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Artigo de método

Uso de embriões congelados para produção de ratos geneticamente modificados

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DOI:

10.3791/60808

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2 de abril de 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Max Planck Florida Institute for Neuroscience, 2Life Science Research Center, University of Toyama, 3Department of Biochemical Engineering, Graduate School of Science and Engineering, Yamagata University, 4Graduate School of Innovative Life Science, University of Toyama, 5Department of Biochemistry, Faculty of Pharmacy, Cairo University, 6Division of Regenerative Medicine, Center for Molecular Medicine, Jichi Medical University, 7Division of Stem Cell Research and Drug Development, Center for Development of Advanced Medical Technology, Jichi Medical University, 8Synthetic Biology Division, Research Center for Advanced Science and Technology, University of Tokyo, 9Institute for Advanced Biosciences, Keio University, 10Graduate School of Media and Governance, Keio University, 11Department of Molecular Oncology, Graduate School of Medicine, Chiba University, 12Department of Biological Sciences, School of Science, University of Tokyo, 13College of Arts and Sciences, University of Tokyo

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um método modificado para criopreservação de embriões unicelulares, bem como um protocolo que acoplar o uso de embriões congelados e eletroporação para a geração eficiente de camundongos geneticamente modificados.

Resumo

O uso de camundongos geneticamente modificados (GM) tornou-se crucial para entender a função genética e decifrar os mecanismos subjacentes das doenças humanas. O sistema CRISPR/Cas9 permite que os pesquisadores modifiquem o genoma com eficiência, fidelidade e simplicidade sem precedentes. Aproveitando essa tecnologia, os pesquisadores estão buscando um protocolo rápido, eficiente e fácil para a geração de ratos GM. Aqui introduzimos um método aprimorado para criopreservação de embriões unicelulares que leva a uma maior taxa de desenvolvimento dos embriões congelados. Ao combiná-lo com condições de eletroporação otimizadas, este protocolo permite a geração de ratos nocaute e knock-in com alta eficiência e baixas taxas de mosaico em um curto espaço de tempo. Além disso, mostramos uma explicação passo a passo do nosso protocolo otimizado, abrangendo preparação de reagente CRISPR, fertilização in vitro, criopreservação e descongelamento de embriões unicelulares, eletroporização de reagentes CRISPR, geração de mouses e genotipagem dos fundadores. Usando este protocolo, os pesquisadores devem ser capazes de preparar ratos GM com facilidade, velocidade e eficiência incomparáveis.

Introdução

O sistema de repetições palindrômicas curtas interespaçadas regularmente interespaçadas (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) é um avanço científico que proporciona uma modificação direcionada sem precedentes no genoma1. O sistema CRISPR/Cas9 é composto por proteína Cas9 e rna guia (gRNA) com dois componentes moleculares: um RNA CRISPR específico para alvo (crRNA) e um RNA CRISPR transativador (tracrNA)2 . Um gRNA direciona a proteína Cas9 para o lócus específico no genoma, 20 nucleotídeos complementares ao crRNA, e adjacentes ao protoespaço adjacente (PAM). A proteína Cas9 liga-se à seqüência de destino e induz quebras de fios duplos (DSBs) que são reparadas por uma junção final não homologo (NHEJ) propensa a erros ou reparação dirigida à homologia de alta fidelidade (HDR)3,,4,5. O NHEJ leva a inserções ou/e exclusões (indels) e, portanto, à perda genética da função quando uma seqüência de codificação é direcionada. O HDR leva à edição precisa do genoma na presença de um modelo de reparo contendo seqüências de homologia3,4,5. O NHEJ e o HDR foram aproveitados para gerar nocaute e knock-in, respectivamente.

Embora o sistema CRISPR/Cas9 tenha acelerado significativamente a geração de ratos GM com excelente eficácia e fidelidade, cientistas que aplicam esses métodos frequentemente encontram desafios técnicos. Em primeiro lugar, os protocolos convencionais requerem microinjeção para introduzir as ferramentas de edição CRISPR no pronúcleo de ovos fertilizados6,7. Essa técnica é demorada e geralmente requer treinamento extensivo. Assim, vários grupos substituíram a microinjeção por eletroporação88,9,10,,11,12,13. No entanto, nos primeiros protocolos de eletroporação foram utilizados embriões frescos para eletroporação. Isso causou outro problema, pois preparar embriões frescos antes de cada experimento é difícil14.

Recentemente, nós e outros combinamos o uso de embriões congelados e eletroporação para edição de genomas, o que facilita a geração de camundongos GM15,16. Este protocolo permite que pesquisadores sem habilidades avançadas de manipulação de embriões gerem rapidamente modelos animais de doenças humanas com alta eficiência. O protocolo também reduz significativamente os desafios práticos na geração de camundongos GM, como a heterogeneidade genética nos fundadores16. Para superar o mosaico, realizamos a eletroporação dos reagentes CRISPR dentro de 1h após o descongelamento do embrião para garantir que a edição ocorra antes da primeira replicação do genoma. Outra melhoria inclui o uso da proteína Cas9 em vez de Cas9 mRNA para reduzir o mosaico indesejável17. Além disso, desenvolvemos um método ideal para criopreservação de embriões unicelulares que aumenta a taxa de desenvolvimento para o estágio16de duas células : o uso de soro bovino fetal (FBS) melhora drasticamente a sobrevivência de oócitos congelados após a fertilização, talvez pelo mesmo mecanismo que torna os oócitos não fertilizados congelados mais resistentes18.

Aqui apresentamos um protocolo abrangente para a geração de camundongos GM usando embriões congelados, incluindo o método modificado para criopreservação de embriões C57BL/6J de células únicas. Inclui 1) design gRNA, preparação e montagem de reagentes CRISPR; 2) FIV, criopreservação e descongelamento de embriões unicelulares; 3) Eletroporização dos reagentes CRISPR em embriões congelados; 4) Transferência de embriões para o oviduto de camundongos pseudogestantes; e 5) Genotipagem e análise de seqüência dos animais fundadores do F0.

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Protocolo

Todos os cuidados e procedimentos realizados neste estudo foram realizados de acordo com as regras e regulamentos do Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Cuidados Animais de Laboratório da Universidade de Toyama, Universidade de Tóquio, Universidade de Jichi e Instituto Max Planck de Neurociências da Flórida. As informações sobre todos os reagentes são mostradas na Tabela de Materiais.

1. Design de reagentes CRISPR

  1. design de crRNA
    1. Visite o CRISPR direct19 (https://crispr.dbcls.jp/) para projetar crRNAs específicos com locais fora do alvo reduzidos.
      NOTA: Existem muitas outras ferramentas úteis para projetar o crRNA20 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/wereview/crisprtools/).
    2. Insira a seqüência de nucleotídeos de destino e faça as seguintes alterações:
      Requisito de seqüência PAM = NGG
      Verificação de especificidade = Genoma do mouse (Mus musculus), GRCm38/mm10 (Dez, 2011)
      NOTA: Como exemplo, para gerar ratos nocauteadores tyrosinase (Tyr), exon 2 (seqüência de nucleotídeos de 9476-9692) foi alvo.
    3. Clique em Designe, para obter hits altamente específicos, marque Somente mostrar alvo altamente específico.
    4. Para reduzir potenciais efeitos fora do alvo, escolha a seqüência de destino com o menor valor nas colunas de "12 mer+PAM" e "8 mer+PAM".
      NOTA: Nestas colunas, ("1") indica que a seqüência tem apenas uma combinação perfeita com o local de destino pretendido e números maiores que um indicam a presença de potenciais locais fora do alvo.
    5. Encomendar os oligonucleotídeos resultantes das empresas de síntese de CRRNA(Tabela Supplimentary 1).
      NOTA: Para o gene exon 2 Tyr, utilizou-se a seguinte seqüência de destino: GGACCACTATTACAATCC, com +TGG como a seqüência PAM(Figura 2A).
  2. Design de oligodeoxinucleotídeo de uma única vertente (ssODN) para experimentos de edição mediados por HDR (ou seja, geração de ratos knock-in).
    1. Projete o comprimento do ssODN em torno de 80-180 bp, incluindo 30-60 braços de homologia nucleotídeos (nt) em ambos os lados.
      NOTA: Um ssODN de comprimento de 75-85 nt, incluindo um braço de homologia de 30-35 nt e complementar ao gRNA, mostrou alta eficiência de edição knock-in21.
    2. Insira a modificação pretendida e a mutação silenciosa na seqüência PAM ou, se não possível, na base vizinha de 5′ do PAM para bloquear o recorte após a edição do genoma.
      NOTA: O crRNA e o ssODN utilizados neste estudo estão listados na Tabela Suplementar 1.

2. Fertilização in vitro, criopreservação de embriões e congelamento

  1. Fertilização in vitro
    1. Superovulate C57BL/6J camundongos fêmeas (4 ou 8 semanas de idade) por injeção ip com gonadotropina de soro de égua grávida (PMSG) seguido de injeção com gonadotropina coriônica humana de 7,5 UI (hCG) após 48 h.
      NOTA: O número de oócitos ovulados pode ser aumentado em cerca de 3x usando ultra-superovulação22.
    2. Remova os epidéios cauda de camundongos machos c57BL/6J sexualmente maduros (3-5 meses de idade).
      NOTA: É possível coletar espermatozoides sem sacrificar os ratos machos.
    3. Extrair coágulos de espermatozoides com uma agulha dissecante e incuba-los em uma gota de 200 μL de fluido tubal humano (HTF) na incubadora de CO2 por 1,5 h para capacitação.
    4. Coletar complexos cumulus-oócitos (COCs) dos ovidutos 16-18 h após a injeção de hCG e incuba-los em uma nova gota de 200 μL de médio HTF coberto com líquido de parafina em uma incubadora de CO2 (5% CO2, 37 °C) para não mais de 2 h.
      NOTA: É preferível sacrificar os camundongos por luxação cervical anestesia, pois a eutanásia via inalação de CO2 afeta a FIV e o desenvolvimento de embriões23.
    5. Adicione 1-5 μL de suspensão de esperma do limite do meio de incubação à gota de 200 μL do meio HTF contendo COCs e incuba-os em uma incubadora de CO2 por 3 h.
    6. Lave os oócitos com o meio de otimização simplex (KSOM) 3x suplementado por potássio para remover as células remanescentes de espermatozoides e cumulus.
    7. Verifique a formação pronuclear e o grau de embriões de uma célula usando um microscópio invertido.
  2. Criopreservação de embriões unicelulares
    1. Incubar embriões de uma célula em uma gota de 200 μL de HTF contendo 20% de FBS (não coberto com líquido de parafina) por 10 min em uma incubadora de CO2.
    2. Transferir 20-100 embriões para 50 μL de 1 M de solução de sulfóxido de dimetila (DMSO)24.
    3. Transfira 5 μL de uma solução contendo 100 embriões para o fundo de um criotubo e esfrie por 5 min a 0 °C usando um refrigerador ou no gelo.
    4. Adicione 45 μL de dap213 (2 M dimetil sulfóxido, 1 M acetamide e 3 M propilenoglicol) lentamente ao longo da parede do tubo, tampe os tubos e mantenha por 5 min em um refrigerador ou no gelo a 0 °C.
      NOTA: Não aperte as tampas com muita força para removê-las facilmente durante o descongelamento da amostra.
    5. Armazene tubos rapidamente em nitrogênio líquido.
  3. Descongelamento de embriões
    1. Abra a tampa do criotubo, descarte o nitrogênio líquido restante e adicione 900 μL de solução de sacarose de 0,25 M pré-aquecida a 37 °C.
      NOTA: A solução de sacarose de 0,25 M deve ser aquecida com 37 °C de antecedência porque o uso de solução a frio diminui a viabilidade do embrião após o descongelamento.
    2. Pipet rapidamente por 10x e transfira o conteúdo do criotubo para um prato de plástico.
      NOTA: A pipetação deve ser realizada com cuidado, para que não sejam geradas bolhas e danifiquem os embriões.
    3. Lave os oócitos fertilizados morfologicamente normais 2x no meio KSOM coberto com líquido de parafina e mantenha-os em uma incubadora de CO2 até a eletroporação.

3. Montagem e eletroporação de reagentes CRISPR

NOTA: Para a eletroporação, utilizou-se um eletrodo de placa de platina (altura: 0,5 mm, comprimento: 10 mm, largura: 3 mm, abertura: 1 mm) e um eletroporatipo de uma etapa que foram descritos anteriormente8 (Tabela de Materiais). Um eletroporador de duas etapas também pode ser usado(Tabela de Materiais).

  1. Preparação e montagem de reagentes CRISPR
    1. Peça reagentes CRISPR (ou seja, crRNA, tracrNa e proteína Cas9) e ssODN se realizarem experimentos de edição mediados por HDR(Tabela de Materiais e Tabela Suplementar 1).
    2. Prepare a solução de recozimento da seguinte forma.
      1. Prepare 1 μg/μL crRNA e 1 μg/μL tracrRNA em solução de meio essencial mínimo de soro reduzido(Tabela de Materiais),e adicione 6 μL de cada solução a 42 μL do buffer sem nuclease.
      2. Incubar a mistura no aquecedor seco a 95 °C por 3 min e esfriar em RT por 5 min.
      3. Prepare 1 μg/μL de proteína HiFi Cas9 diluída em Opti-MEM I e adicione 6 μL à mistura anterior para um volume total de 60 μL.
      4. Ao realizar experimentos de edição mediados por HDR, adicione 6 μL de 1 μg/μL ssODN. Como o volume final deve ser de 60 μL, use 36 μL de água sem nuclease na etapa 3.1.2.1.
        NOTA: A concentração final de crRNA, tracrRNA, proteína Cas9 e ssODN será de 100 ng/μL.
      5. Transfira até 100 embriões para 25 μL da mistura final (complexo RNP) em um único orifício e incuba-os a 37 °C por 10 min.
  2. Electroporation
    1. Preencha a lacuna do eletrodo com 6 μL da nova mistura de reagentes CRISPR e adicione 20-25 embriões à mistura.
      NOTA: É importante evitar qualquer contato entre os embriões e o eletrodo de eletroporação, que pode danificar embriões durante pulsos elétricos.
    2. Realize a eletroporação nas seguintes condições para um eletroporador tipo uma etapa:
      Tensão: 25 V, direção de pulso (Pd) +
      ON: 3 ms, OFF: 97 ms
      Repetições: 5x
      NOTA: A eletroporação não deve ser realizada mais do que 1 h após o descongelamento para garantir que a edição do genoma ocorra antes da primeira replicação do DNA para evitar o mosaico.
    3. Para um eletroporador tipo duas etapas, defina as condições da seguinte forma:
      Pulso de Poring = 40V, Pd +
      ON = 1 ou 2,5 ms; Intervalo de pulso = 50 ms
      Repetições: 4x, Decadência 10%

      Pulso de transferência = 5 ou 7V; Pd +/-.
      ON: 50 ms; Intervalo de pulso = 50 ms.
      Repetições = 5x; Decadência = 40%.
      NOTA: É importante ajustar o volume para manter a impedância dentro da faixa específica especificada pelo fabricante.
    4. Lave os embriões 3x com o tampão bicarbonato krebs-ringer modificado 2 (M2) seguido por duas lavantes com uma gota de ksom médio coberto com líquido de parafina.
    5. Incubar os embriões lavados (em meio KSOM) em uma incubadora de CO2 durante a noite para posterior transplante.

4. Transferência de embriões

  1. Prepare ratos pseudogestantes. Camundongos fêmeas Mate ICR (3-6 meses) com camundongos machos vasectomizados 1 dia antes da transferência do embrião (ET).
    NOTA: Os ratos devem ser verificados na manhã seguinte para um plugue copulatório. Os ratos com um plugue são considerados pseudográvidas e podem ser usados para ET.
  2. Ar aspirado e KSOM (sem líquido de parafina) em intervalos alternativos de 2-3 mm em um capilar de vidro como marcador para implantação bem sucedida.
  3. Introduza 20-24 embriões em uma gota de 200 μL de KSOM (sem líquido de parafina) e desenhe 10-12 embriões no capilar de vidro para implantação em cada oviduto.
  4. Anestesiar os camundongos fêmeas por isoflurano (inalação) ou uma injeção ip de uma solução que combina medetomidina/midazolam/butorphanol (0,3 mg/kg, 4,0 mg/kg e 5,0 mg/kg, respectivamente). Posicione o mouse anestesiado em seu lado ventral em uma almofada de aquecimento. Proteja os olhos do rato anestesiado com um gel hidratante.
  5. Raspe ao longo da parte inferior da linha média dorsal e desinfete a área com iodo povidone seguido com 70% de etanol.
  6. Faça uma incisão longa de ~1 cm paralela à linha média dorsal.
  7. Tire o oviduto e coloque em uma cortina de plástico estéril. Mantenha-o úmido usando soro quente estéril.
  8. Coloque o oviduto o microscópio estereoscópico.
  9. Faça um buraco na parede do oviduto entre o infundibulum e a ampulla alguns milímetros a montante da ampulla por uma tesoura de micromola.
  10. Insira a ponta do capilar de vidro contendo os embriões no orifício e sopre suavemente no porta-voz do suporte capilar para expelir os embriões até que uma bolha de ar seja visível na ampola.
    NOTA: Transferência entre 10 a 12 embriões por oviduto.
  11. Retire o capilar de vidro da parede do oviduto e empurre o órgão reprodutor suavemente de volta para a cavidade corporal.
  12. Repita o processo anterior para introduzir os embriões no outro oviduto.
  13. Ao completar o procedimento ET, sutura o peritôono com um padrão de sutura simples interrompido (50, absorvíveis, suturas sintéticas trançadas) e, em seguida, a pele com um padrão simples interrompido ou um padrão de ponto subcuticular enterrado (60 suturas monossintéticas não absorvíveis).
  14. Mantenha o rato aquecido em uma placa de aquecimento de 37 °C até que se recupere da anestesia.
  15. Monitore a saúde do animal diariamente durante 7 dias após a cirurgia.

5. Genotipagem e análise de seqüência

  1. Extração de DNA genômico
    NOTA: Usamos kits de extração de DNA de tecido NucleoSpin para extrair o DNA genômico do tecido auditivo dos camundongos seguindo as recomendações do fabricante.
    1. Adicione 180 μL de tampão T1 e 25 μL de solução Proteinase K à amostra e misture por vórticagem para 10 s.
    2. Incubar a 56 °C por 2h ou até obter a lólise completa. Vórtice para 10 s a cada 30 min da incubação.
    3. Adicione 200 μL de Tampão B3, vórtice vigorosamente para 30 s e incubar a 70 °C por 10 min.
    4. Adicione 210 μL de 100% de etanol à amostra e vórtice vigorosamente.
    5. Para cada amostra, coloque uma coluna de tecido em um tubo de coleta e aplique a amostra na coluna.
    6. Centrifugação por 1 min a 11.000 x g,descarte o fluxo e coloque a coluna de volta no tubo de coleta.
    7. Adicione 500 μL de Tampão BW para lavar a amostra (1ª lavagem), centrífuga por 1 min a 11.000 x g,descarte o fluxo e coloque a coluna de volta no tubo de coleta.
    8. Adicione 600 μL de Tampão B5 à coluna (2ª lavagem), centrífuga por 1 min a 11.000 x g,descarte o fluxo e coloque a coluna de volta no tubo de coleta.
    9. Centrifugar a coluna por 1 min a 11.000 x g para secar a membrana de sílica e colocar a coluna de tecido NucleoSpin em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
    10. Adicione 100 μL de Buffer BE, incubar à temperatura ambiente por 1 min, depois centrífuga 1 min a 11.000 x g.
  2. Amplificação e purificação de PCR
    1. Projete os primers usando o site primer3 plus (https://primer3plus.com/) a fim de amplificar uma seqüência de 400-500 bp em torno do lócus alvo.
    2. Projete um novo protocolo PCR e teste-o empiricamente.
    3. Purifique o produto PCR para remover as enzimas indesejadas, nucleotídeos, primers e componentes tampão. Um método padrão de purificação pode ser usado da seguinte forma.
      1. Adicione 50 μL de fenol a 50 μL dos produtos PCR e misture por vórtice.
      2. Centrifugar por 1 min a 11.000 x g e transferir a camada superior transparente para um novo tubo.
      3. Adicione 120 μL de 99,5% de etanol e 20 μL de acetato de amônio de 5 M e vórtice para 30 s.
      4. Mantenha em RT por 10 min e centrífuga a 11.000 x g por 10 min.
      5. Descarte o sobrenadante e lave a pelota de DNA com 1 mL de 70% de etanol.
      6. Seque a pelota em RT por 10 min e dissolva em 10 μL de água livre de RNase.
        NOTA: Os kits de purificação baseados em colunas PCR são recomentados porque o fenol é tóxico para os seres humanos.
  3. Sequenciamento de Sanger
    1. Executar a análise de quantificação de DNA (ver Tabela de Materiais) para quantificar o amplicon PCR purificado.
    2. Envie produtos PCR e primer seqüenciamento para um provedor de serviços de seqüenciamento.
    3. Analise a sequência usando os sites online disponíveis.
      NOTA: Neste estudo, o CRISP-ID25 (http:/crispid.gbiomed.kuleuven.be/) foi utilizado para análise de seqüência.

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Resultados

Nosso método modificado para criopreservação de embriões unicelulares, incluindo a incubação em HTF contendo 20% de FBS por 10 min seguido de criopreservação em 1 M DMSO e da solução DAP213, melhorou a taxa de desenvolvimento dos embriões congelados no estágio de duas células (Figura 1, p = 0,009, teste t do aluno). Os embriões congelados foram utilizados para a produção de camundongos GM e as condições de eletroporação foram otimizadas: cinco repetições de 25 V com pulsos de 3 ms e interval...

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Discussão

O protocolo descrito permite a geração de camundongos GM com alta eficiência e baixas taxas de mosaico(Tabela 1). Ele permite que pesquisadores sem habilidades avançadas de manipulação de embriões criem camundongos mutantes facilmente porque ele aproveita os mais recentes e mais úteis avanços em tecnologias de engenharia reprodutiva e edição de genomas: CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP) e eletroporção em embriões congelados. Esses avanços facilitaram e aceleraram a geração dos ratos GM. Como descrito n...

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Divulgações

Os autores não têm divulgações financeiras relevantes.

Agradecimentos

Queremos agradecer hitomi Sawada e Elizabeth Garcia pelo cuidado com os animais. Este trabalho foi apoiado por KAKENHI (15K20134, 17K11222, 16H06276 e 16K01946) e Hokugin Research Grant (para H.N.), e Jichi Medical University Young Investigator Award (para H.U.). A Fundação de Bolsas Otsuka Toshimi apoiou o M.D.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,25 M SacaroseARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japão)SACAROSE
1 M DMSOARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japão)1M DMSO
ButorphanolMeiji Seika Pharma Co., Ltd. (Tóquio, Japão)Vetorphale 5mg
Proteína Cas9: Alt-R® S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLSIntegrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)1081060
Camundongos C57BL/6JJapan SLC (Hamamatsu, Japão)N/A
DAP213ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japão)DAP213
FBSSigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO)ES-009-C
hCGMOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD (Tóquio, Japão)HCG Mochida 3000
HTFARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japão)HTF
Camundongos ICRJapan SLC (Hamamatsu, Japão)N/A
IsofluranoPetterson Vet Supply, Inc. (Greeley, CO)07-893-1389
KSOMARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japão)KSOM
LN2 TankChart Industries (Ball Ground, GA)XC 34/18
M2ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japão)M2
MedetomidinaNippon Zenyaku Kogyo Co.,Ltd. (Koriyama, Japão)1124401A1060
MicroscópioNikon Co. (Tóquio, Japão)SMZ745T
MidazolamSandoz K.K. (Tóquio, Japão)1124401A1060
Tampão livre de nucleaseIntegrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)1072570
Kitde extração de DNA NucleospinTakara Bio Inc (Kusatsu, Japão)740952 .5
Vidro deslizante de um furoMatsunami Glass Ind., Ltd. (Kishiwada, Japão)S339929
Eletroporador tipo uma etapaBEX Co., Ltd. (Tóquio, Japão)CUY21EDIT II
Parafina LíquidaNACALAI TESQUE Inc. (Kyoto, Japão)SP 26137-85
Eletrodo de placa de platinaBEX Co., Ltd. (Tóquio, Japão)LF501PT1-10, GE-101
PMSGASKA Animal Health Co., Ltd (Tóquio, Japão)SEROTROPIN 1000
Iodeto de povidonaProfessional Disposables International, Inc. (Orangeburg, NY)C12400
Meio essencial mínimo de soro reduzido: OptiMEM ISigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO)22600134
Eletroporador tipo duas etapasNepa Gene Co., Ltd. ( Ichikawa, Japão)NEPA21

Referências

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  8. Kaneko, T., Mashimo, T. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS ONE. 10 (11), 1-7 (2015).
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