Artigo de método

Uso de embriões congelados para produção de ratos geneticamente modificados

DOI:

10.3791/60808

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2 de abril de 2020

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1Max Planck Florida Institute for Neuroscience, 2Life Science Research Center, University of Toyama, 3Department of Biochemical Engineering, Graduate School of Science and Engineering, Yamagata University, 4Graduate School of Innovative Life Science, University of Toyama, 5Department of Biochemistry, Faculty of Pharmacy, Cairo University, 6Division of Regenerative Medicine, Center for Molecular Medicine, Jichi Medical University, 7Division of Stem Cell Research and Drug Development, Center for Development of Advanced Medical Technology, Jichi Medical University, 8Synthetic Biology Division, Research Center for Advanced Science and Technology, University of Tokyo, 9Institute for Advanced Biosciences, Keio University, 10Graduate School of Media and Governance, Keio University, 11Department of Molecular Oncology, Graduate School of Medicine, Chiba University, 12Department of Biological Sciences, School of Science, University of Tokyo, 13College of Arts and Sciences, University of Tokyo

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Aqui, apresentamos um método modificado para criopreservação de embriões unicelulares, bem como um protocolo que acoplar o uso de embriões congelados e eletroporação para a geração eficiente de camundongos geneticamente modificados.

Resumo

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O uso de camundongos geneticamente modificados (GM) tornou-se crucial para entender a função genética e decifrar os mecanismos subjacentes das doenças humanas. O sistema CRISPR/Cas9 permite que os pesquisadores modifiquem o genoma com eficiência, fidelidade e simplicidade sem precedentes. Aproveitando essa tecnologia, os pesquisadores estão buscando um protocolo rápido, eficiente e fácil para a geração de ratos GM. Aqui introduzimos um método aprimorado para criopreservação de embriões unicelulares que leva a uma maior taxa de desenvolvimento dos embriões congelados. Ao combiná-lo com condições de eletroporação otimizadas, este protocolo permite a geração de ratos nocaute e knock-in com alta eficiência e baixas taxas de mosaico em um curto espaço de tempo. Além disso, mostramos uma explicação passo a passo do nosso protocolo otimizado, abrangendo preparação de reagente CRISPR, fertilização in vitro, criopreservação e descongelamento de embriões unicelulares, eletroporização de reagentes CRISPR, geração de mouses e genotipagem dos fundadores. Usando este protocolo, os pesquisadores devem ser capazes de preparar ratos GM com facilidade, velocidade e eficiência incomparáveis.

Introdução

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O sistema de repetições palindrômicas curtas interespaçadas regularmente interespaçadas (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) é um avanço científico que proporciona uma modificação direcionada sem precedentes no genoma1. O sistema CRISPR/Cas9 é composto por proteína Cas9 e rna guia (gRNA) com dois componentes moleculares: um RNA CRISPR específico para alvo (crRNA) e um RNA CRISPR transativador (tracrNA)2 . Um gRNA direciona a proteína Cas9 para o lócus específico no genoma, 20 nucleotídeos complementares ao crRNA, e adjacentes ao protoespaço adjacente (PAM). A proteína Cas9 liga-se à seqüência de destino e induz qu....

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Protocolo

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Todos os cuidados e procedimentos realizados neste estudo foram realizados de acordo com as regras e regulamentos do Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Cuidados Animais de Laboratório da Universidade de Toyama, Universidade de Tóquio, Universidade de Jichi e Instituto Max Planck de Neurociências da Flórida. As informações sobre todos os reagentes são mostradas na Tabela de Materiais.

1. Design de reagentes CRISPR

  1. design de crRNA
    1. Visite o CRISPR direct19 (https://crispr.dbcls.jp/) para projetar crRNAs específicos com ....

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Resultados

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Nosso método modificado para criopreservação de embriões unicelulares, incluindo a incubação em HTF contendo 20% de FBS por 10 min seguido de criopreservação em 1 M DMSO e da solução DAP213, melhorou a taxa de desenvolvimento dos embriões congelados no estágio de duas células (Figura 1, p = 0,009, teste t do aluno). Os embriões congelados foram utilizados para a produção de camundongos GM e as condições de eletroporação foram otimizadas: cinco repetições de 25 V com pulsos de 3 ms e interval.......

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Discussão

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O protocolo descrito permite a geração de camundongos GM com alta eficiência e baixas taxas de mosaico(Tabela 1). Ele permite que pesquisadores sem habilidades avançadas de manipulação de embriões criem camundongos mutantes facilmente porque ele aproveita os mais recentes e mais úteis avanços em tecnologias de engenharia reprodutiva e edição de genomas: CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP) e eletroporção em embriões congelados. Esses avanços facilitaram e aceleraram a geração dos ratos GM. Como descrito n.......

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Divulgações

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Os autores não têm divulgações financeiras relevantes.

Agradecimentos

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Queremos agradecer hitomi Sawada e Elizabeth Garcia pelo cuidado com os animais. Este trabalho foi apoiado por KAKENHI (15K20134, 17K11222, 16H06276 e 16K01946) e Hokugin Research Grant (para H.N.), e Jichi Medical University Young Investigator Award (para H.U.). A Fundação de Bolsas Otsuka Toshimi apoiou o M.D.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,25 M SacaroseARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japão)SACAROSE
1 M DMSOARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japão)1M DMSO
ButorphanolMeiji Seika Pharma Co., Ltd. (Tóquio, Japão)Vetorphale 5mg
Proteína Cas9: Alt-R® S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLSIntegrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)1081060
Camundongos C57BL/6JJapan SLC (Hamamatsu, Japão)N/A
DAP213ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japão)DAP213
FBSSigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO)ES-009-C
hCGMOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD (Tóquio, Japão)HCG Mochida 3000
HTFARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japão)HTF
Camundongos ICRJapan SLC (Hamamatsu, Japão)N/A
IsofluranoPetterson Vet Supply, Inc. (Greeley, CO)07-893-1389
KSOMARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japão)KSOM
LN2 TankChart Industries (Ball Ground, GA)XC 34/18
M2ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japão)M2
MedetomidinaNippon Zenyaku Kogyo Co.,Ltd. (Koriyama, Japão)1124401A1060
MicroscópioNikon Co. (Tóquio, Japão)SMZ745T
MidazolamSandoz K.K. (Tóquio, Japão)1124401A1060
Tampão livre de nucleaseIntegrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)1072570
Kitde extração de DNA NucleospinTakara Bio Inc (Kusatsu, Japão)740952 .5
Vidro deslizante de um furoMatsunami Glass Ind., Ltd. (Kishiwada, Japão)S339929
Eletroporador tipo uma etapaBEX Co., Ltd. (Tóquio, Japão)CUY21EDIT II
Parafina LíquidaNACALAI TESQUE Inc. (Kyoto, Japão)SP 26137-85
Eletrodo de placa de platinaBEX Co., Ltd. (Tóquio, Japão)LF501PT1-10, GE-101
PMSGASKA Animal Health Co., Ltd (Tóquio, Japão)SEROTROPIN 1000
Iodeto de povidonaProfessional Disposables International, Inc. (Orangeburg, NY)C12400
Meio essencial mínimo de soro reduzido: OptiMEM ISigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO)22600134
Eletroporador tipo duas etapasNepa Gene Co., Ltd. ( Ichikawa, Japão)NEPA21

Referências

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  1. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  2. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA - guided DNA endonuclease ....

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