Preparando proteínas que produzem células sintéticas usando extratos bacterianos livres de células, liposomos e transferência de emulsão

Resumo

Este protocolo descreve o método, materiais, equipamentos e etapas para a preparação de baixo para cima de RNA e proteína susceptíveis de produzir células sintéticas. O compartimento aquoso interno das células sintéticas continha o lisato bacteriano S30 encapsulado dentro de uma bicamada lipídica (ou seja, lipossomos estáveis), utilizando um método de transferência de emulsão de água no óleo.

Resumo

A abordagem de montagem de baixo para cima para a construção de células sintéticas é uma ferramenta eficaz para isolar e investigar processos celulares em um ambiente de imitação celular. Além disso, o desenvolvimento de sistemas de expressão livre de células demonstrou a capacidade de reconstituir os processos de produção, transcrição e tradução de proteínas (DNA→RNA→protein) de forma controlada, aproveitando a biologia sintética. Aqui descrevemos um protocolo para preparar um sistema de expressão livre de células, incluindo a produção de um potente lisato bacteriano e encapsulamento deste lisato dentro de vesículas unilamelares gigantes (GUVs) ricas em colesterol( ou seja, lipossomos estáveis), para formar células sintéticas. O protocolo descreve os métodos para a preparação dos componentes das células sintéticas, incluindo a produção de lisatos bacterianos ativos, seguido de uma preparação detalhada passo a passo das células sintéticas com base em um método de transferência de emulsão de água em óleo. Estes facilitam a produção de milhões de células sintéticas de forma simples e acessível, com alta versatilidade para a produção de diferentes tipos de proteínas. As células sintéticas obtidas podem ser utilizadas para investigar a produção e a atividade de proteína/RNA em um ambiente isolado, em evolução direcionada, e também como uma plataforma controlada de entrega de medicamentos para produção sob demanda de proteínas terapêuticas dentro do corpo.

Introdução

As células sintéticas são partículas artificiais semelhantes a células, imitando uma ou múltiplas funções de uma célula viva, como a capacidade de se dividir, formar interações de membrana e sintetizar proteínas com base em um código genético^1,2,3. Células sintéticas que encerram sistemas de síntese proteica livre de células (CFPS) possuem alta modularidade devido à sua capacidade de produzir várias proteínas e seqüências de RNA após alterações no modelo de DNA. Apresentando uma alternativa atraente às abordagens atuais da produção de proteínas, os sistemas CFPS baseiam-se em....

Protocolo

NOTA: A ilustração do protocolo completo de produção das células sintéticas é apresentada na Figura 1. De acordo com as necessidades do usuário, a expressão proteica (seção 3.2) e a formação de células sintéticas (seção 4) do protocolo também podem ser realizadas independentemente (com algumas adaptações).

1. Preparação do lysate S30-T7

1. Placa de raia a bactéria E. coli BL21(DE3) transformada com a polimerase T7 RNA expressando pAR1219 plasmídeo em uma placa LB-ágar suplementada com ampicillina de 50 μg/mL para obter colônias únicas.
2. Prepare uma solução de partida: Inocule uma única ....

Resultados

Apresentamos um protocolo para a preparação de células sintéticas encapsulando um sistema CFPS S30-T7 baseado em BL21 E. coli dentro de vesículas lipídicas. Uma descrição esquemmática do processo de preparação que inclui uma imagem de cada etapa é apresentada na Figura 2. O sucesso do processo de preparação de células sintéticas depende do desempenho adequado de cada etapa e efetuado por diferentes parâmetros. O protocolo deve ser ajustado para acomodar a produção de uma proteína es.......

Discussão

Este protocolo introduz um método simples e acessível para a produção de grandes quantidades de células sintéticas produtoras de proteínas. O rendimento das células ativas depende da execução cuidadosa e precisa do protocolo com ênfase em várias etapas críticas. Na seção de preparação de lisato deste método, é essencial alcançar a densidade de bactérias apropriada antes da lse celular para alcançar uma quantidade suficiente de proteínas no lisato bacteriano. Em segundo lugar, o processo de lyse deve ser realizado a 4 °C .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
A. Reagentes necessários para a etapa 1 (preparação do lisado S30-T7)
E.coli BL21 (DE3)	NEB	C2527	E.coli BL21 (DE3).
pAR1219	Sigma	T2076	TargeTron vetor para transformação.
Solução estoque de 50 mg / mL de ampicilina	Sigma	A9518	Armazenado a -20 ° C.
10 g/L de bacto-triptona	BD Bioscience	211705	Para preparação de placa de ágar Luria Bertani (LB) (1,5%).
10 g/L de cloreto de sódio (NaCl)	Bio-Lab	19030591
5 g/L de extrato de levedura de bacto	BD Bioscience	212750
15 g/L Ágar-ágar purificado	Merck	1.01614.5007
50 µ g/mL Ampicilina	Sigma	A9518
10 g/L Bacto-triptona	BD Bioscience	211705	Para preparação de meio Luria Bertani (LB) (20 mL).
10 g/L de cloreto de sódio (NaCl)	Bio-Lab	19030591
5 g/L de extrato de levedura de bacto	BD Bioscience	212750
50 µ g/mL Ampicilina	Sigma	A9518
12 g/L Bacto-triptona	BD Bioscience	211705	Para preparação de meios de caldo fantástico (TB) (1 L).
24 g/L de extrato de Bacto-Levedura	BD Bioscience	212750
4% (v/v) Glicerol anidro	Bio-Lab	7120501
2.32 g/L K2HPO4	Spectrum químico	P1383
12.54 g/L KH2PO4	Spectrum químico	P1380
50 µ g/mL de Ampicilina	Sigma	A9518
Solução-mãe de 100 mM de Isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG)	INALCO	INA-1758-1400	Filtrado usando 0.2 µ m filtro de seringa hidrofílico PVDF.
Solução-mãe de ditiotreitol (TDT) 0,1 M	TCI	D1071	Filtrado usando 0.2 µ m filtro de seringa hidrofílico PVDF.
10 mM Tris-acetato em pH = 7,4	Sigma	T1503	Tampão lisado S30 (1,5 L)
14 mM acetato de magnésio	Merck	1,05819,0250
60 mM acetato de potássio	Carlo Erba	470147
1 mM DTT	TCI	D1071
0,5 mL/L 2-mercaptoetanol	Sigma	M6250
Equipamento necessário para a etapa 1
100 mL frascos Erlenmeyer esterilizados	Thermo Scientific	50-154-2846	2 frascos
2 L frascos Erlenmeyer esterilizados com defletores	KIMAX-KIMBLE	25630	2 frascos
Agitador de piso	MRC	TOU-120-2	Incubadora agitadora de laboratório 450x450mm, 400rpm, 70 ° C
Centrifuge	Thermo Scientific	75004270	(75003340) - Fiberlite F10-6 x 100 LEX Rotor de ângulo fixo. Deve permitir pelo menos 13.000 x g.        * Pré-resfriado a 4 °C.
Homogeneizador de alta pressão	AVESTIN	EmulsiFlex-C3	Pré-resfriado a 4 °C.
-80oC freezer	SO-LOW	U85-18
Tubos de plástico esterilizados de 1,5 mL	Eppendorf	30120086	De preferência pré-resfriado a -20 °C.
Espectrofotômetro	TECAN	IN-MNANO	Infinite M200 pro
Placa transparente de 96 poços	Thermo Scientific	167008
Cilindro graduado esterilizado	Corning
Tubos de centrífuga esterilizados	Eppendorf	30120086	De preferência pré-resfriado a -20 °C.
Ponteiras de pipeta esterilizadas	Corning		De preferência pré-resfriado a -20 °C.
Balde de gelo picado	Bel-Art	M18848-4001
Tanque pequeno de nitrogênio líquido	NALGENE	4150-4000
B. Reagentes necessários para a etapa 3 (lipídios na preparação da solução oleosa):
1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC)	Lipoid	556400	Colesterol em pó
	Sigma	C8667
Clorofórmio	Bio-Lab	3082301
Óleo mineral	Sigma	M5904	Óleo leve
Equipamento necessário para a etapa 2< / forte>
Misturador de vórtice	Indústrias científicas	SI-0256
Bloco de aquecimento	TECHNE	FDB03AD	Pré-aquecido a 80 °C. Deve permitir temperatura controlada.
Frascos de vidro com gargalo de rosca de 2 mL	CSI Analytical Innovations	VT009M-1232	Para uma escala maior, use falcões de 50 mL e evapore o clorofórmio usando o evaporador rotativo.
Tampa de Rosca de 9mm	CSI Analytical Innovations	C395R-09LC
strong>C. Reagentes necessários para a etapa 3 (misturas de reação interna e de alimentação):
HEPES	Spectrum	H1089	1 M HEPES-KOH (pH = 8) - tampão de pH
Hidróxido de potássio (KOH)	Frutarom	55290
1 M Acetato de magnésio	Merck	1.05819.0250	Cofator e estabilizador de carga negativa.
1 M Acetato de potássio	Carlo Erba	470147	Estabilizador de carga negativa.
5.2 M Acetato de amônio	Merck	1.01116.1000	Estabiliza a carga negativa.
50% (p/v) Polietilenoglicol 6000 (PEG)	Merck	8.07491.1000	Aumenta a concentração das macromoléculas.
0,5 M 3-fosfoglicerato (3-PGA)	Sigma	P8877	Fonte de energia secundária.
Mistura de aminoácidos 50 mM I	Sigma	LAA21-1KT	Aditivo de aminoácidos. Contém: 50 mM de cada um dos seguintes 17  aminoácidos naturais - alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, prolina, serina, treonina e valina.
50 mM Mistura de aminoácidos II	Sigma	LAA21-1KT	Aditivo de aminoácidos. Contém: 50 mM de cada um dos 3 aminoácidos naturais a seguir - triptofano, fenilalanina e tirosina.
100 mM Trifosfato de adenina (ATP)	Sigma	A3377	Nucleotídeos e fonte de energia.
50 mM Trifosfato de guanidina (GTP)	Sigma	G8877	Nucleotídeos e fonte de energia.
100 mM Trifosfato de uridina (UTP)	ACROS ORGANICS	226310010	Aditivo de nucleotídeos.
100 mM Isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG)	INALCO	INA-1758-1400	Indução da expressão de genes.
2 M Sacarose	J.T. Baker	1933078	Gerando um gradiente de densidade.
2 M Glicose	Sigma	16301	Gerando um gradiente de densidade.
H2O Água UltraPura (UPW)	Bio-Lab	2321777500	DNase & Lisado
S30-T7	_	_	Preparado na etapa 1.                                                                                                                                              Fonte de transcrição e componentes de tradução. Armazenar em -80 ° c, descongele no gelo acidentado logo antes do uso.
Estoque de plasmídeo de DNA de escolha	_	_	Contém a sequência para a proteína solicitada. Sob promotor T7
D. Equipamento necessário para a etapa 4 (preparação de células sintéticas)
Agitador de incubadora de piso ou Thermomixer	MRC	TOU-120-2	Incubadora agitadora de laboratório 450x450mm, 400rpm, 70 ° C
PHMT Grant Bio	Thermomixer		PSC18
	Thermo Scientific	75004270	(75003629) - TX-400 4 x 400mL Rotor de Balde Oscilante. Adequado para tubos de 15 mL. Preferencialmente baldes oscilantes. Deve permitir pelo menos 1000 x g. Pré-resfriado a 4 °C.
Centrífuga de mesa	Thermo Scientific	75002420	(75003424) - rotor de 24 x 1,5/2,0mL com ClickSeal. Adequado para frascos Eppendorf. Pré-resfriado a 4 °C.
Misturador de vórtice	Scientific industries	SI-0256
Balde de gelo picado	Bel-Art	M18848-4001
Frascos de vidro com gargalo de rosca de 2 mL	CSI Analytical Innovations	VT009M-1232
Tubos de plástico estéreis de 15 mL	Thermo Scientific	339651
Tubos de plástico esterilizados de 1,5 mL	Eppendorf	30120086
Ponteiras de pipeta esterilizadas	Corning		Esterilizado por autoclave.

em pó < livre de RNaseCentrífuga