Uso de embriões congelados para produção de ratos geneticamente modificados

Hirofumi Nishizono; Mohamed Darwish; Hideki Uosaki; Nanami Masuyama; Motoaki Seki; Hiroyuki Abe; Nozomu Yachie; Ryohei Yasuda

doi:10.3791/60808

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Artigo de método

Uso de embriões congelados para produção de ratos geneticamente modificados

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DOI:

10.3791/60808

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2 de abril de 2020

Hirofumi Nishizono^*¹^,²^,³ , Mohamed Darwish^*⁴^,⁵ , Hideki Uosaki⁶^,⁷ , Nanami Masuyama⁸^,⁹^,¹⁰ , Motoaki Seki⁸^,¹¹ , Hiroyuki Abe³ , Nozomu Yachie⁸^,⁹^,¹⁰^,¹²^,¹³ , Ryohei Yasuda¹

¹Max Planck Florida Institute for Neuroscience, ²Life Science Research Center, University of Toyama, ³Department of Biochemical Engineering, Graduate School of Science and Engineering, Yamagata University, ⁴Graduate School of Innovative Life Science, University of Toyama, ⁵Department of Biochemistry, Faculty of Pharmacy, Cairo University, ⁶Division of Regenerative Medicine, Center for Molecular Medicine, Jichi Medical University, ⁷Division of Stem Cell Research and Drug Development, Center for Development of Advanced Medical Technology, Jichi Medical University, ⁸Synthetic Biology Division, Research Center for Advanced Science and Technology, University of Tokyo, ⁹Institute for Advanced Biosciences, Keio University, ¹⁰Graduate School of Media and Governance, Keio University, ¹¹Department of Molecular Oncology, Graduate School of Medicine, Chiba University, ¹²Department of Biological Sciences, School of Science, University of Tokyo, ¹³College of Arts and Sciences, University of Tokyo

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um método modificado para criopreservação de embriões unicelulares, bem como um protocolo que acoplar o uso de embriões congelados e eletroporação para a geração eficiente de camundongos geneticamente modificados.

Resumo

O uso de camundongos geneticamente modificados (GM) tornou-se crucial para entender a função genética e decifrar os mecanismos subjacentes das doenças humanas. O sistema CRISPR/Cas9 permite que os pesquisadores modifiquem o genoma com eficiência, fidelidade e simplicidade sem precedentes. Aproveitando essa tecnologia, os pesquisadores estão buscando um protocolo rápido, eficiente e fácil para a geração de ratos GM. Aqui introduzimos um método aprimorado para criopreservação de embriões unicelulares que leva a uma maior taxa de desenvolvimento dos embriões congelados. Ao combiná-lo com condições de eletroporação otimizadas, este protocolo permite a geração de ratos nocaute e knock-in com alta eficiência e baixas taxas de mosaico em um curto espaço de tempo. Além disso, mostramos uma explicação passo a passo do nosso protocolo otimizado, abrangendo preparação de reagente CRISPR, fertilização in vitro, criopreservação e descongelamento de embriões unicelulares, eletroporização de reagentes CRISPR, geração de mouses e genotipagem dos fundadores. Usando este protocolo, os pesquisadores devem ser capazes de preparar ratos GM com facilidade, velocidade e eficiência incomparáveis.

Introdução

O sistema de repetições palindrômicas curtas interespaçadas regularmente interespaçadas (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) é um avanço científico que proporciona uma modificação direcionada sem precedentes no genoma¹. O sistema CRISPR/Cas9 é composto por proteína Cas9 e rna guia (gRNA) com dois componentes moleculares: um RNA CRISPR específico para alvo (crRNA) e um RNA CRISPR transativador (tracrNA)² . Um gRNA direciona a proteína Cas9 para o lócus específico no genoma, 20 nucleotídeos complementares ao crRNA, e adjacentes ao protoespaço adjacente (PAM). A proteína Cas9 liga-se à seqüência de destino e induz qu....