Produção microfluida de liposomos sensíveis à temperatura contendo lisolipóides

Summary

O protocolo apresenta os parâmetros otimizados para a preparação de liposomos termosensíveis usando o dispositivo microfluido de microfluidos de micromixer herringbone escalonado. Isso também permite o coencapsulamento de doxorubicina e verde indocianina nos liposomos e a liberação fototérmica de doxorubicina para liberação controlada/desencadeada de drogas.

Abstract

O protocolo apresentado permite uma preparação contínua de alto desempenho de liposomos sensíveis à baixa temperatura (LTSLs), capazes de carregar drogas quimioterapêuticas, como a doxorubicina (DOX). Para isso, uma mistura lipídica imócida e uma solução de sulfato de amônio são injetadas em um microfluido microfluido de micromisturador de arenque escalonado (SHM). As soluções são rapidamente misturadas pelo SHM, fornecendo um ambiente solvente homogêneo para a auto-montagem dos liposomos. Os liposós coletados são primeiro amassados, depois marcados para remover o etanol residual. Um fato de amônio pH-gradiente é estabelecido através da troca tampão da solução externa usando cromatografia de exclusão de tamanho. O DOX é então carregado remotamente nos liposomos com alta eficiência de encapsulamento (> 80%). Os liposós obtidos são homogêneos em tamanho com diâmetro médio Z de 100 nm. Eles são capazes de liberação de explosão desencadeada pela temperatura do DOX encapsulado na presença de hipertermia leve (42 °C). O verde indocianina (ICG) também pode ser co-carregado nos liposomos para liberação DOX quase infravermelha. A abordagem microfluida garante uma preparação de alto nível, reprodutível e escalável das LTSLs.

Introduction

A formulação ltsl é um produto lipossômico clinicamente relevante que foi desenvolvido para fornecer a droga quimioterapêutica doxorubicina (DOX) e permite uma liberação eficiente de medicamentos estourados em hipertermia leve clinicamente alcançável (T ◗ 41 °C)¹. A formulação LTSL consiste em 1,2-dipalmitoyl-sn-glicero-3-fosphocholine (DPPC), o lisolipide 1-stearoyl-2-hidroxi-sn -glicero-3-fosfatidylcholine (MSPC; M significa "mono") e lipídio PEGylated 1,2-distearoyl-sn -glicero-3-phosphoetanolamina-N-[methoxy(polietileno glicol)-2000] (DSPE-PEG₂₀₀₀). Ao atingir a temperatura de transição de fase (T_m ◗ 41 °C), o lisolipide e o DSPE-PEG₂₀₀₀ juntos facilitam a formação de poros de membrana, resultando em uma liberação estourada da droga². A preparação das LTSLs usa principalmente uma abordagem de cima para baixo em massa, ou seja, hidratação de filme lipídico e extrusão. Continua sendo desafiador preparar reprodutivelmente grandes lotes com propriedades idênticas e em quantidades suficientes para aplicações clínicas³.

Microfluidoé uma técnica emergente para preparar liposomos, oferecendo tamanho de nanopartículas não capazes, reprodutibilidade e escalabilidade³. Uma vez otimizados os parâmetros de fabricação, o throughput poderá ser ampliado pela paralefila, com propriedades idênticas às preparadas na escala de banco^3,4,5. Uma grande vantagem dos microfluidos em relação às técnicas convencionais de granel é a capacidade de lidar com pequenos volumes líquidos com alta controladorabilidade no espaço e no tempo através da miniaturização, permitindo uma otimização mais rápida, enquanto opera de forma contínua e automatizada⁶. A produção de liposós com dispositivos microfluidos é alcançada por uma abordagem de nanoprecipitação inferior, que é mais tempo e eficiência energética porque processos de homogeneização como extrusão e sonsonação são desnecessários⁷. Normalmente, uma solução orgânica (por exemplo, etanol) de lipídios (e carga hidrofóbica) é misturada com um não solvente insustentável (por exemplo, água e carga hidrofilônica). À medida que o solvente orgânico se mistura com o não solvente, a solubilidade para os lipídios é reduzida. A concentração lipídica eventualmente atinge uma concentração crítica na qual o processo de precipitação é acionado⁷. Nanoprecipitados de lipídios eventualmente crescem em tamanho e se fecham em um liposós. Os principais fatores que regem o tamanho e a homogeneidade dos liposomos são a razão entre o não solvente e o solvente (ou seja, relação de fluxo aquoso-orgânico; FRR) e a homogeneidade do ambiente solvente durante a automontagem dos lipídios em liposomos⁸.

A mistura eficiente de fluidos em microfluidos é, portanto, essencial para a preparação de liposomos homogêneos, e vários designs de misturadores foram empregados em diferentes aplicações⁹. O micromixer de arenque escalonado (SHM) representa uma das novas gerações de misturadores passivos, o que permite um alto rendimento (na faixa de mL/min) com um fator de diluição baixa. Isso é superior aos dispositivos tradicionais de mistura hidrodinâmica microfluida^8,10. O SHM tem ranhuras de arenque padronizadas, que rapidamente misturam fluidos por advection caótico^9,11. A pequena escala de tempo de mistura de SHM (< 5 ms, menos do que a escala típica de tempo de agregação de 10-100 ms) permite que a auto-montagem lipídica ocorra em um ambiente solvente homogêneo, produzindo nanopartículas com distribuição uniforme de tamanho^3,12.

A preparação de LTSLs com microfluidos não é, no entanto, tão simples em relação às formulações liposômicas convencionais devido à falta de colesterol⁸, sem as quais as bicamadas lipídicas são suscetíveis à interdigitação induzida pelo etanol^13,14,15. Até agora, o efeito do etanol residual apresenta durante a produção microfluida de liposomos não foi bem compreendido. A maioria das formulações relatadas são inerentemente resistentes à interdigitação (contendo colesterol ou lipídios insaturados)¹⁶, que ao contrário das LTSLs são saturadas e sem colesterol.

O protocolo aqui apresentado usa o SHM para preparar LTSLs para a entrega de medicamentos de liberação desencadeada pela temperatura. No método apresentado, garantimos que os LTSLs preparados microfluidos são nano-size (100 nm) e uniforme (dispersidade < 0,2) por dispersão dinâmica de luz (DLS). Além disso, encapsulamos o DOX usando o método de gradiente de sulfato de amônio transmembrana (também conhecido como carregamento remoto)¹⁷ como uma validação da integridade do bicamada lipídico LTSL. O carregamento remoto do DOX requer o liposome para manter um gradiente pH para alcançar alta eficiência de encapsulamento (EE), o que é improvável que aconteça sem um bicamada lipídico intacto. Neste método apresentado, distinto a partir de protocolos típicos de preparação liposófica microfluida, é necessário um passo de annealing antes que o etanol seja removido para habilitar a capacidade de carregamento remoto; ou seja, para restaurar a integridade do bicamada lipídico.

Como mencionado anteriormente, cargas hidrofoficas e hidrofóbicas também podem ser introduzidas às soluções iniciais para o encapsulamento simultâneo de cargas durante a formação de LTSLs. Como prova de conceito, o verde indocianina (ICG), um corante fluorescente quase infravermelho aprovado pela FDA, que também é um agente fototérmico promissor, é introduzido na mistura lipídica inicial e co-carregado com sucesso nas LTSLs. Um laser de 808 nm é usado para irradiar as LTSLs carregadas do DOX/ICG e induzir com sucesso a liberação de explosão fototérmica desencadeada pelo aquecimento do DOX dentro de 5 minutos.

Todos os instrumentos e materiais estão disponíveis comercialmente, prontos para uso e sem a necessidade de personalização. Uma vez que todos os parâmetros para formulação de LTSLs foram otimizados, seguindo este protocolo, pesquisadores sem conhecimento prévio de microfluidos também poderiam preparar as LTSLs, que servem como base de um sistema de entrega de drogas termosensíveis.

Protocol

1. Configuração de equipamento

1. Monte as bombas de seringa e shm da seguinte forma.
   1. Conecte a porta "To Computer" da bomba de seringa secundária (Bomba 02, para solução aquosa) à porta "To Network" da bomba de seringa mestre (Bomba 01, para solução lipídica de etanol) usando o cabo da rede Pump to Pump(Figura 1,amarelo).
   2. Conecte a porta "To Computer" da bomba master à porta "RS232 Serial" do computador usando PC para bombear cabo de rede(Figura 1,azul).
   3. Conecte o tubo a cada uma das inletas e tomadas do SHM usando uma porca e uma regra ferrule. Converta o terminal da tubulação para ambas as inletas para luer fêmea usando outra porca e ferrule e uma assembleia sindical. Tubos mais longos das entradas permitem fácil apego às seringas(Figura 2).
2. Configure o software de controle da bomba.
   1. Atribua o endereço da bomba de seringa mestre e da bomba de seringa secundária para "Ad:01" e "Ad:02", respectivamente, usando o botão "Configuração" da bomba de seringa. Isso só precisa ser feito pela primeira vez.
   2. Abra o software de controle da bomba no computador. As duas bombas de seringa devem ser detectadas automaticamente, seguidas por um som de bipe. Caso contrário, clique em Pumps e Procure bombas para atualizar a conexão. (Figura 3).
   3. Atribuir diâmetro a 12,45 (mm) escolhendo "HSW Norm-Ject 5 cc (Dia=12,45)".
   4. Taxa de atribuição para 0,25 mL/min para bomba 01 (solução lipídica de etanol) e 0,75 mL/min para bomba 02 (solução aquosa). As taxas de fluxo correspondem a uma taxa de fluxo total (TFR) de 1 mL/min e razão de vazão aquosa-etanol (FRR) de 3.
   5. Atribuir volume a quaisquer valores acima de 5 mL.
      NOTA: O volume de infusão direcionado é definido maior do que o volume líquido carregado considerando o volume vazio da tubulação.
   6. Selecione o modo INF (infusão) para ambas as bombas.
   7. Pressione set para confirmar as configurações.

2. Prepare as LTSLs

1. Prepare uma mistura lipídica LTSL10 ou LTSL10-ICG (ver Tabela 1).
2. Retire 1 mL de mistura lipídica e pelo menos 3 mL de (NH₄)₂Solução SO₄ usando duas seringas de bloqueio Luer de 5 mL.
3. Instale as duas seringas nas bombas de seringa na posição vertical deslizando a flange do barril da seringa para o retentor de seringa da bomba, e a flange deêmo da seringa até o bloco de empurra dor da bomba(Figura 4).
4. Enrole a extremidade da fita de aquecimento para a seringa com a solução aquosa. Enrole a outra extremidade da fita de aquecimento e a sonda de temperatura do termostato ao redor da seringa com a solução lipídica. É útil praticar essa etapa com seringas vazias no local, a fim de facilitar o processo de montagem (Figura 5A).
5. Conecte as duas seringas aos adaptadores luer fêmeas das inletas correspondentes do SHM. Certifique-se de que as seringas contendo a mistura lipídica e (NH₄)₂Soluções SO₄ estão conectadas de dentro de etanol e inlet aquosa, respectivamente. Ajuste a posição do êmbolo para remover bolhas de ar das seringas(Figura 5B).
   NOTA: Certifique-se de que as seringas ainda estejam posicionadas com segurança sobre o retentor de seringa das bombas.
6. Aqueça as seringas acima de 51 °C usando a fita de aquecimento usando uma sessão de aquecimento de 10 s. Deixe o termostato atualizar a temperatura das seringas. Repita esta etapa nos seguintes passos para manter a temperatura durante a infusão.
   ATENÇÃO: Desligue a fita de aquecimento após 10 s para evitar o excesso de temperatura e deixe o termostato atualizar a temperatura real. A fita de aquecimento também deve ser tratada com cuidado à medida que sua temperatura sobe muito rapidamente. O aquecimento continuamente pode danificar o equipamento e as seringas, devido ao atraso de tempo do termostato para atualizar a temperatura medida.
7. Uma vez que a temperatura esteja acima de 51 °C, execute as bombas de seringa pressionando Run All no software de controle da bomba(Figura 3).
8. Certifique-se de que o fluxo de fluidos esteja livre de bolhas de ar e qualquer vazamento. Descarte o volume inicial (em torno de 0,5 mL) de líquido da tomada como resíduo.
   NOTA: Este volume inicial de resíduos não é definitivo e depende do volume interno da configuração, que é o volume para o fluido viajar das seringas através da tubulação e SHM para a tomada.
9. Colete o resto do líquido como amostras liposomeemem em um tubo de microcentrífuga ou frasco bijou.
10. Pausa/pare a infusão quando o líquido em qualquer uma das seringas está quase vazio.
    NOTA: As bombas devem ser paradas manualmente, uma vez que as bombas podem não detectar com precisão a posição quando as seringas estão vazias.
11. Coloque as soluções liposome coletadas em um banho de água de 60 °C para a narnea por 1,5 h.
    NOTA: Este passo é essencial para permitir o carregamento de drogas nos liposomos.
12. Transfira as soluções para tubos de diálise. Dilere as soluções contra 1 L de 240 mM (NH₄)₂SO₄ a 37 °C por pelo menos 4h para obter liposós purificados.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. Os liposós nesta etapa estão a 5 mM de fosfolipide. Liposomos purificados podem ser armazenados a 4 °C.
13. Para limpar o SHM para uso repetido, lave o SHM sequencialmente com água desionizada, etanol e seco com gás nitrogênio.

3. Carregamento remoto do DOX em LTSLs por gradiente pH transmembrana

1. Troque o buffer externo de LTSLs para soro fisiológico tampão hepes (HBS) usando cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) para estabelecer um gradiente pH transmembrana.
   1. Adicione um total de 25 mL de HBS ao topo de uma coluna da SEC para preparar a coluna. Deixe que todos os eluentes lutem pela coluna e descarte o eluate.
   2. Adicione 1 mL de liposós dialos, preparado a partir da etapa 2.12, à coluna e descarte a elute.
   3. Adicione 1,5 mL de HBS à coluna e descarte a elute.
   4. Adicione 3 mL de HBS à coluna e colete os 3 mL de elute.
      NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. Os liposós são coletados nesta etapa e estão a 1,67 mM de fosfolipida. Liposomos trocados por tampão podem ser armazenados a 4 °C.
2. Incubam LTSLs com doxorubicina (DOX) e purificam LTSLs.
   1. Adicione a solução DOX em 1:20 RELAÇÃO molar DOX-to-fosholipid em 1 mL de solução liposós (1,67 mmol) contida em um frasco bijou. Isso pode ser alcançado adicionando 48,4 μL de 1 mg/mL DAX (83,4 μmol).
   2. Coloque o frasco bijou em um banho de água de 37 °C por 1,5 h para permitir que o DOX carrege nos liposós.
   3. Misture 10 μL dos liposóis com 170 μL de HBS e 20 μL de 1% (v/v) Solução Triton X-100 em uma placa preta de 96 poços. Repita para três poços. Esses poços correspondem ao conteúdo DOX "antes da purificação".
   4. Em caso de preparação LTSL10-ICG, misture 40 μL dos liposóis com 160 μL de DMSO em uma placa clara de 96 poços. Repita para três poços. Esses poços correspondem ao conteúdo de ICG "antes da purificação".
   5. Purificar a solução liposome como descrito na etapa 3.1.
      NOTA: Para reutilizar a coluna para futura purificação, limpe a coluna do DOX livre adicionando primeiro 1 mL de solução NaOH diluída de 0,5 M antes de realizar a etapa 3.1.1. DoX livre em vermelho vai ficar violeta-azul e elute através da coluna rapidamente.
   6. Misture 30 μL da solução liposósia purificada com 150 μL de HBS e 20 μL de 1% (v/v) Solução Triton X-100 em uma placa preta de 96 poços. Repita para três poços. Esses poços correspondem ao conteúdo DOX "após a purificação".
   7. No caso do LTSL10-ICG, misture 40 μL da solução liposósia purificada com 160 μL de DMSO em uma placa clara de 96 poços. Repita para três poços. Esses poços correspondem ao conteúdo de ICG "após a purificação".
   8. Meça a intensidade de fluorescência do DOX dos poços antes (passo 3.2.3) e depois (passo 3.2.5) purificação, utilizando um leitor de microplaca (λ_ex = 485 nm, λ_em = 590 nm).
   9. Calcule a eficiência de encapsulamento do DOX (DOX EE) tomando a proporção das intensidades de fluorescência antes e depois da purificação.
      
   10. Meça a absorção de ICG dos poços antes e depois da purificação, utilizando um leitor de microplacas (600 a 1000 nm).
   11. Calcule a eficiência de encapsulamento do ICG (ICG EE) levando a proporção da absorção em 792 nm antes e depois da purificação, levando em conta o fator de diluição (3 vezes) durante a purificação.
       

4. Dispersão dinâmica de luz (DLS)

1. Adicione 50 μL de solução liposós (passo 2.12) a 450 μL de água desionizada.
2. Coloque o cuvette dentro do instrumento DLS e execute a medição de acordo com as instruções do fabricante.
3. Record the mean Z-average diameter and dispersity of three measurements for each sample.

5. Calorimetria de varredura diferencial (DSC)

1. Concentre 1 mL das amostras de liposós (etapa 2.12) com uma unidade de filtro centrífuga para 0,5 mL (concentração lipídica final de 10 mM). Usando um rotor de ângulo fixo, gire a 7500 x g por aproximadamente 15 min.
2. Transfira 20 μL de (NH₄₎₂Amostras de_solução E liposomos para duas respectivas panelas DSC. Sele as panelas com tampas herméticas DSC usando o kit de prensa de amostra DSC.
3. Meça a amostra de 30 °C a 60 °C a uma taxa de aquecimento de 1 °C/min utilizando um calómetro diferencial de varredura.
4. Analise os dados com software apropriado. Tome a temperatura de transição de fase (T_m)como o início da transição de fase (pico de derretimento), que é medido pela interceptação x da tangente do ponto de inclinação máxima.

6. Lançamento dodoxorubicina

1. Pré-aqueça o HBS a temperatura designada (37 ou 42 °C) usando um banho de água. Prepare um banho de água gelada para saciar as amostras.
2. Adicione 100 μL de liposós purificados carregados do DOX (passo 3.2.5) em 1,9 mL de HBS em um tubo de microcentrífuga. Coloque o tubo no banho de água da temperatura designada.
3. Retire imediatamente 200 μL de amostras do tubo e coloque-o rapidamente no banho de água gelada para saciar qualquer liberação subsequente de drogas. Esta amostra corresponde ao ponto de tempo inicial (t = 0).
4. Retire 200 μL de amostras nos pontos de ponto subsequentes (t = 5, 10, 15, 30, 60 min) e coloque-a rapidamente no banho de água gelada para saciar qualquer liberação de drogas.
5. Misture 50 μL de amostra de cada ponto de tempo com 150 μL de HBS em uma placa preta de 96 poços. Meça a intensidade de fluorescência do DOX usando um leitor de placa.
6. Adicione 20 μL de 1% (v/v) Triton X-100 em poços selecionados aleatórios preparados na etapa 6.5. Meça a intensidade de fluorescência DOX desses poços usando um leitor de placas. Esses valores correspondem ao ponto de tempo totalmente liberado (t = ¥; 100% de liberação).
7. Calcule e lote a porcentagem do DOX liberada interpolando a intensidade da fluorescência de cada ponto de tempo (I(t)), em comparação com o valor inicial (I(0),e totalmente liberado (I(⁄)), valor.
   

7. Aquecimento a laser e liberação acionada

1. Afina a temperatura do banho de água para 37 °C e deixe a temperatura estabilizar.
2. Adicione 200 μL de LTSL10-ICG carregado do DOX ([ICG] = 10 μg/mL) a uma placa clara de 96 poços, em seguida, coloque-o no banho de água, mantenha o fundo imerso na água.
3. Coloque a corrente do sistema laser para 2,27 A. Coloque o collimator do sistema laser a 5 cm verticalmente acima da superfície da placa de 96 poços, o que corresponde a um fluxo de energia de 0,5 W/cm² [Figura 6].
   ATENÇÃO: O sistema a laser deve ser operado em conformidade com as medidas relevantes de segurança a laser.
4. Ligue o laser e monitore a temperatura a cada minuto usando uma sonda de temperatura de fibra óptica.
5. Aos 5 e 10 min, retire 10 μL de liposós irradiados a laser da placa clara de 96 poços e misture com 190 μL de HBS para três poços em uma placa preta de 96 poços.
6. Misture 10 μL dos liposóis com 170 μL de HBS e 20 μL de 1% (v/v) Solução Triton X-100 para três poços em uma placa preta de 96 poços. Esses poços correspondem ao conteúdo DOX "100% lançado". Meça a intensidade fluorescente do DOX e calcule a liberação do DOX conforme descrito na etapa 6.7.

Results

A preparação de LTSLs por microfluidos requer a composição lipídica do DPPC/MSPC/DSPE-PEG₂₀₀₀ (80/10/10, relação molar; LTSL10). A Figura 7A (à esquerda) mostra o aparecimento do LTSL10 tão preparado a partir da etapa 2.9, como um líquido claro e não viscoso. A formulação LTSL10 é desenvolvida a partir da formulação convencional, LTSL4 (DPPC/MSPC/DSPE-PEG₂₀₀₀, 86/10/4, relação molar) uma vez que o LTSL4 forma uma amostra...

Discussion

O protocolo apresentado descreve a preparação de liposós sensíveis à temperatura baixa (LTSLs) usando um micromixer de arenque escalonado (SHM). A formulação LTSL10 permite a liberação de rajadas desencadeadas pela temperatura da doxorubicina dentro de 5 minutos a uma temperatura hipertermrmica clinicamente atingível de 42 °C. O verde indocianina (ICG) também pode ser co-carregado para aquecimento fototérmico desencadeado pela liberação do DOX. O método se baseia em: (i) auto-montagem de fosfolipidas em liposós um ambien...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC)	Lipoid	PC 16:0/16:0 (DPPC)
1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenoglicol)-2000] (DSPE-PEG2000)	Lipoid	PE 18:0/18:0-PEG 2000 (MPEG 2000-DSPE)
1-estearoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina (MSPC)	Avanti Polar Lipid	855775P-500MG	Distribuído pela Sigma-Adrich; também conhecido como Lyso 16:0 PC (não deve ser confundido com 14:0/18:0 PC, que também é denominado MSPC)
4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES)	Sigma-Aldrich	H3375-100G
Adaptadores, Luer Lock fêmea para 1/4"-28UNF	IDEX Health & Ciência	P-624	Requer 2 unidades. Para as entradas
Adaptadores, Montagem de União, 1/4"-28UNF	IDEX Health & Ciência	P-630	Requer 2 unidades. (Uma unidade incluiu 2 porcas e 2 ponteiras)
Sulfato de amônio ((NH4)2SO4)	Sigma-Aldrich	31119-1KG-M
Frasco de bijuteria	VWR	216-0980	7 mL, frasco de poliestireno transparente
Unidade de filtro centrífugo	Sigma-Aldrich	UFC801008	10 kDa MWCO, Unidade de filtro centrífugo Amicon Ultra-4
Centrífuga	ThermoFisher Scientific	Heraeus Megafuge 8R	com rotor
de ângulo fixo HIGHConic IIICubeta	Fisher Scientific	11602609	Cubeta de poliestireno descartável, de baixo volume, para medição DLS
Kit de diálise - Pur-A-Lyzer Maxi	Sigma-Aldrich	PURX12015-1KT	12-14 kDa MWCO
Dimetil Sulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich	34943-1L-M
DLS Instrumento	Malvern Panalytical	Zetasizer Nano ZS90
Cloridrato de doxorrubicina (DOX)	Apollo Scientific	BID0120
DSC	Instrument TA Instruments	TA Q200 DSC
DSC Tzero Tampas Herméticas	TA Instruments	901684.901	Para medição DSC
DSC Tzero Pans	TA Instruments	901683.901	Para medição
DSC DSC Tzero Sample Press Kit	TA Instruments	901600.901	Para medição
Etanol	VWR	20821.330	Absoluto, ≥ 99,8%
FC-808 Sistema de Laser Acoplado	a Fibra CNI Optoelectronics Tech	FC-808-8W-181315	FOC-01-B Colimador de Fibra incluído.
Virola, 1/4 "-28UNF a 1/16" OD	IDEX Saúde e Ciência	P-200	Para a saída
Sonda de Temperatura de Fibra Óptica	Osensa	PRB-G40
Micromixer de Espinha de Peixe Escalonada de Vidro (SHM)	Darwin Microfluidics	Misturador de Espinha de Peixe - Fita
	Omega	DHT052020LD	Pode ser substituído por outro aquecedor de seringa, como "HTC" ou "série SRT" para aquecimento mais lento. Fiação manual para um plugue de 3 pinos necessária para modelos de 240V
Indocianina Verde	Adooq	A10473-100	Distribuído pela Bioquote Limited (Reino Unido)
Seringa Luer-lock, 5 mL	VWR	613-2043	Seringas de 3 peças Hanke Sass Wolf SOFT-JECT, O.D. Leitor de microplacas de 12,45 mm
	BMG Labtech	FLUOstar Omega	Instalado com filtros de 485 nm (exictação) e 590 nm (emissão)
Microplaca, 96 poços, Preto, Fundo plano	ThermoFisher Scientific	611F96BK	Para medição de fluorescência em leitor de microplacas
Microplaca, 96 poços, Clara, 655101 Grenier da Planície-parte inferior			para a porca do leitor do microplate da medida da absorbância
, 1/4" - 28UNF a 1/16" saúde de OD	IDEX & Science	P-245	Para a tomada
PC para Bomba Cabo de Rede para Aladdin, 7ft	World Precision Instruments	NE-PC7	Opcional: As bombas de seringa podem ser operadas manualmente
Software de controle de bomba - SyringePumpPro Software License para 2	World Precision Instruments	SYRINGE-PUMP-PRO-02	Opcional: As bombas de seringa podem ser operadas manualmente
Cabo de Rede de Bomba para Bomba para Aladdin, 7 pés	World Precision Instruments	NE-NET7	Opcional: As bombas de seringa podem ser operadas manualmente
Coluna de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC)	Resina GE Life Science	17085101	Sephadex G-25 em colunas de dessalinização PD-10
Cloreto de sódio (NaCl)	Sigma-Aldrich	31434-1KG-M
Hidróxido de sódio (NaOH)	Sigma-Aldrich	S5881-500G
Bombas de seringa e Cabo (DUAL-PUMP-NE-1000)	Precision Instruments	ALADDIN2-220/AL1000-220
	Inkbird	ITC-308	Pode ser substituído por outro kit de aquecedor de seringa/termostato
Tubulação Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-100ML
, ETFE (1/16" OD)	IDEX Health & Ciência	1516
USB para RS-232 Conversor	World Precision Instruments	CBL-USB-232	Opcional: Para computador sem porta RS-232
Banho-maria	Grant Instruments Ltd.	JB Nova 12