithiothreitol (DTT)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	D9779-5G
Eppendorf Thermomixer Compact	Eppendorf AG, Hamburgo, Alemanha	T1317-1EA
Eppendorf Tube (2.0 mL Safelock)	Eppendorf AG, Hamburgo, Alemanha	22363352
Ácido fórmico	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	F0507-500ML
Padrão de peptídeo de normalização de tempo de retenção indexado (iRT)	Biognosys AG, Schlieren, Zurique, Suíça	Ki-3002-2
Iodoacetamida (IAA)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA	I1149-25G
mapDIA		link da web	para remoção de interferência de conjuntos de dados DIA
Metanol, Burdick e Jackson LC-MS grau	Burdick e Jackson, Muskegon, MI, EUA	BJLC230-4
PURELAB flex 1 dispensador de água ultrapura	VWR International, Radnor, PA, EUA	89204-088
mProphet in Skyline		incorporado no Skyline algoritmos	estatísticos integrados para avaliações FDR
Cartuchos Oasis HLB SPE	Waters Corp., Milford, MA, EUA	WAT094225	cartuchos para dessalinização de lisados de proteínas, até 50 mg de material
Solução salina tamponada com fosfato	Life Technologies	10010023
Pierce BCA Assay	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	23225
ProteinPilot 5.0 - 'MS database search engine'SCIEX	, Framingham, MA, USA	download de software SCIEX	MS mecanismo de pesquisa de banco de dados
PTMScan Succinil-Lysine Motif [Succ-K] Kit #13764	Cell Signaling Tecnologia	13764	grânulos de anticorpos para enriquecimento de afinidade
PTMScan Motivo de acetil-lisina [Ac-K] Kit #13416	Tecnologia de sinalização celular	13416	grânulos de anticorpos para enriquecimento de afinidade
Tripsina liofilizada de grau de sequenciamento	Life Technologies	23225
Skyline - 'Software de Proteômica Quantitativa'MacCoss	lab (acadêmico)	software	de código abertoSoftware de Proteômica Quantitativa (acadêmico)
Spectronaut - 'DIA Quantitative Analysis	Software'Biognosys AG, Schlieren, Zurique, Suíça	Sw-3001	DIA Software de Análise Quantitativa / PTM localização do local
Thermo Scientific Savant SPD131DDA Speedvac Concentrator	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA	Instrumento SPD131DDA-115	para concentrar o volume líquido de amostras
TissueLyser II	Qiagen, Hilden, Alemanha	85300	instrumento para lise eficiente de tecido
Ácido trifluoroacético (TFA)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA	T6508-1L
TripleTOF 6600: espectrômetro de massa de tempo de voo quadrupolo ortogonol (QqTOF)	SCIEX, Framingham, MA, EUA	Por cotação	espectrômetro de massa de alta resolução
Ultra Plus sistema de HPLC	2D nano-LCSCIEX, Divisão Eksigent, Framingham, MA, EUA	Sistema de separação cromatográfica	Modelo #845
Ureia	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA	PI29700
Água, Burdick e Jackson LC-MS	Burdick e Jackson, Muskegon, MI, EUA	600-30-76
Ponteiras de pipeta ZipTip C18, P10	Merck Millipore Ltd, Tullagreen, Carrigtwohill, Co. Cork, IRL	ZTC18S096	Pontas carregadas com resina C-18 para dessalinização de misturas de peptídeos